Inhaltsverzeichnis

1.Einleitung   

1.1.  Transport aus dem ER durch den Golgi-Apparat  1

1.2.  Der Transport vom trans-Golgi-Netz zu Lysosomen  2

1.3.  Transport von der Plasmamembran über Endosomen: Endozytose  3

1.4.  Der Transport vom trans-Golgi-Netz zur Zelloberfläche: Exozytose  5

1.5.  Die molekularen Mechanismen des Vesikeltransports  6

2.  Material und Methoden  

2.1  Aussäen von Zellen auf Deckgläser  8

2.2  Transfektion von HeLaSS6-Zellen  9

2.2.1  Transfektion mit Calcium-Phosphat  9

2.2.2  Transfektion mit Lipofectamin  10

2.3  Standard-Immunfluoreszenz  10

2.4  Transmissionselektronenmikroskopie  11

2.4.1  Pt/C-Repilikation  12

2.4.2  Negativkontrastierung  13

2.5  Rasterelektronenmikroskopie  13

3.  Ergebnisse  

3.1  Transfektion von HeLaSS6-Zellen  15

3.2  Standard Immunfluoreszenzfärbung  16

3.3  Transmissionselektronenmikroskopie  17

3.4  Rasterelektronenmikroskopie  18

4.  Diskussion  

4.1  Transfektion von HeLaSS6-Zellen und  19

Standard  Immunfluoreszenzfärbung  

1 Moderne mikroskopische Methoden in der Zellbiologie

1. Einleitung

1.1 Transport aus dem ER durch den Golgi-Apparat

Der Golgi-Apparat nimmt neu synthetisierte Proteine und Lipide aus dem ER auf und verteilt sie auf Plasmamembran, Lysosomen und sekretorische Vesikel. Er ist zudem Hauptsyntheseort für Kohlenhydrate. Der Golgi-Apparat liegt gewöhnlich in der Nähe des Zellkerns und bei tierischen Zellen ist er vom Centrosom nicht weit entfernt. Er besteht aus einer Ansammlung flacher, membranumhüllter Zisternen, von denen 4 bis 6 einen sogenannten Golgi-Stapel bilden. Jeder Golgi-Stapel hat zwei unterschiedliche Seiten: eine cis- oder Bildungsseite und eine trans- oder Reifungsseite. Beide Seiten sind an besondere Kompartimente angeschlossen, die aus untereinander verbundenen Röhren und Zisternen bestehen. Das ist zum einen das cis-Golgi-Netz und zum anderen das trans-Golgi-Netz, die beide zum Sortieren von Proteinen wichtig sind. Proteine, die ins cis-Netz gelangen, können weiter zum Golgi-Apparat ziehen oder ins ER zurückgebracht werden und solche, die aus dem trans-Netz austreten, werden aufgeteilt auf Lysosomen, sekretorische Vesikel oder die Zelloberfläche. Eine besondere Ausprägung findet der Golgi-Apparat in Zellen, die Sekretionsaufgaben erfüllen wie z.B. Antikörpersezernierende Plasmazellen. Vesikel, die für den Golgi-Apparat bestimmt sind, schnüren sich von den sogenannten Übergangselementen des ER ab, einem Bereich der keine Ribosomen enthält. Nur richtig gefaltete und komplett zusammengesetzte Proteine könne aus dem ER austreten, das eine Art Qualitätskontrollstation darstellt und die nicht ordentlichen Proteine verwirft und abbaut. Solche Proteine, die Bestandteil des ER sind, enthalten ein Rückhaltesignal (4 AS-Reste), das es ermöglicht, daß diese Proteine gezielt aus dem cis-Golgi-Netz per Vesikel zurückgeholt werden können. Dies zeigt, daß der Vesikeltransport von ER zu Golgi in beiden Richtungen stattfindet. Im Golgi-Apparat werden auch Oligosaccharidketten, die im ER an Proteine geheftet wurden, weiterverarbeitet. In Glykoproteinen in Säugetieren treten als N-gekoppelte Oligosaccharide vor allem komplexe Oligosaccharide und Mannosereiche Oligosaccharide auf. An letztere werden im Golgi-Apparat keine neuen Zuckerreste angeheftet. An die komplexen Oligosaccharide dagegen können mehr N-Acetylglucosamine und zusätzlich Galactose-, Sialinsäure- oder Fucosereste angeheftet werden. Zum einen werden die ursprünglichen aus dem ER angelieferten Oligosaccharide zurechtgeschnitten und außerdem um zusätzliche

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Zuckerreste ergänzt (die komplette Bearbeitung wird „processing“ genannt). Die Proteine wandern von einer Zisterne zur anderen und werden schrittweise modifiziert (vielstufige Verarbeitungseinheit : cis-Golgi-Netz cis-Kompartiment Mittelkompartiment trans- Kompartiment trans-Golgi-Netz). Der Proteintransport zwischen den Zisternen findet durch Transportvesikel statt. Jede Zisterne führt dabei spezifische Modifikationen aus. Des weiteren kommt es bei manchen Proteinen zur O-Glykosylierung, bei der Zuckereste an die OH-Gruppen von Serin- und Threonin-Seitenketten geheftet werden. Durchgeführt wird dies durch Glycosyltransferase-Enzyme. Proteoglykane entstehen durch Anfügen von Glykosyminglykan-Ketten an ihre Kernproteine. Außerdem werden Sulfatgruppen an Zucker der Proteoglykane oder Tyrosinreste von Proteinen geheftet. Viele Proteoglykane werden ausgeschieden und bilden Bestandteile der extrazellulären Matrix; andere bleiben in der Plasmamembran.

1.2 Der Transport vom trans-Golgi-Netz zu Lysosomen

Lysosomen sind Membransäckchen, die mit hydrolysierenden Enzymen für die kontrollierte intrazelluläre Verdauung von Makromolekülen angefüllt sind. Sie enthalten ca. 40 Arten hydrolysierender Enzyme (Proteasen, Nucleasen, Glykosidasen, Lipasen, Phospholipasen, Phosphatasen, Sulfatasen). Es handelt sich um saure Hydrolasen, die im Innern der Lysosomen bei einem pH von 5 arbeiten. Der saure pH wird durch eine H ⁺ -ATPase in der Lysosomenmembran aufrecht gehalten. Lysosomen haben in verschiedenen Zelltypen eine uneinheitliche Morphologie und erfüllen unterschiedliche Aufgaben wie den Abbau intra- und extrazellulärer Abfälle, die Verdauung phagozytosierter Mikroorganismen oder die Herstellung von Nährstoffen für die Zelle.

Verdauungsenzyme gelangen aus dem ER über den Golgi-Apparat zu den Lysosomen. Abzubauende Substanzen können auf drei verschiedene Möglichkeiten dort hingelangen :

1. Über Endozytose werden Moleküle aufgenommen und in sogenannte frühe Endosomen verpackt. Einige der Moleküle gelangen dann in späte Endosomen andere zur Plasmamembran zurück. In den späten Endosomen beginnt der hydrolytische Abbau und sie entwickeln sich zu reifen Lysosomen.

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2. Um überflüssige Bestandteile der Zelle zu beseitigen, dient der Vorgang Autophagie. Mitochondrien und andere Organellen werden von ER-Membranen umschlossen, die das sogenannte Autophagosom bilden, das mit einem Lysosom oder einem späten Endosom verschmilzt und daraufhin abgebaut wird.

3. Der dritte Weg findet nur in Zellen statt, die sich darauf spezialisiert haben, durch Phagozytose große Partikel und Mikroorganismen aufzunehmen (Makrophagen und Neutrophile). Durch Umschließen der Beute wird ein Phagosom gebildet, das wie ein Autophagosom in ein Lysosom umgewandelt wird.

Eine weitere Möglichkeit gewährleistet den direkten Transport einiger Cytosol-Proteine zu den Lysosomen durch eine Signalsequenz (KFERQ) auf der Proteinoberfläche. Die Hydrolasen der Lysosomen tragen Mannose-6-phosphat (M6P)-Gruppen, die an die Ngekoppelten Oligosaccharide dieser löslichen Enzyme im cis-Golgi-Netz binden. Die M6P-Gruppen werden von M6P-Rezeptorproteinen erkannt, die zu den Transmembranproteinen im trans-Golgi-Netz gehören. Diese Rezeptoren helfen bei der Verpackung dieser Hydrolasen in Transportvesikel (Clathrin-umhüllte Vesikel), die dann mit späten Endosomen verschmelzen. Somit hat eine Trennung von anderen Proteinen im trans-Golgi-Netz stattgefunden. Im späten Endosom dissoziieren die Lysosomen-Hydrolasen aufgrund des niedrigen pH von dem Rezeptorprotein ab und können mit dem Abbau beginnen. Die leeren Rezeptoren werden in ihr ursprüngliches Kompartiment zurückgebracht.

1.3 Transport von der Plasmamembran über Endosomen: Endozytose

Alle Wege von der Zelloberfläche zu den Lysosomen beginnen bei dem Endozytose genannten Vorgang, durch den sich Zellen Makromoleküle und andere Substanzen einverleiben. Das aufzunehmende Material wird immer weiter von einem Teil der Plasmamembran eingehüllt, der sich zunächst einstülpt und dann abschnürt, so daß eine intrazelluläre Vesikel entsteht. Es gibt zwei Typen der Endozytose: Durch Pinozytose werden Flüssigkeiten und gelöste Substanzen in kleine Vesikel aufgenommen (in allen Eukaryontenzellen). Durch Phagozytose gelangen umfangreiche Partikel, z.B. Mikroorganismen und Zelltrümmer über große Vesikel, die Phagosomen genannt werde, in die Zelle (in spezialisierten Zellen, s.o.).

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Die Endozytose beginnt in den Clathrin-coated Pits der Plasmamembran. Dabei handelt es sich um Einstülpungen der Membran, die mit Clathrin besetzt sind. Die daraus entstehenden Vesikel heißen Clathrin-coated vesicles. Diese sind sehr kurzlebig und verschmelzen schnell mit frühen Endosomen. Die Aufnahme spezifischer Makromoleküle aus der extrazellulären Flüssigkeit durch Clathrin-coated pits oder vesicles nennt man Rezeptor-vermittelte Endozytose. Makromoleküle binden an komplementäre Zelloberflächen-Rezeptoren, sammeln sich in coated-pits und gelangen als Rezeptor-Makromolekül-Komplexe in den Clathrin-bedeckten Vesikeln in die Zelle. Durch diese Form der Endozytose werden Makromoleküle selektiv angereichert. Ein Beispiel dafür ist die Aufnahme von Cholesterin in Säugetier-Zellen. Cholesterin wird in Form von Low-Density-Lipoprotein-Komplexen transportiert und durch einen entsprechenden Transmembran-Rezeptor aufgenommen.

Es werden nur solche Moleküle abgebaut, die nicht spezifisch aus den Endosomen wegtransportiert werden. Der Innenraum der Endosomen ist sauer (~ pH 6) uns man unterscheidet frühe und späte Endosomen. Die frühen Endosomen sind die wichtigsten Sortierstellen auf dem Endozytose-Transportweg. Je nach Typ des Rezeptors und den gebundenen Liganden kann folgendes passieren:

1. Die meisten Rezeptoren kehren zu derselben Plasmamembran-Domäne zurück, von der sie kamen

2. Einige gelangen in die Lysosomen und werden dort abgebaut

3. Manche begeben sich in eine andere Domäne der Plasmamembran und arbeiten bei der Transzytose mit. Darunter versteht man den Transport spezifischer Makromoleküle durch Oberflächenrezeptoren von einem extrazellulärem Raum zum nächsten. Das Makromolekül wird durch Exozytose an einem Ort der Plasmamembran vom Rezeptor freigelassen, der sich vom Ursprungsort unterscheidet.

Ein Beispiel für das Pendeln zwischen der extrazellulären Flüssigkeit und den Endosomen ist das Protein Transferrin, das Eisen im Blut transportiert. Es wird durch Rezeptorvermittelte Endozytose in frühe Endosomen gebracht, wo es das Eisen freisetzt. Als Apotransferrin an den Rezeptor gebunden wird es wieder zur extrazellulären Flüssigkeit gebracht und nimmt dort wegen des neutralen pH wieder Eisen auf, so daß Zyklus erneut beginnt.

5 Moderne mikroskopische Methoden in der Zellbiologie

Die Beziehung zwischen frühen und späten Endosomen ist noch nicht aufgeklärt.

1.4 Der Transport vom trans-Golgi-Netz zur Zelloberfläche : Exozytose

Transportvesikel verlassen das trans-Golgi-Netz und fusionieren mit der Plasmamembran. Dieser Prozeß wird als Exozytose bezeichnet. Die in den Transportvesikeln enthaltenen Membranproteine und -lipide sind Bausteine für die Plasmamembran, während die löslichen Proteine an die Zellumgebung abgegeben werden. Auf diese Weise werden Proteoglykane und Glykoproteine der extrazellulären Matrix sezerniert. Dabei handelt sich um den konstitutiven Ausscheidungsweg. Zellen, die sich auf die bei Bedarf schnelle Abgabe von Produkten (Hormone, Neurotransmitter, Verdauungsenzyme) spezialisiert haben, verfolgen den gesteuerten Ausscheidungsweg. Dabei werden die Substanzen in sekretorischen Vesikeln für die spätere Ausscheidung gespeichert.

Viele Proteine werden automatisch vom ER und vom Golgi-Apparat aus nicht-selektiv zur Zelloberfläche transportiert, wenn sie keine Sortiersignal besitzen oder anderweitig umgeleitet werden.

Sekretorische Vesikel schnüren sich unter Beteiligung von Clathrin vom trans-Golgi-Netz ab und geben ihre Inhaltsstoffe durch Exozytose an die Umgebung der Zelle ab. Damit die für diesen Vorgang bestimmten Proteine in die richtigen Vesikel verpackt werden, aggregieren bzw. kondensieren diese selektiv. Häufig werden die Proteine proteolytisch weiterverarbeitet, während sich die sekretorischen Vesikel bilden. Viele Proteine haben sogenannte Vorläuferformen oder Prä-Pro-Proteine, die in der Ursprungszelle negative Auswirkungen hätten und deshalb erst bei der Verpackung in Vesikel zum Transport aus der Zelle in ihre aktive Form überführt werden.

In der Nähe der Plasmamembran warten die sekretorischen Vesikel auf ein Signal zur Freigabe ihrer Inhaltsstoffe. Diese Signal ist häufig ein chemischer Botenstoff. Das kann z.B. ein Hormon sein, das eine Rezeptor auf der Oberfläche aktiviert, wodurch die Ca ²⁺ -Konz. im Cytosol ansteigt. Bei Nervenzellen wird die Erhöhung der intrazellulären Ca ²⁺ -Konz. durch ein Aktionspotential ausgelöst, was die Exozytose bewirkt.

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Bei Mastzellen ist die regulierte Exozytose eine lokale Antwort der Plasmamembran und des unter ihr liegenden Cytoplasmas.

Membranbestandteile aus sekretorischen Vesikeln werden nach der Verschmelzung mit der Plasmamembran zum trans-Golgi-Netz zurückbefördert und wiederverwendet. Die Verteilung der Membranbestandteile zwischen den Zellkompartimenten befindet sich in einem Fließgleichgewicht. Synaptische Vesikel gibt es nur in Nervenzellen, wo sie Neurotransmitter enthalten, und einigen anderen endokrinen Zellen. Sie entstehen aus Endosomen und sind für die regulierte Ausscheidung der Neurotransmitter verantwortlich. In Zellen mit polarer Struktur werden Proteine vom trans-Golgi-Netz zur richtigen Domäne der Plasmamembran dirigiert.

1.5 Die molekularen Mechanismen des Vesikeltransportes und die Aufrechterhaltung der Mannigfaltigkeit der Kompartimente

Die Unterschiede zwischen den von Membranen umgebenen Kompartimenten einer Zelle werden durch den Einsatz Freier Energie aufrechterhalten, der einen direkten selektiven Transport bestimmter Membranbestandteile von einem Kompartiment zum anderen antreibt. Die meisten Transportvesikel entstehen aus spezialisierten coated (bedeckten) Membranbereichen und schnüren sich als Coated Vesicles ab. Bevor sie mit ihrer Zielmembran verschmelzen, müssen sie Proteinbeschichtung abwerfen. Es gibt zwei gut bekannte Arten:

1. Clathrin-bedeckten Vesikel vermitteln den selektiven Transport von

Transmembranproteinen (z.B. M6P-Rezeptor aus dem trans-Golgi-Netz) und befördern lösliche Moleküle, die an die Rezeptoren gebunden sind oder sich im Vesikel-Lumen befinden. Der Aufbau einer Clathrin-Hülle treibt die Knospenbildung an. Die Bildung einer Clathrin-bedeckten Knospe wird durch die Kräfte angetrieben, die beim Zusammensetzen der Hüllproteine auf der dem Cytosol zugewandten Seite der Membran entstehen. Clathrin besteht aus drei großen und drei kleinen Polypeptidketten, die zusammen eine dreibeinige Struktur, das Triskelion, bilden ( Abb.3 ). Diese Clathrin-Triskelions lagern sich zu einem käfigähnlichen, konvexen Netz aus Fünf- und Sechsecken zusammen ( Abb. 3 ), die auf der Membranoberfläche coated pits bilden. Das zweitwichtigste Hüllprotein in diesen Vesikeln ist das Adaptin. Es wird benötigt, um den Clathrin-Belag an die Membran zu binden und

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Transmembran-Rezeptorproteine zu greifen, die wiederum dazu dienen bestimmte Frachtmoleküle selektiv in die Vesikel aufzunehmen.

2. Coatomer-bedeckte Vesikel sind beim unspezifischen Transport aus dem ER und den Golgi-Zisternen aktiv. Die Hülle dieser Vesikel besteht aus einem großen Proteinkomplex, dem Coatomer. Der Coatomer-Belag bleibt im Gegensatz zum Clathrin-Belag erhalten, bis die Vesikel an ihrer Zielmembran anlegt.

Mehrere Klassen von monomeren GTPasen , dazu gehören auch ARF und Rab-Proteine, helfen bei der Regulierung verschiedener Schritte des Vesikeltransportes, einschließlich Vesikelknospung, Anlegen und Fusion. ARF, Rab- und v-SNARE-Proteine werden während der Knospung in die Transportvesikel eingebaut und stellen sicher, daß die Vesikel ihre Inhaltsstoffe nur an das richtige membranumhüllte Kompartiment abgeben. ARF vermittelt das Zusammensetzen von Coatomer-Belägen und den Zerfall von Coatomer-Beschichtungen. Rab-Proteinen sichern die Spezifität der Vesikelanlagerung, indem sie die Vesikel nur dann an die Zielmembran anschließen, wenn komplementäre SNAREs auf Vesikel- und Zielmembran wechselwirken. Die Membranfusion wird dann von einer Reihe cytosolischer Proteine katalysiert, einschließlich SNAPs und NSF, die sich an der Fusionsstelle zu einem Fusionskomplex zusammenlagern.

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2. Material und Methoden

2.1 Aussäen von Zellen auf Deckgläser

Die humane Adenokarzinomzelllinie HeLaSS6 wird zunächst auf sterilen, mit Poly-L-Lysin ( sorgt für bessere Adhärenz der Zellen ) bedeckten Deckgläschen, in eine kleine Zellkulturschalen ausgesät. Hierzu werden 6 kleine Zellkulturschalen mit je 4 Poly-L-Lysin bedeckten Deckgläschen vorbereitet ( diese Ansätze werden für die Calcium-Phosphat Transfektion, Standard-Immunfluoreszenz und Rasterelektronenmikroskopie verwendet ) und des weiteren ein Deckglas pro Well ( insgesamt 4 Wells ) einer 24 Wellplatte ( diese Ansätze werden für die Lipofectamin-Transfektion 3.1 verwendet ). Das Medium der bei 37°C / 5% CO 2 kultivierten Adenokarzinomzelllinie HeLaSS6 wird abgesaugt und 1mal mit PBS gewaschen ( u.a. um das fötale Kälberserum ( FCS ) aus der Zellkulturschale zu waschen, deren Bestandteile inhibitorisch auf das Trypsin im nächsten Schritt wirken ) . Zum Ablösen der adhärenten Zellen wird 1ml Trypsin zugegeben und 5min. im Brutschrank inkubiert ( Schlierenbildung ist erkennbar ). 5ml Medium ( Dulbecco`s modified Eagle`s medium: 4,5g Glucose / 10% FCS / 2% Penicillin/Streptomycin / 1% Natriumpyruvat ) werden auf die abgelösten Zellen gegeben. Die Bestimmung der Gesamtzellzahl erfolgt mit einer Thoma-Kammer.

Bestimmung der Gesamtzellzahl ( Thoma-Kammer ):

100µl der Zellsuspension werden mit 100µl Trypanblaulösung ( Trypanblau diffundiert ungestört durch die Membran toter Zellen, die dadurch blau angefärbt werden ) und die Gesamtzellzahl durch auszählen eines Großquadrates in der Thoma-Kammer berechnet. Rechnung:

30 ( Mittelwert der gezählten Zellen ) X 16520 ( Kammerfaktor u. 1:2 Verdünnung ) = 4,956x10 ⁵ Zellen/ml

Pro kleiner Zellkulturschale sollen 1,5x10 ⁵ Zellen ausgesät werden, also: 1,5x10 ⁵ / 4,956x10 ⁵ = 300µl

In die 6 Zellkulturschalen werden 2ml Medium vorgelegt und je 300µl Zellsuspension zugegeben.

Pro Well sollen 3x10 ⁴ Zellen ausgesät werden, also: 3x10 ⁴ / 4,956x10 ⁵ = 60µl/Well

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Da das Volumen von 60µl unvorteilhaft ist, wird ein Mastermix für 5 Ansätze erstellt: Insgesamt 4ml ( pro Well 800µl ): 3,7ml Medium + 300µl Zellsuspension

Des weiteren werden HeLa-Zellen mit einem stabil integrierten GFP-Aktin-Konstrukt ( Abb.2 ), wie oben beschrieben, mit einer Zellzahl von 3x10 ⁵ Zellen in eine Zellkulturschale mit sterilen Deckgläschen ausgesät.

Die Inkubation erfolgt ü.N. im Brutschrank ( 37°C / 5% CO 2 ).

2.2 Transfektion von HeLaSS6-Zellen

2.2.1 Transfektion mit Calcium-Phosphat:

Medien: 2xHBS-Lösung: 280 mM NaCl 10 mM KCl

1,5 mM Na 2 HPO 4 x H 2 O 12 mM Glucose 50 mM HEPES pH auf 7,1 mit NaOH einstellen

Calcium-Phosphat-DNA Präzipitatansatz: 128µl H 2 O 143µl 2xHBS Lösung 1µl EYFP-ß-Adaptin DNA 5µl RFP-Clathrin (leichte Kette) DNA 18µl CaCl 2

vorsichtig mischen und 30` bei RT inkubieren ( damit sich Calcium-Phosphat-DNA Präzipitate bilden können )

Die Zellkulturschale vom Vortag wird aus dem Brutschrank entnommen und mikroskopisch überprüft, ob die Zellen vital erscheinen. Nach dem Absaugen des Kulturmediums, werden die Zellen mit PBS gewaschen. Anschließend wird zu den Zellen 2ml Transfektionsmedium zugegeben. Das Transfektionsmedium wird wie folgt pipettiert: 1,6ml DMEM 200µl NFE-Lösung ( Aminosäurelsg. ) 200µl FCS

10 Moderne mikroskopische Methoden in der Zellbiologie

Der Calcium-Phosphat-DNA Präzipitatansatz ( s.o.) wird tropfenweise in die Zellkulturschale pipettiert. Die Inkubation erfolgt ü.N. im Brutschrank.

2.2.2 Transfektion mit Lipofectamin 2000:

DNA-Verdünnungsansatz: 150µl Optimem-1 0,5µl EYFP-ß-Adaptin DNA 1µl RFP-Clathrin (leichte Kette)

Lipofectaminansatz:

150µl Optimem-1 3µl Lipofectamin 5 min. bei RT inkubieren

Nach 5 min. Inkubation wird der DNA-Verdünnungsansatz in den Lipofectaminansatz pipettiert. Die 4 vom Vortag ausgesäten Wells der 24 Wellplatte werden zunächst mit PBS gewaschen und je Well 500µl Transfektionsmedium zugegeben. Das Transfektionsmedium wird wie folgt pipettiert: 1,8ml DMEM 200µl NFE-Lösung ( Aminosäurelsg. )

In die ersten 3 Wells wird tropfenweise ca. 100µl der Lipofectamin-DNA-Lösung pipettiert, wobei das 4 Well als Kontrolle dient. Die Inkubation erfolgt ü.N. im Brutschrank Die Präparate werden dunkel bis zur fluoreszenzmikroskopischen Auswertung gelagert.

2.3 Standard-Immunfluoreszenz:

Die auf Deckgläschen in Zellkulturschalen gewachsenen HeLaSS6 Zellen werden zunächst mit PBS gewaschen. Anschließend wird 1ml Paraformaldehyd-Lösung ( 4% PFA in PBS ) in die Zellkulturschalen zugegeben und 5min. bei RT inkubiert. Um das Paraformaldehyd aus den Zellkulturschalen zu entfernen, wird 3mal mit PBS gewaschen. Es folgt eine Inkubation mit TBS für 5min. bei RT, um das restliche Paraformaldehyd zu neutralisieren. Nach 3mal waschen mit PBS, wird TritonX-100 Lösung in die Zellkulturschalen zugegeben ( sorgt für Permeabilität der Zellmembranen ) und erneut gewaschen. Es folgt die Inkubation mit dem primären Antikörper. Dazu werden je 20µl der entsprechenden Antikörperlösung in PBS mit

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3% BSA auf Parafilm in eine Petrischale pipettiert. Die Antikörperlösung 1 enthält den polyklonalen Antikörper R461 ( Anti-Clathrin / aus Kaninchen ) in einer finalen Verdünnung von 1:2000 und einen monoklonalen Antikörper ( aus der Maus ) gegen Adaptin 1 in einer finalen Verdünnung von 1:50. Die Antikörperlösung 2 enthält ebenfalls den Anti-Clathrin Antikörper R461 und den monoklonalen Antikörper ( aus der Maus ) gegen Adaptin 2 in einer finalen Verdünnung von 1:2000. Die kurz mit Filterpapier vorsichtig getrockneten Deckgläschen werden mit der Zellseite nach unten auf den entsprechenden Tropfen mit der jeweiligen Antikörperlösung gelegt, wobei 2 Deckgläschen auf die Antikörperlösung 1 und 2 Deckgläschen auf die Antikörperlösung 2 gelegt werden. Die Inkubation erfolgt für 1h bei 37°C im Brutschrank.

Anschließend werden die Deckgläser nacheinander in drei mit PBS gefüllte Bechergläser getaucht, um nicht gebundenen Erstantikörper wegzuwaschen. Die Erstantikörper werden durch fluoreszenzfarbstoffmarkierte sekundäre Antikörper sichtbar gemacht. Hierzu werden die Deckgläschen erneut auf einen Tropfen mit der Sekundärantikörperlösung mit der Zellseite nach unten gelegt. Die Sekundärantikörperlösung enthält Rodamin konjugierte Anti-Maus Antikörper ( rote Fluoreszenz ) und Anti-Kaninchen Antikörper mit einem grün fluoreszierendem Farbstoff. Die Inkubationen und Waschschritte erfolgen wie für den ersten Antikörper beschrieben. Die Deckgläser werden erneut gewaschen und auf einem Objektträger mit einem Tropfen des Eindeckmediums Moviol fixiert. Die Präparate werden dunkel bis zur fluoreszenzmikroskopischen Auswertung gelagert

2.4 Transmissionselektronenmikroskopie ( TEM ):

Für die Strukturuntersuchung mit dem Transmissionselektronenmikroskop sind wegen der sehr starken Wechselwirkung zwischen Elektronen und Festkörpern nur Proben mit weniger als 100nm Dicke geeignet. Sollen abgeschiedene Dünnschichten untersucht werden, so können diese durch Ablösung in einem geeigneten Ätzmittelbad und Auffischen mit einem elektronenmikroskopischen Netz präpariert werden. Die Anfertigung durchstrahlbarer Ultramikrotom-Dünnschnitte mit Glas- oder Diamantmessern ist besonders bei biologischen Proben gebräuchlich. Sollen Kompaktproben oder Querschnitte durch Schicht-Substrat-Kombinationen untersucht werden, so sind dafür ausgefeilte Präparationsmethoden entwickelt worden , die den Materialabtrag durch Ätzmittel oder Ionenstrahlen zum Ziel haben. In einem ersten Präparationsschritt werden Ronden von etwa 3mm Durchmesser und möglichst geringer Dicke hergestellt. Vielfach müssen hierzu die Materialien in ein

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geeignetes Epoxidharz oder Klebemittel eingebettet werden. Die Probenrohform wird durch mechanisches, chemisches oder elektroerosives Ronden und durch geeignetes Sägen, Schleifen und Polieren hergestellt. Mechanisch handhabbare Proben sollten einen relativ dicken Rand (>100µm) und eine elektronendurchstrahlbare Mitte (<100nm) aufweisen. Zur Endabdünnung sind chemische oder elektrolytische Verfahren mit einem feinen Säurestrahl oder das Ionenätzen im Einsatz. Besonders bei sehr flachen Ioneneinschußwinkeln auf die Probenoberfläche kann erreicht werden, daß sich große Unterschiede in den Abtragraten zwischen verschiedenen Probenmaterialien wenig auswirken und diese gleichzeitig durchstrahlbar werden. Zur hochauflösenden Abbildung der Oberflächentopographie mit dem

Durchstrahlungselektronenmikroskop haben sich C-Pt-Abdrücke bewährt. Bei der gleichzeitigen Bedampfung des Untersuchungsobjektes mit C und Pt bildet sich auf dessen Oberfläche ein geschlossener C-Film. Die Einlagerungen von Pt-Atomen sind durch Abschattungseffekte topographieabhängig. Nach der chemischen Ablösung der Schicht von der Probenoberfläche rufen diese bei der Durchstrahlung im Elektronenmikroskop Kontraste hervor. Mit dieser Methode sind Strukturen der Oberflächentopographie bis herab zu 2nm abzubilden.

Durch Dekoration, also Anlagerung von schweren Atomen, monoatomarer Stufen auf Einkristalloberflächen kann man z.B. deren Anordnung sichtbar machen, ohne über atomare Auflösung zu verfügen.

2.4.1 Pt/C-Replikation:

Zunächst werden gespaltete Glimmer ( besitzen äußerst glatte Oberfläche ) mit einer Clathrinlösung ( 100µl Clathrin ( 100µg/ml) in Puffer A ( 100mM MES / 1mM EGTA / 0,5mM MgCl 2 / 0,02% NaN 3 / pH=6,4 ) mit 200µl Glycerin ) mittels einer Zerstäubervorrichtung besprüht. Das erfolgreiche besprühen wird unter einem Binokular überprüft. Die beschichteten Glimmer werden anschließend im Hochvakuum eingedampft ( getrocknet ) und unter flachem Winkel ( 5°-10° ) mit einer Pt/C-Legierung im Vakuum bedampft ( wobei sich der Probenteller dreht ). Die bedampften Glimmer werden auf ein Kupfernetz gebracht und im Transmissionselektronenmikroskop ( TEM ) analysiert.

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2.4.2 Negativkontrastierung:

Um die polymerisierten Clathrinkäfigstrukturen unter dem TEM zu analysieren, erfolgt eine Kontrastierung mit Uranylacetat. Dieses in Wasser lösliche Schwertmetallsalz lagert sich beim Eintrocknen in amorpher Form um die Clathrinkäfigstruktur. Hierdurch bleibt das Objekt gut durchstrahlbar, während seine Umgebung im Elektronenmikroskop negativ kontrastiert.

Kohlefilmglimmer werden vorsichtig durch einen Tropfen Clathrinlösung ( 100µg/ml ; in der die Clathrinmoleküle zu der charakteristischen Käfigstruktur polymerisiert sind ) gezogen, sodass die Kohlefilmträgerfolie in diesem Tropfen zurückbleibt. Nach einer Inkubationsphase von ca. 30 sek. wird die Trägerfolie in einen Uranylacetat-Tropfen ( 2% Uranylacetat in H 2 O ) überführt und anschließend auf Kupfergitter gebracht. Die Analyse erfolgt im

Transmissionselektronenmikroskop ( TEM ).

2.5 Rasterelektronenmikroskopie

Die Präparation von Kompaktproben für die Rasterelektronenmikroskopie gestaltet sich relativ unkompliziert. Vielfach beschränkt sie sich auf die Beschichtung isolierender Probenoberflächen mit leitfähigen Überzügen. Gebräuchlich ist das Aufdampfen von Kohlenstoff im Hochvakuum, wodurch selbst auf stark strukturierten Oberflächen geschlossene Filme entstehen. Für hohe Auflösungen ist wegen der größeren Sekundärelektronenausbeute eine Beschichtung mit Gold oder Platin vorzuziehen. Sehr feinkristallin und frei von Eigenstrukturen werden solche Schichten durch Ionenzerstäubung in einer Gasentladung hergestellt.

Sollen Querschnitte durch Proben im Rasterelektronenmikroskop untersucht werden, müssen diese vorher durch Brechen, Sägen, Schleifen o.ä. zweckmäßig getrennt werden. In Fällen, bei denen diese Verfahren nicht anwendbar sind, weil sie die interessierenden Strukturen zerstören, oder Artefakte durch die verwendeten Schleif- und Poliermittel nicht auszuschließen sind, hat sich die Herstellung eines Böschungsschnittes durch Ionenbeschuß bewährt.

Die auf Deckgläschen ausgesäten HeLaSS6-Zellen werden zunächst mit Paraformaldehyd ( PFA ) ( 4% PFA in PBS ) fixiert und für 10min. inkubiert. Durch 5mal waschen mit PBS wird das Paraformaldehyd aus der Zellkulturschale entfernt. Als nächstes erfolgt eine Probenentwässerung mit einer aufsteigender Acetonkonzentrationsreihe ( 30%-100% ).

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Zwischen den einzelnen Konzentrationsstufen erfolgt eine Inkubation von ca.5min. Die Deckgläschen werden nun in einer Kritischen Punkt Aperatur getrocknet und anschließend mit Gold beschichtet. Die Analyse erfolgt im Rasterelektronenmikroskop.

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3.Ergebnisse:

3.1 Transfektion von HeLaSS6-Zellen

Die mit Lipofectamin ( 2.2.2 ) transfizierten HeLaSS6-Zellen exprimieren das, mit einem Rotfluoreszierenden Protein markierte Clathrin ( Abb.1 ) hauptsächlich im Cytosol ( im Trans-Golgi-Netzwerk / Abb.1 D-F ). Besonders deutlich ist dies in Abb.1 C/F illustriert, wo der Kanal für die rote Fluoreszenz in einer schwarz-weiß Darstellung kontrastiert ist. Des weiteren ist die grüne Fluoreszenz des markierten ß-Adaptin in der Bildreihe A-F zu erkennen. Das ß-Adaptin, welches mit Adaptin 2 assoziiert ist, befindet sich überwiegend in der Plasmamembran ( Abb.1 B ). Komplexe aus Clathrin und Ap2 ( mit ß-Adaptin assoziiert ) fluoreszieren gelb und sind im Cytosol ( im Trans-Golgi-Netzwerk ) lokalisiert.

A-C zeigt die Fluoreszenz fokussiert auf die Plasmamembran. A illustriert die Doppelfluoreszenz ( rot = Clathrin / grün = ß-Adaptin ) ; B zeigt den Kanal für die grüne Fluoreszenz von ß-Adaptin in einer schwarz-weiß Darstellung, C den Kanal für die rote Fluoreszenz für Clathrin in einer sw-Darstellung. Die Bildreihe D-F zeigen die Zellen von A-C fokussiert auf das Trans-Golgi-Netzwerk.

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3.2 Standard Immunfluoreszenzfärbung:

Bei der Standard-Immunfluoreszenzfärbung ( 2.3 ) wurde spezifisch das Clathrin ( mAK R461 ), welches durch eine grüne Fluoreszenz in Abb.2 A-F erkennbar ist, und das AP1 ( Abb.2 Bildreihe A-C ), bzw. AP2 ( Bildreihe D-F ) welches jeweils rot fluoresziert, markiert.

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Abb.2: In der Bildreihe A-C ist das Clathrin durch eine grüne Fluoreszenz erkennbar, des weiteren fluoresziert AP1 rot. A zeigt die Doppelfluoreszenz; B den Kanal für die Fluoreszenz des Clathrin in sw; C den Kanal für die Fluoreszenz des AP1 in sw. In D-F ist das Clathrin erneut grün fluoreszierend und das AP2 fluoresziert rot. F zeigt den Kanal für AP2 in sw. In G und H ist die Fluoreszenz des mit GFP markierten Aktins der stabil transfizierten HeLa-Zellen zu sehen.

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Das Clathrin ist in Abb.2 A-C vor allem im Cytosol ( Trans-Golgi-Netzwerk ) , aber auch in der Plasmamembran lokalisiert. Deutlich wird dies in B, wo der Kanal für die grüne Fluoreszenz des Clathrin in schwarz weiß dargestellt ist. Das Ap1 ist, wie aus A und C hervorgeht mit Clathrin im Trans-Golgi-Netzwerk assoziiert. In D und F wird deutlich, dass das AP2 ( rote Fluoreszenz ) an der Plasmamembran lokalisiert ist. In G und H ist die Fluoreszenz des mit GFP markierten Aktins der stabil transfizierten HeLa-Zellen zu sehen.

3.3 Transmissionselektronenmikroskopie ( TEM ):

In Abb.3, Bildreihe A-C sind die elektronenmikroskopische Aufnahmen ( Vergrößerung 45.000 ) der Clathrin-Triskelions zu erkennen ,die mit Platin kontrastiert sind ( 2.4.1 ).

Abb.3: A-C: Elektonenmikroskopische Aufnahme ( 45000fache Vergrößerung ) von Clathrin-Triskelions, die mit Platin kontrastiert sind. D-F: Polyedrische Käfigstruktur in vitro polymerisierter Triskelions. ( 34000fache Vergrößerung ), die negativ kontrastiert sind.

Obwohl aus dieser Aufnahme nicht erkennbar, besteht jede Clathrinuntereinheit aus drei großen und drei kleinen Polypeptidketten, die gemeinsam die zu sehende Trikelionstruktur bilden. Die Clathrin Trikelions lagern sich zu einem korbähnlichen, konvexen Netz aus Fünf- und Sechsecken zusammen und bilden so auf der cytosolischen Seite von Membranen

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Vertiefungen aus, die so genannten Coated Pits. Unter geeigneten Bedingungen ( Isolationpuffer mit 2-3mM Calcium ) lagern sich gereinigte Triskelions in vitro selbstständig zu polyedrischen Käfigen zusammen, wie in Abb.3 D-F zu sehen ist.

3.4 Rasterelektronenmikroskopie

In Abbildung 4 A-C sind die rasterelekronenmikroskopischen Bilder, der auf Deckgläschen kultivierten und mit Gold beschichteten HeLaSS6-Zellen ( 2.1 / 2.5 ) zusehen.

Abb.4: REM-Bilder kultivierter und mit Gold beschichteter HeLaSS6-Zellen. Bild A zeigt die HeLa-Zellen in 320facher Vergrößerung, Bild B in 1250facher Vergrößerung und Bild C in 10000facher Vergrößerung

4. Diskussion:

4.1 Transfektion von HeLaSS6-Zellen und Standard Immunfluoreszenzfärbung

Clathrin-bedeckten Vesikel vermitteln den selektiven Transport von Transmembranproteinen (z.B. M6P-Rezeptor aus dem Trans-Golgi-Netz) und befördern lösliche Moleküle, die an die Rezeptoren gebunden sind oder sich im Vesikel-Lumen befinden. Das Clathrin ist daher in der Plasmamembran, hier bilden sie auf der cytosolischen Seite von Membranen Vertiefungen aus, die so genannten Coated Pits, und im Trans-Golgi Netzwerk zu finden. Die Clathrin beschichteten Vesikel sind also am visikolären Transport zwischen Trans-Golgi-Netzwerk und Plasmamembran ( bzw. umgekehrt ) beteiligt. Dies wird auch durch die Abbildungen 1 D-F und Abb.2 D-F deutlich.

Das Adaptin 1 ist, wie Abb.2 A-C illustrieren, im Trans-Golgi Netzwerk mit Clathrin assoziiert und vermitteln hier die Exozytose. Transportvesikel verlassen das Trans-Golgi- Netzwerk und fusionieren mit der Plasmamembran. Sekretorische Vesikel schnüren sich unter

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Beteiligung von Clathrin vom Trans-Golgi-Netzwerk ab und geben ihre Inhaltsstoffe durch Exozytose an die Umgebung der Zelle ab. Das Adaptin 2 hingegen ist mit Clathrin an der Plasmamembran assoziiert und vermitteln die Endozytose. Diese beginnt in den Clathrincoated Pits der Plasmamembran, die in Abb.3D-F gezeigt sind. Dabei handelt es sich um Einstülpungen der Membran, die mit Clathrin besetzt sind. Die daraus entstehenden Vesikel heißen Clathrin-coated vesicles. Diese sind sehr kurzlebig und verschmelzen schnell mit frühen Endosomen. Die Aufnahme spezifischer Makromoleküle aus der extrazellulären Flüssigkeit durch Clathrin-coated pits oder vesicles nennt man Rezeptor-vermittelte Endozytose.