Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Inhaltsverzeichnis

1.  Einleitung  

1.1.  Hämatopoese  1

1.2.  Schwere kongenitale Neutropenie ( CN )  2

1.3.  Kongenitale amegakaryozytische Thrombozytopenie ( CAMT )  4

2.  Material und Methoden  

2.1  Separation von MNC und GZ aus Vollblut über Ficoll  6

2.2  Durchflußzytometrie  8

2.3  FACS ( Fluorescence-Activated Cell Sorter )  10

2.4  Zytospin und MGG-Färbung  12

2.5  Single-Cell PCR  12

2.5.1  Amplifikation des C-MPL Rezeptorgens  12

2.5.2  Amplifikation des G-CSF Rezeptorgens  13

3.  Ergebnisse  

3.1  Durchflusszytometrische Untersuchung der separierten Zellen  15

3.1.1  Analyse der Vollblutprobe  15

3.1.2  Analyse der MNC  16

3.2  Zytospin-Analyse  16

3.3  Single-Cell PCR  18

3.3.1  Amplifikation des C-MPL Rezeptorgens  18

3.3.2  Amplifikation des G-CSF Rezeptorgens  18

4.  Diskussion  19

1 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

1. Einleitung

1.1 Hämatopoese

Die „Ahnenreihe“ der Blutzellen beginnt im Knochenmark mit den sogenannten pluripotenten

Stammzellen. Aus ihnen differenzieren sich zahlreiche Generationen der Erythropoese,

Leukopoese und Thrombopoese ( s. Abb.1 ). Dieses erfolgt unter dem Einfluss von

Wachstumsfaktoren. Sie werden zum Teil fern von ihrem Wirkort und zum Teil lokal von

benachbarten Zellsystemen gebildet. Änderungen des Zellbildes ergeben sich vor allem dann,

wenn man veränderte Anforderungen des Organismus vorfindet (z.B. Entzündungen, Infekt,

etc.). Die Vorläuferzellen befinden sich im roten Knochenmark. Das blutbildende

Knochenmark beim Erwachsenen enthält etwa 10 ¹² hämatopoetische Vorläuferzellen.

Abb.1: Pluripotente Stammzellen (dunkelrot) können sich entweder selbst erneuern, oder sie teilen sich unter Bildung myeloischer oder lymphatischer Stammzellen (hellrot). Obwohl diese Stammzellen immer noch in der Lage sind, sich selbst durch Teilung zu vermehren, sind sie bereits auf die Entwicklung innerhalb eines der beiden Hauptwege der hämatopoetischen Zellreihen festgelegt. In Abhängigkeit von Art und Menge der einwirkenden Zytokine bilden die myeloischen und lymphatischen Stammzellen verschiedene Vorläuferzellen, die sich nicht mehr durch Teilung erneuern können (grün). Nach weiteren Teilungs- und Differenzierungsschritten entstehen aus den Vorläuferzellen die verschiedenen reifen Blutzellarten. Zu den Zytokinen, die die Hämatopoese steuern, zählen unter anderem: Granulozytenkoloniestimulierender Faktor (G-CSF), Makrophagen koloniestimulierender Faktor (M-CSF), verschiedene Interleukine (IL), Stammzellfaktoren (SCF), Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Erythropoetin (Epo),und Thrombopoetin (TPO) [aus Lodish;Molekulare Zellbiologie 4.Auflage]

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Diese pluripotenten Zellen besitzen die Fähigkeit zur Differenzierung und Proliferation. Sie lassen sich nur funktionell und nicht morphologisch identifizieren. Man bezeichnet sie auch als „Colony forming units“ (CFU), da sie bei Einpflanzung in ein fremdes Gewebe zur Ausbildung von determinierten Vorläuferzellkolonien, den ersten Vertretern der roten bzw. weißen „Ahnenreihe“, führen. Nicht alle der zahlreichen Differenzierungsschritte in der Generationsfolge der verschiedenen Blutzellen sind im Detail bekannt. Eine wichtige Rolle spielen die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren. Sie werden auch als „Colony stimulating factors“ (CSF) bezeichnet, weil sie die Differenzierung oder Proliferation stimulieren. Es handelt sich dabei um kleine Peptide, die als parakrin freigesetzte Wirkstoffe lokal ihre Wirkung entfalten. Auch klassische Hormone, wie etwa die Katecholamine, Steroidhormone, Schilddrüsenhormone oder das Wachstumshormon haben einen Einfluss auf die Differenzierung und Proliferation der Zellen.

Die erythropoetisch, granulozytopoetisch, monozytopoetisch bzw. thrombozytopoetisch determinierten Vorläuferzellen werden entsprechend der Nomenklatur als CFU-Erythropoetisch, CFU-Granulocyte-Monocyte, CFU-Megakaryocyte (CFU = Colony forming Unit), etc. bezeichnet. Die verschiedenen Determinierungsschritte werden durch Wachstumsfaktoren, die als Granulozyten-CSF, Monozyten-CSF bezeichnet werden und durch Interleukine (IL-3 und IL-5) stimuliert. So durchlaufen die Vorläuferzellen den Proliferationspool, um über den Reifungspool den Funktionspool zu erlangen. Die hämatopoetischen Stammzellen lassen sich mit dem fluoreszenzaktivierten Zellsorter ( FACS 2.3 ) anreichern. Diese Zelltrennung beruht auf der Erkennung bestimmter Oberflächenproteine, wodurch sich die hämatopoetischen Stammzellen von den davon abstammenden Zellen unterscheiden lassen. Außerdem fehlen bestimmte Oberflächenproteine auf den Stammzellen, die wiederum für die differenzierten Zellen charakteristisch sind. Jedes dieser Oberflächenproteine bindet ein unterschiedlichen monoklonalen, mit jeweils verschiedenem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörper. Auf diese Weise kann der FACS einzelne Zellarten voneinander trennen, die jeweils spezifische Kombinationen von Oberflächenproteinen aufweisen.

1.2 Schwere kongenitale Neutropenie ( CN )

Die Hämatopoese unterliegt u.a. der Regulation von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, die spezifisch mit Oberflächenrezeptoren der hämatopoetischen Stammzellen, oder der Vorläuferzellen interagieren. Durch diese Rezeptor-Ligand Bindung wird eine intrazelluäre

3 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Signalkaskade initiiert, die diverse zelluläre Antworten hervorruft, so z.B. Wachstum und Differenzierung. Der Granulozyten koloniestimulierende Faktor ( G-CSF ) ist z.B. entscheidend an der Granulopoese beteiligt, in dem das G-CSF die Proliferation und die Entwicklung der neutrophilen Granulozyten aus den myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark stimuliert ( Abb.1 ). Des weiteren ist G-CSF am „Überleben“ von hämatopoetischen Vorläufern beteiligt.

Diese entscheidende Signalinitiation wird durch die Interaktion von G-CSF und dessen spezifischen Rezeptor, dem G-CSF-Rezeptor ( G-CSFR ) vermittelt. Der G-CSF-Rezeptor gehört zur Zytokin Rezeptor Superfamilie und wird auf myeloiden Vorläuferzellen, differenzierten Neutrophilen, Thrombozyten und Monozyten exprimiert. Das humane G-CSFR Gen ( 1p32-35 ) codiert eine 3,7kb lange mRNA und besteht aus 17 Exons, die über einen Locus von 16,5kb verstreut sind. Wie andere Zytokin-Rezeptoren, wird durch Bindung mit dem spezifischen Ligand eine intrazelluläre Signalkaskade in Gang gesetzt, initiiert durch die Interaktion der cytoplasmatischen Domäne des Rezeptors mit einer intrazellulären Tyrosinkinase. Mutationen in diesen spezifischen Rezeptoren haben demnach schwerwiegende Folgen für den weiteren Hämatopoeseverlauf.

So können verschiedene spontane, somatische Punktmutationen in der intrazellulären Domäne des G-CSFR Gens zu einem Reifungsstopp der myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark, auf der Ebene der Promyelozyten und Myelozyten führen ( Abb.:2 ).

Abb.2: Nonsense-Mutationen, die bei Expression zur Trunkation der cytoplasmatischen Domäne des

Rezeptor-Proteins führen

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Patienten mit solchen Mutationen zeigen eine charakteristische Reduktion zirkulierender neutrophiler Granulozyten ( unter 0,2/µl ). Die resultierende Krankheit wird schwere kongenitale Neutropenie ( CN ), oder Kostmann Syndrom genannt. Die reduzierte Anzahl neutrophiler führt bei vielen Patienten zu rezidivierenden bakteriellen Infektionen in den ersten Lebensmonaten.

Von 422 Patienten mit CN haben 44 Patienten (10.4 %) zusätzlich ein Myelodysplastisches Syndrom (MDS) oder eine Leukämie unabhängig von der Behandlungsdauer oder der G-CSF Therapie entwickelt. CN gilt daher als ein präleukämisches Syndrom.

1.3 Kongenitale amegakaryozytische Thrombozytopenie ( CAMT )

Ein weiterer hämatopoetischer Wachstumsfaktor, der während der Hämatopoese regulierend wirkt, ist das Thrombopoitin ( TPO ). Dieses Zytokin ist entscheidend an der Thrombozytendifferenzierung aus Vorläuferzellen, den Megakaryozyten des Knochenmarks, beteiligt ( Abb.1 ). Des weiteren wirkt TPO in Kombination mit anderen Zytokinen positiv auf frühe multipotente Vorläuferzellen. Der TPO-Rezeptor, c-MPL, wird vor allem auf Zellen der Megakaryozytenlinie exprimiert, aber auch auf frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen. Untersuchungen mit c-mpl Knockout Mäusen haben gezeigt, dass diese im Vergleich zu normalen Kontrollmäusen nur 10% der zirkulierenden Thrombozyten besitzen. Des weiteren ist die Anzahl der Megakaryozyten im Knochenmark dezimiert, was auch bei einer Vielzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu beobachten ist. Die über das TPO vermittelten Signale scheinen also eine wichtige Rolle in der Regulation hämatopoetischer Stammzellen zu spielen.

Das humane c-mpl Gen besteht aus 12 Exons, verteilt über 17kb auf dem Chromosom 1p34.

5 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Mutationen im c-mpl Gen führen zu einer kongenitale amegakaryozytischen Thrombozytopenie ( CAMT ). Diese seltene Erkrankung ist durch einen schweren Mangel an Thrombozyten ( Thrombozytopenie ) während der ersten Lebensjahre charakterisiert, welche sich zu einer Panzytopenie im späteren Verlauf der Kindheit entwickelt. Von 8 getesteten CAMT-Patienten wurden Mutationen im c-mpl Gen festgestellt, wobei 7 verschiedene heterozygote und homozygote diagnostizierbar waren ( Abb.3 ). Verhältnismäßig häufig sind die Mutationen im Exon 3 repräsentiert.

In einer Gruppe von Patienten führen homozygote Deletionen ( Abb.3: CAMT-9 / CAMT13 ), oder Nonsense Mutationen ( Abb.3: CAMT-1 / CAMT-6 / CAMT-17 ) zu einem Stop-Codon, woraus ein unvollständiger c-Mpl Rezeptor resultiert. Bei Patienten mit diesen Mutationen ist ein kompletter Verlust der Rezeptorfunktion zu beobachten. Bei einer anderen Gruppe von CAMT-Patienten sind Missense-Mutationen nachweisbar ( Abb.3: CAMT-7 / CAMT-11 / CAMT-12 ). Die Aminosäuresubstitution hat hier unterschiedliche Auswirkungen auf die Faltung des Proteins, was zu einer Beeinträchtigung der Rezeptorfunktion führt. Patienten, die der ersten Gruppe angehören ( Deletion / Nonsense-Muation ), haben eine schwerwiegende Thrombozytopenie, welche schneller in eine Panzytopenie führt.

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2. Material und Methoden

2.1 Separation von MNC und GZ aus Vollblut über Ficoll

Ficoll ist eine Lösung aus einem hochmolekularen Zucker ( Ficoll MW 40kDa ) und einem Röntgenkontrastmittel ( Isopaque ). Die kommerziell erhältliche Lösung hat eine Dichte von 1,077g/ml. Diese liegt unter der von Erythrozyten und Granulozyten, aber über der von mononukleären Zellen ( Lymphozyten, Monozyten ) des Blutes. Blut wird in einem Röhrchen über Ficoll geschichtet und zentrifugiert. Mononukleäre Zellen finden sich danach in der Interphase zwischen Plasma und Ficoll, der Rest ( Granulozyten, Erythrozyten ) unterhalb der Ficoll-Schicht. Die Dichte der erhältlichen Ficoll-Trennlösung ist zur Separation humaner mononukleärer Zellen konzipiert.

Nach der Separation können die Zellen geerntet werden. Mehrfaches Waschen mit Puffer ( PBS ) entfernt Reste des Dichtegradienten und leichtere Kontaminationen. Zellen, die sich unterhalb des Gradienten angesammelt haben können von den Erythrozyten durch eine hypotone Lyse befreit werden. Hierbei sind die kernlosen Erythrozyten von Säugetieren gegenüber hypotonen Lösungen weit empfindlicher als kernhaltige Zellen. Deshalb lassen sich unerwünschte Erythrozyten aus einem Gemisch mit kernhaltigen Zellen selektiv entfernen. Hierfür stehen mehrere Methoden zur Verfügung, z.B. durch kurzzeitige Behandlung mit destilliertem Wasser, oder durch längere Behandlung mit hypotoner Ammoniumchlorid-Lösung. Am Ende der jeweiligen Behandlung sind die verbleibenden Zellen umgehend wieder in eine physiologische Lösung zu bringen, um nicht ebenfalls lysiert zu werden.

Zunächst werden 20ml PBS, 10ml Plasmasteril ( erhöht die Viskosität und unterstützt das Absinken der Erythrozyten ) und 20ml Vollblut in eine Perfusorspritze aufgezogen und für 30min sedimentieren lassen. Es bilden sich deutlich 2 Phasen, wobei die untere dunkelrot gefärbt ( Großteil der Erythroyten ) und die obere heller gefärbt ist ( enthält u.a. MNC und GZ ). Anschließend wird in einem Falconröhrchen 10ml Ficoll vorgelegt und mit der helleren oberen Phase vorsichtig, um Verwirblungen zu vermeiden, beschichtet. Nach der folgenden Zentrifugation ( 20min. / 2200Upm / RT / ohne Bremse ) ist eine deutliche Phasentrennung zu erkennen. Die obere, gelbliche Phase ist das Plasma und Thrombozyten, die Interphase, milchig trüber Zellring, enthält die mononukleären Zellen, gefolgt von der Ficollphase. Im Zellpellet sind die Granulozyten und die Erythrozyten enthalten. Die Interphase wird

7 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

vorsichtig in zwei neue Falconröhrchen pipettiert und mit kalter PBS-Lösung gewaschen ( Zentrifugation für 10min. / 1500Upm / RT ). Der Überstand wird dekantiert und das Pellet in FACS-Puffer ( 1l PBS / 5ml Natriumacid 20% / 5g BSA ) aufgenommen. Alle Arbeitsschritte werden auf Eis durchgeführt. Es folgt die Bestimmung der Gesamtzellzahl. Die Zellpellets werden in restlichem Plasma resuspendiert und die Erythrozyten durch hinzupipettieren von 10ml Aqua dest. lysiert ( destilliertes Wasser übt osmotischen Druck aus, sodass die Erythrozyten platzen ). Nach 3maligem hoch und runter pipettieren werden 5ml 2,7%ige NaCl-Lösung zugegeben, um wieder eine isotonische lösung zu generieren. Alle Arbeitsschritte erfolgen auf Eis. Die Falconröhrchen werden mit kalter PBS-Lösung auf 50ml aufgefüllt und gewaschen ( 10min. / 1500Upm / RT ). Der Überstand wird dekantiert und das Pellet in 10ml FACS-Puffer aufgenommen. Es Folgt die Bestimmung der Gesamtzellzahl.

Bestimmung der Gesamtzellzahl ( Neubauerkammer ):

20µl der Zellsuspension werden mit 20µl Trypanblaulösung ( Trypanblau diffundiert ungestört durch die Membran toter Zellen, die dadurch blau angefärbt werden ) angefärbt und die Gesamtzellzahl durch auszählen eines Großquadrates in einer Neubaukammer berechnet. Gesamtzellzahl der isolierten Granulozyten:

Ansatz 1:

29,5 ( Mittelwert der gezählten Zellen ) x 10 ⁴ ( Umrechnungsfaktor ) x 2 ( Verdünnunsfaktor )= 5,9x10 ⁵ Zellen pro ml

Ansatz 2:

27,5 x 10 ⁴ x 2 = 5,5x10 ⁵ Zellen pro ml

Gesamtzellzahl der mononukleären Zellen:

Ansatz 1:

28,5 x 10 ⁴ x 2 = 5,7x10 ⁵ Zellen pro ml

Ansatz 2:

25 x 10 ⁴ x 2 = 5x10 ⁵ Zellen pro ml

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2.2 Durchflußzytometrie

Ein Durchflußzytometer ( FCM, flow cytometer ) misst Signale einzelner Partikel, die jene nach Ausstrahlung mit einem Laserlicht aussenden. Die vereinzelten Partikel, oder Zellen, kreuzen in einem dünnen Flüssigkeitstrahl ( hydrodynamische Fokussierung ) den monochromatischen Laserstrahl. Photomultiplikatoren messen die Streuung des Laserlichts. Je nach Modell des FCM werden pro Zelle ( oder event ) bis zu 5 Signale erfasst. Zwei davon beschreiben die Morphologie der Zelle. Das Vorwärtsstreulicht ( FSC, forward scatter ) ist proportional zur Größe, das Seitwärtsstreulicht ( SSC, side scatter ) ist proportional zur Komplexität ( Oberflächenbeschaffenheit, Granularität, Plasma/Kern-Verhältnis ) einer Zelle. So lassen sich große Zellen mit großer Plasma/Kern-Relation und granuliertem Zytoplasma ( Granulozyten ) von kleinen Zellen mit hohen Kernanteil ( Lymphozyten ) abgrenzen. Monozyten zeigen ein intermediäres Verhalten. Bei dem im Praktikum verwendeten Durchflußzytometer erfassen drei weitere Detektoren ( FL1 / FL2 / FL3 ) die Emission verschiedener Fluorochrome. Verwendet man verschiedene Fluorochrome zur Markierung von Zellen, sollten sie so gewählt werden, dass sie von der Wellenlänge des Lasers ( Argon, 488nm ) angeregt werden, aber in unterschiedlicher Wellenlänge das Licht emittieren, damit die Signale von den Detektoren unterschieden werden können. Beispiele sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tab. 1: Auswahl von Absorptions- und Emmissionsmaxima von häufig in der

Durchflußzytometrie eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen

Nach der Messung können die gespeicherten Daten abgerufen und mit einer speziellen FACScan Software ( WinMDI 2.8 ) ausgewertet werden. Hierbei können die verschiedenen Parameter miteinander kombiniert werden. Zusätzlich ist es möglich Filter zu setzen, die bestimmte Zellpopulationen ausgrenzen. Diesen Vorgang nennt man Diskriminierung oder „Gating“. Dieses „Gating“ ist auch schon während der Messung möglich und wird dann

9 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

„Live-Gating“ genannt. Der Vorteil liegt darin, dass auch in einer heterogenen Probe die ausschließliche Analyse einer bestimmten Probe durchgeführt werden kann. Eine Verfälschung der Ergebnisse infolge einer Kontamination durch andere Zellen kann daher vermieden werden.

Färbung für die Durchflusszytometrie:

Es werden je 1ml der separierten Zellen ( Gesamtzellzahl s.o. ) in ein FACS-Röhrchen pipettiert und die Zellen mit PBS gewaschen ( 3min. / 1500Upm ). Der Überstand wird dekantiert , 20µl IgG-Lösung ( Pentaglobin 5mg/ml in Puffer / unspezifisch bindende Fc-Rezeptoren werden blockiert ) und 100µl FACS-Puffer werden zugeben. Nach einer Inkubationsphase von 5min. werden die spezifischen Antikörper ( AK ) nach Angaben des Herstellers hinzupipettiert. Das Pipettierschema ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Des weiteren wird eine Vollblutprobe für die durchflusszytometrische Untersuchung vorbereitet. Hierzu werden 100µl Vollblut mit dem spezifischen AK ( s. Tab.2 ) versetzt und für 15min. inkubiert. Anschließend werden 100µl CAL-Lyse-Lösung hinzugeben ( Erythrozyten werden lysiert ) und 10min. inkubiert. Nach Zugabe von 2ml Aqua dest. und einer Inkubationsphase von 5min. wird 5min. bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird dekandiert und das Pellet in 250µl Puffer aufgenommen.

Tab. 2: Verwendete mAK zur Markierung der Proben ( Vollblut / MNC / GZ )

10 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Folgende Antikörper werden eingesetzt:

CD3: CD3 ist ein mit dem T-Zell Rezeptor assoziierter Komplex und ist ein allgemeiner T-Zellmarker

CD8: CD8 ist ein T-Zellmarker

CD14: CD14 ist der Rezeptor für LPS und kommt hauptsächlich auf Makrophagen und Granulozyten vor

CD16: CD16 ist der Fcγ RIIIa Rezeptor und kommt auf NK-Zellen, Granulozyten und Maktophagen vor

CD19 : CD19 ist ein B-Zellmarker

Die Messung der jeweiligen Proben erfolgt am Durchflusszytometer, wobei die gespeicherten Daten mit einer speziellen FACScan Software ( WinMDI 2.8 ) ausgewertet werden.

2.3 FACS ( Fluorescence-Activated Cell Sorter )

Mit Hilfe des Zellsorters können aus einer Zellsuspension einzelne Zellpopulationen aufgrund geeigneter Auswahlparameter ( z.B. Größe / Fluoreszenz ) sortiert werden. Das Prinzip und der generelle Aufbau entspricht hierbei dem des Durchflusszytometers ( 2.2 ). Die mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern, an denen die Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind, markierten Zellen werden durch die hydrodynamische Fokussierung des „Hüllstroms“ einzeln an dem Laser vorbeigeführt. Die hierbei generierten Signale ( Größe; FSC / Fluoreszenz; FL1, FL2, FL3 etc. ) leiten je nach Wahl des Parameters den Sortiervorgang ein. Beim Verlassen des Probestroms aus der „Auslassdüse“ geht dieser in eine Tropfenbildung über. Wenn jetzt die Düse durch Anlegen einer definierten Frequenz in Vibration versetzt wird, kann mit hoher Präzision die Tropfengröße und der Abstand der einzelnen Tropfen variiert werden ( „Dropdelay“ ). Jeder dieser Tropfen enthält nur eine Zelle. Befindet sich nun die zu sortierende Zelle in diesen Tropfen, wird durch Anlegen einer Spannung der Tropfen polarisiert, die genau dann von der Düse durch den Flüssigkeitsstrahl geschickt wird, wenn der Strahl sich in Tröpfchen auflöst. Die so geladenen Tropfen können aus der Hauptrichtung der Tröpfchen abgelenkt werden, wenn sie zwischen Platten entgegengesetzter Ladung hindurchfallen. Eine negativ geladene Platte zieht positiv geladene Tropfen an und umgekehrt. Auf diese Weise lassen sich aus einer gemischten Zellpopulation spezifische Subpopulationen von Zellen abtrennen, die sich aufgrund der Bindung von markierten Antikörpern unterscheiden. Die Reinheit der Sortierung kann dadurch gesteigert werden, indem nur der Tropfen polarisiert wird, bei dem im vorausgehenden und folgenden Tropfen keine Zelle enthalten war. Eine so gesteigerte Sortierreinheit geht mit einer Reduktion der Sortiereffizient einher.

11 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Die im Einfriermedium ( 25ml RPMI / 25ml FCS / 5ml DMSO (10%) ) im Stickstofftank gelagerten mononukleären Zellen aus dem Knochenmark ( Normalspender-KM HM ( 21 y ) vom 03.09.03 / T13 E8 L / Pos 13 ) werden zunächst zügig unter schwenken bei 37°C im Wasserbad aufgetaut. Die Zellen werden anschließend in 100µl PBS 50% FCS überführt und 20µl IgG-Lösung ( 10mg/ml ) hinzupipettiert. Es folgt die Zugabe der spezifischen Flourochrom-gekoppelten AK nach Herstellerangabe. Das Pipettierschema ist in Tabelle 3 zusammengefasst. Nach einer Inkubationphase von 30min. auf Eis wird 1mal mit PBS gewaschen ( Zentrifugation für 5min. / 1200Upm ) und das Pellet in 300µl Medium mit Propidiumjodid resuspendiert ( Propidiumjodid kann nur durch die Membranen geschädigter Zellen diffundieren, bzw. es kann bei toten Zellen nicht aktiv aus der Zelle transportiert werden und interkaliert mit DNA, so dass nach Anregung Licht roter Wellenlänge emittiert wird / lebend-tot Diskriminierung ).

Tab. 3: Verwendete mAK zur Markierung

Folgende Antikörper werden eingesetzt:

CD3: CD3 ist ein mit dem T-Zell Rezeptor assoziierter Komplex und ist ein allgemeiner T-Zellmarker

CD16: CD16 ist der Fcγ RIIIa Rezeptor und kommt auf NK-Zellen, Granulozyten und Maktophagen vor

CD19 : CD19 ist ein B-Zellmarker

CD34: CD 34 ist ein Marker für CD34+ Vorläuferzellen im Knochenmark

Es wird bei dieser Versuchsanordnung mit zwei Anregungslasern gearbeitet ( Laser 1: 200mW / 488nm; Laser 2: 250mW / 647nm ) und die jeweiligen Langpass-und Kurzpassfilter werden entsprechend den Emissionsmaxima der Fluorochrome postiert.

12 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

2.4 Zytospin und MGG-Färbung

Mittels Zytospin wurden die separierten mononukleären Zellen und Granulozyten ( 2.1 ) auf Objektträger gebracht und anschließend automatisiert mit dem May-Grünwald-Giemsa-Reagenz gefärbt ( MGG-Fäbung ). Die MGG-Färbung, auch Pappenheim-Färbung genannt, ist die meist verwendete Färbung für Blut- und Knochenmarkausstriche. Es handelt sich um ein Gemisch von Methylenblau (färbt saure Zellbestandteile blau), Methyl-Azur (färbt basische Zellbestandteile rot-violett) und Eosin (färbt basische Zellbestandteile orange-rot). Da alle Zellbestandteile gefärbt werden, nennt man diese Färbung auch panoptisch. Da der pH-Wert ausschlaggebend für das färberische Verhalten ist, führt eine pH-Verschiebung der Lösung zu einer falschen Farbreaktion. Der optimale pH-Wert liegt bei 6.5-6.8. In der May-Grünwald-Giemsa-Färbung werden RNA, Zytoplasma und Nukleolen blau, DNA und Primärgranula rot-violett sowie Hämoglobin und die Granula der Eosinophilen orange-rot gefärbt.

2.5 Single-Cell PCR

Die Polymerasen-Kettenreaktion ( Polymerase Chain Reaction ) ist eine Technik, mit der jedes beliebige DNA-Stück sehr schnell in vitro amplifiziert werden kann. Die DNA wird unter geeigneten Bedingungen mit dem Enzym DNA-Polymerase und spezifischen kurzen DNA-Stücken, Primer genannt, inkubiert. Innerhalb weniger Stunden können Milliarden Kopien eines DNA-Fragmentes hergestellt werden.

Bei der Single-Cell PCR wird die Amplifikation anhand einer einzelnen Zelle, die zuvor mit Hilfe des FACS sortiert worden ist ( 2.4 ), initiiert. Um die Effizient der Amplifikation zu steigen, werden zwei aufeinander folgende PCR-Reaktionen durchgeführt. Eine besonders sorgfältige und saubere Durchführung ist hierbei besonders von Bedeutung, um Kontaminationen zu vermeiden.

2.5.1 Amplifikation des C-MPL Rezeptorgens

Von der am FACS sortierten Single-Cell DNA der Patienten 350 / 358 / 486 wird jeweils das Exon 11+12 des C-MPL Rezeptorgens amplifiziert ( 688bp ). Hierzu wird zunächst 3µl H 2 O zu der in 7µl Medium suspendierten DNA gegeben ( DNA-Konzentration: 100ng/10µl ).

13 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Primäre PCR:

Für die primäre PCR wird ein MasterMix wie folgt für 5 Ansätze pipettiert:

Es werden 4 Ansätze ( 350 / 358 / 486 + Kontrolle ) mit je 10µl des Mastermixes in Eppendorf Reaktionsgefäße pipettiert und mit Öl beschichtet. Das PCR-Programm wird gestartet und nach 10min. bei 95°C wird die Taq-Polymerase ( MasterMix 2 )zugegeben ( Hot Start / Tm=58°C / 3x60`` / 40 Zyklen ).

MasterMix 2 ( für 5 Ansätze ):

Das PCR-Produkt wird auf einem 1%igen AgaroseGel aufgetragen und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht analysiert.

2.5.2 Amplifikation des G-CSF Rezeptorgens

Von den Proben P16 ( 380 / 381 / 382 / 383 / 384 + 1 positiv Kontrolle + 1 negativ Kontrolle ), sowie von den Proben PB14 ( 1 / 2 / 3 / 4 / 5 ) wird ein Teil des G-CSF Rezeptorgens amplifiziert. Parallel wird von CD34+ Proben das Exon 4 amplifiziert, wobei das Produkt der primären PCR, als auch der sekundären PCR auf das 1%ige AgaroseGel analysiert wird.

Primäre PCR:

Für die primäre PCR wird ein MasterMix wie folgt für 8 Ansätze pipettiert:

14 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Tab. 4: MasterMix für die primäre PCR

PCR-Programm:

10x 66°C 15`` 15`` 15``

40x 62°C 15`` 15`` 15``

Sekundäre PCR:

Tab. 5: MasterMix für die sekundäre PCR

PCR-Programm: s.o.

2,5µl des primären PCR-Produkts werden pro Ansatz zu den 22,5µl des MasterMixes 2

zugegeben und das Produkt der sekundären PCR wird auf einem 1%igen AgaroseGel

aufgetragen und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht analysiert.

PCR-Ansätze für die CD34+ Proben:

PCR-Programm:

10x 60°C 60`` 30`` 60``

40x 60°C 60`` 30`` 60``

15 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

3. Ergebnisse

3.1 Durchflusszytometrische Untersuchung der separierten Zellen

3.1.1 Analyse der Vollblutprobe

Die Vollblutprobe ( Probe 1 Tab.2 ) wurde mit Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten monoklonalen Antikörpern ( mAK ) markiert. In Abb. A sind die Events, welche vom Forward Scatter ( FSC ) detektiert wurden in einem Histogram aufgeführt. Wie in 2.2 beschrieben, gibt der FSC Informationen über die Größe der detektierten Zell. In B ( Abb. 2 ) ist das Vorwärtsstreulicht ( FSC ) gegen das Seitwärtsstreulicht ( SSC, side scatter ) illustriert. Es lassen sich aufgrund der beiden Parameter ( Größe / Granularität ) Aussagen über die im Vollblut enthaltenen Zellpopulationen, unabhängig von der Fluoreszenz treffen. So sind in B deutlich vier Zellpopulationen erkennbar, die jeweils in unterschiedlichen Regionen unterteilt sind ( R2-R5 ). In R5 ( hellblau ) sind demnach die ca. 8-10µm großen Lymphozyten gezeigt, die aufgrund ihres Zellkern-Plasma Verhältnisses ein geringes Seitwärtsstreulicht erzeugen. In R3 ( lila ) sind die Monozyten aufgeführt, die verhältnismäßig große Zellen, ca. 15-20µm, darstellen. Granulozyten befinden sich in R2 ( grün ). Diese ca. 8-14µm große Zellen lassen sich unterteilen in neutrophile, basophile und, in R4 dargestellt, eosinophile. Die eosinophilen besitzen große ( ca.1µm ) Granula, die das charakteristische Seitwärtsstreulicht erzeugen.

Abb.2: A=Histogramm;B/C=DotBlots der mittles Durchflusszytometer analysierten Vollblutprobe.In B ist

der FSC gegen den SSC aufgetragen. So sind 4 Zellpopulationen differenzierbar. R2=Granulozyten;

R3=Monozyten; R4=basophile.

16 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

In FL1-H wird die Fluoreszenz von FITC, welches an dem mAK gegen CD3, einen T-Zellmarker, gekoppelt ist und von PE, gekoppelt an mAK gegen CD19, einen B-Zellmarker, in FL2-H dargestellt. Anhand der spezifisch markierten Zellen lassen sich die Lymphozyten unterteilen in B-Lymphozyten, R1, und T-Lymphozyten, R2. In R3 sind Autofluoreszenzen der Granulozyten erkennbar.

3.1.2 Analyse der MNC

Die separierten mononukleären Zellen ( 2.1 ) wurden mit mAk gegen CD3 ( T-Zellmarker ) und gegen CD8 ( Marker für zytotoxische T-Lymphozyten ) markiert ( Tab.2;Probe8 ). Wie aus den Abbildungen B und C ( Abb.3 ) hervorgeht, sind die Subpopulationen voneinander unterscheidbar. So sind in R1 die T-Zellen aufgezeigt und in R2 die zytotoxischen T-Lymphozyten.

Abb.3 : A=Histogramm;B/C=DotBlots der mittles Durchflusszytometer analysierten MNC.In B ist der FSC

gegen den SSC aufgetragen. So sind 2 Zellpopulationen differenzierbar. R1=T-Zellen; R2=zytotoxische T-

Lymphozyten

3.2 Zytospin-Analyse

Anhand der zellulären Morphologie und der charakteristischen Färbung, lassen sich die zellulären Bestandteile des Immunsytems differenzieren.

Die Granulozyten enthalten zahlreiche Lysosomen und Sekretionsvesikel ( Granula ) und werden anhand der Morphologie und der Anfärbeeigenschaften dieser Organellen in drei Untergruppen gegliedert. Das ungleiche Verhalten gegenüber Farbstoffen spiegelt die

17 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Unterschiede ihrer Funktionen wider. Neutrophile ( Abb.4 C ) sind die am weitesten verbreitete Granulozytentyp. Sie phagozytieren und zerstören Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und sind somit an der angeborenen Immunität gegenüber bakteriellen Infektionen beteiligt.

Basophile ( Abb. 4 D ) scheiden Histamin aus und wirken bei Entzündungsreaktionen mit. Sie ähneln in ihrer Funktion stark den Mastzellen, die in Bindegewebe sitzen, aber ebenfalls von den hämatopoetischen Stammzellen gebildet werden. Eosinophile helfen bei der Bekämpfung von Parasiten und modulieren allergische Entzündundsprozesse.

Sobald die Monozyten ( Abb. B ) den Blutstrom verlassen haben, reifen sie zu Makrophagen, die phagozytierende Eigenschaften besitzen.

Die Lymphozyten ( Abb.4 A ) gliedern sich in zwei Untergruppen, die beide an Immunreaktionen beteiligt sind: B-Lymphozyten und T-Lymphozyten.

Abb.4 : Mit dem May-Grünwald-Giemsa-Reagenz gefärbter ( MGG-Fäbung ) Blutausstrich. Zytoplasma und Nukleolen sind blau, DNA und Primärgranula rot-violett sowie Hämoglobin und die Granula der Eosinophilen orange-rot gefärbt. In A sind Lymphozyten erkennbar: 8-10µm, runder dunkelvioletter Kern, sehr schmales hellviolettes Zytoplasma. In B ist ein Monozyt (umgeben von Erythrozyten) zu sehen: 15-

20µm, nierenförmig gelappter Kern,Zytoplasma grau-bläulich mit sehr feinen rosa Granula. C zeigt neutrophile: 8-14µm, der Zellkern ist durch Einschnürungen segmentiert. In D ist ein basophiler Granulozyt erkennbar: große, schwarzviolette Granula. E zeigt neutrophile und bsaophile.

18 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

3.3 Single-Cell PCR

3.3.1 Amplifikation des C-MPL Rezeptorgens

Von der am FACS sortierten Single-Cell DNA der Patienten 350 / 358 / 486 wird jeweils das Exon 11+12 des C-MPL Rezeptorgens amplifiziert ( 688bp ). Das Produkt der primäre / sekundären PCR wird auf einem 1%igen AgaroseGel, nach anfärben mit Ethidiumbromid, unter UV Licht analysiert.

Abb.5 :Agarose-Gelbild ( 1% ) des PCR-Produktes nach der sekundären PCR. Aufgetragen wurden: M=Marker; K=Kontrolle; 350/358/486=Proben. Bei den Probenansätzen sind bei 688bp jeweils Banden zu erkennen.

Wie aus der Abb.5 ersichtlich, wurde das Exon 11+12 des C-MPL Rezeptorgens erfolgreich amplifiziert. Bei den Proben 350 / 358 / 486 ist jeweils eine Bande bei 688bp ( Vergleich mit Marker ) zu erkennen.

3.3.2 Amplifikation des G-CSF Rezeptorgens

Abb.6 : Agarose-Gelbild ( 1% ) verschiedener PCR-Produkte. M=Marker; Negativkontrolle (-); Positivkontrolle (+); Proben PB14+ ( 1-5 ) und P16+ ( 380-384 ) nach sekundärer PCR; die CD34+ sowohl nach der primären (p.PCR ), als auch nach der sekundären PCR.

19 Einführung in die Labortechniken in der Hämatologie / Onkologie

Von den Proben P16 ( 380 / 381 / 382 / 383 / 384 + 1 positiv Kontrolle + 1 negativ Kontrolle ), sowie von den Proben PB14 ( 1 / 2 / 3 / 4 / 5 ) wird ein Teil des G-CSF Rezeptorgens amplifiziert. Parallel wird von CD34+ Proben das Exon 4 amplifiziert, wobei das Produkt der primären PCR, als auch der sekundären PCR auf das 1%ige AgaroseGel analysiert wird ( Abb.6 ). Wie aus Abb. ersichtlich wird, hat bei einigen der Proben PB14+ ( 3 / 4 / 5 ) und P16+ ( 382 / 383 / 384 ) die Amplifikation funktioniert. Bei den Proben PB14+/2 und P16+/380/381 ist lediglich ein „Schmier“ erkennbar. Bei den Ansätzen der CD34+ Proben ist weder nach der primären, noch nach der sekundären PCR das Exon 4 amplifiziert worden.

4. Diskussion

Die Versuche, die während des einwöchigen Praktikums durchgeführt wurden, dienten der Einführung der Labortechniken, wie sie in der Abteilung „Pädiatrische Hämatologie und Onkologie“ durchgeführt werden. Es sollte gezeigt werden, wie man mit Hilfe moderner molekularbiologischer Methoden Mutationen in bestimmten Rezeptorgenen ( C-MPL / G-CSF ) detektieren kann. Da u.a. diese Rezeptoren entscheidend, durch ihre Ligandbindung, an der Hämatopoese beteiligt sind, haben mögliche Mutationen in diesen Genen weitreichende Folgen. So kommt es z.B. bei der schweren kongenitale Neutropenie (CN) zu einem Reifungsstop myeloischer Vorläuferzellen im Knochenmark auf Ebene der Promyelozyten und Myelozyten, aufgrund verschiedenster Mutationen im G-CSF-Rezeptor Gen. Da sowohl die CN, als auch CAMT präleukämische Syndrome darstellen, sind diese Erkrankungen von besonderem Interesse.