Zusammenfassung

Ziel der Doktorarbeit war es, möglichst schmerzfreie Monitoring-Verfahren zu entwickeln und entsprechende Probennahme-Systeme mit bioanalytischen Techniken zu kombinieren, um ein kontinuierliches Monitoring klinisch relevanter Metaboliten wie Glukose, Laktat und Ammonium bei stoffwechselkranken Kindern zu etablieren.

Ein kontinuierliches und simultanes Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe konnte durch die Kombination der “Mikrodialyse“ als Probennahme-System mit einem “Bioanalytischen Mikrosystem“ mit integrierten Biosensoren als Analysemethode ermöglicht werden. Durch den Einsatz des CMA-70 Mikrodialyse-Katheters, der ursprünglich für neurologische Untersuchungen entwickelt wurde, ist eine minimal-invasive Probennahme ohne lokale Anästhesie möglich. Bei einer Flussrate von 0,3 µl pro Minute konnte in-vitro

eine Wiederfindungsrate (in-vitro Recovery) für Glukose von nahezu 100 % erzielt werden. Sie ist definiert als die relative Konzentration des Analyten im Dialysat bezogen auf dessen Konzentration in der untersuchten Lösung. Die Wiederfindungsrate des untersuchten Analyten im Verlaufe einer in-vivo Messungen (relative Recovery) ist definiert als die relative Konzentration des Analyten im Dialysat bezogen auf dessen Konzentration im Plasma. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Recovery von Glukose im subkutanen Fettgewebe, in Abhängigkeit vom Körpermassen-Index (BMI) der untersuchten Probanden, stark variiert. Die relative Recovery von Glukose im subkutanen Gewebe nimmt mit zunehmendem BMI der Probanden ab. Wird jedoch der Quotient des Glukosegehalts im Plasma und im subkutanen Gewebe gebildet, so zeichnet sich sowohl bei den schlanken als auch bei den adipösen Probanden, für die Messzeit von bis zu sechs Stunden, ein relativ stabiler Verlauf der Kurve ab. Der Quotient liegt bei schlanken Probanden (n=4) im Mittel bei 1,1 ± 0,08, während er bei adipösen Probanden (n=4) im Bereich von 3,65 ± 0,44 liegt.

Sowohl die Höhe als auch der Verlauf des Quotienten Plasma/subkutanes Gewebe geben Aufschluss über die Versorgung des Gewebes und den Metabolismus von Glukose. Ein relativ stabiler Quotient im Verlaufe einer Untersuchung hat zur Folge, dass die gemessenen Glukosewerte im subkutanen Gewebe repräsentativ die Situation im Plasma widerspiegeln. Durch eine in-vivo Kalibration des Sensorsignals unter konstanten Bedingungen kann demzufolge von den Messwerten in subkutanen Gewebe, unabhängig von der relativen Recovery, auf die realen Glukosewerte im Plasma geschlossen werden. Die Erhöhung von Laktat im subkutanen Gewebe nach Glukose-Einnahme zeigt, dass Laktat nicht nur im Muskel, sondern auch im subkutanen Fettgewebe produziert wird und demzufolge eine bedeutende Rolle bei der Glukosehomöostase im Körper übernimmt. Eine gute Korrelation der Ergebnisse mit der Referenzmethode (CMA-Analysator) spricht für die Stabilität und die Zuverlässigkeit der Sensoren und ermöglicht den Einsatz des gekoppelten Systems in der medizinischen Forschung sowie in der klinischen Diagnostik.

Die Bestimmung von Ammonium mit einem “Bioanalytischen Mikrosystem”, welches in einem tragbaren Analysator mit Computer gesteuerten Spritzenpumpen integriert ist, ermöglicht ein “bedside-monitoring“ von Ammonium im Parotisspeichel. Durch die Integration der Probenumwandlung und der Detektion des Analyten im “Bioanalytischen Mikrosystem“ wird eine Reduktion des erforderlichen Reagenzien- und Probenvolumens ermöglicht und die Zuverlässigkeit der durchgeführten Analyse erhöht. Der Einsatz einer transparenten Sammelvorrichtung “Curby-Cup“ zur non-invasiven Gewinnung von Parotisspeichel ermöglicht eine schmerzfreie Probensammlung direkt aus der Glandula-Parotis.

IV

Zusammenfassung

Untersuchungen zur Flussratenabhängigkeit des Ammoniumgehalts im Parotisspeichel und dessen Vergleich mit dem Verhalten von Kalium weisen auf unterschiedliche Transportmechanismen der beiden einwertigen Ionen hin. Während sowohl Ammonium als auch Kalium bei Flussraten unter 0,2 ml/min mit steigender Flussrate und steigendem Probenvolumen abnehmen, erreicht Kalium bei Flussraten ≥ 0,2 ml einen konstanten Wert von 23,50 ± 3,03 mM, der Ammoniumgehalt sinkt dagegen mit zunehmender Flussrate weiterhin ab. Erst bei einer Flussrate ≥ 0,6 µl/min erhält man einen relativ stabilen Wert von 61,80 ± 13,34 der sich allmählich dem Plasmawert nähert.

Kalium, das im Parotisspeichel um einen Faktor von 5,8 über dem in der Literatur angegebenen Plasmawert (4,03 mM) liegt, wird offensichtlich aktiv in den Speichel transportiert, während Ammonium einem passiven Transport unterliegt. Kalium kann somit nicht als interner Standard (zur Bestimmung der Flussrate) bei der Ammoniummessung eingesetzt werden. Eine gute Korrelation des Ammoniumgehalts im Parotisspeichel und im Plasma kann offensichtlich nur erzielt werden, wenn eine hohe Flussrate von bis zu 1 ml/min erreicht und die zuerst gesammelte Speichelprobe verworfen wird.

Die Durchführung eines “oralen Aminosäure-Toleranz-Testes“ (oATT) bei gesunden Probanden zeigt jedoch auch bei hohen Flussraten keine sehr gute Korrelation. Dies kann dadurch erklärt werden, dass der Ammoniumgehalt im Plasma, durch die Aktivität der Leber konstant niedrig gehalten wird, während er im Speichel durch den erhöhten Abbau des in der Leber produzierten und ins Blut abgegebenen Harnstoffs ansteigt. Eine gute Korrelation von Ammonium im Parotisspeichel und im Plasma ist jedoch zu erwarten, wenn eine vergleichbare Untersuchung bei stoffwechselkranken Patienten durchgeführt wird, da in diesem Falle ein Ammonium-Anstieg im Plasma, der durch die verminderte Aktivität des Harnstoffzyklus in der Leber verursacht wird, voraussichtlich auch mit einem Anstieg des Ammoniumgehalt im Speichel korreliert ist.

V

Abstract

Continuous and simultaneous monitoring of glucose and lactate in subcutaneous adipose tissue has been realised through the combination of microdialysis with a “bioanalytical microsystem”.

The application of a small microdialysis catheter enables a minimum invasive sampling of the probe without anesthetization.

At a flow rate of 0.3 µl per minute an “in-vitro Recovery“ of about 100 % was reached.

However, the “relative Recovery“ of glucose in subcutaneous adipose tissue, defined as the relative concentration of the analyte in the dialysate based to the concentration in plasma, depends on the body-mass-index (BMI) of the volunteers.

The level and the course of the quotient from plasma glucose to glucose in subcutaneous tissue gives an insight into the different supply and metabolism of glucose in the tissue. If this quotient is stable through the whole investigation, the measured glucose concentration at the subcutaneous tissue reflects the situation in plasma. In this case it will be possible to make an ”in-vivo calibration” of the glucose sensor to conclude the real concentration of glucose in plasma independent to the “relative Recovery“.

The rise of lactate concentration in subcutaneous tissue after glucose ingestion indicates that lactate will be not only produced in muscle but also in subcutaneous adipose tissue, where it plays an important role in glucose homoeostasis.

There was a very good correlation of the sensor results and the results of a reference methode, which reflects the high reliability and stability of the sensors, and enables the application of the ”bioanalytical microsystem” in medical research and clinical diagnosis.

The detection of ammonia with a “bioanalytical microsystem” which is integrated in a portable analyser with computer controlled syringe pumps enables a bedside monitoring of ammonia in parotid saliva.

The integration of conversion of the probe and its detection with a biosensor within the ”bioanaytical microsystem” enables the reduction of reagent- and sample volume to 10 % of the volume necessary for the reference method and improves the reliability of the analysis. To evaluate a non-invasive painless method for the determination of ammonia in parotid saliva a transparent collection device “curby-cup” was used to collect the sample directly from the parotid gland.

Ammonia in parotid saliva is flow-dependent, it decreases at flow rates < 0,6 ml/min with increasing flow rates and approximate plasma levels at flow rates of about 1 ml/min. The ammonia content of saliva also decreases with the increase of the collected sample volume. To find a correlation of ammonia in plasma and parotid saliva it is therefore necessary to obtain a high flow rate and to discard the first collected probe before analysis. It has been concluded that saliva should be collected at flow rates greater than 1 ml/min and that the first probe (about 3 - 4 ml) should be discarded, to obtain marginal variation of ammonia concentration which approximates to plasma ammonia.

The content of potassium in parotid gland is also flow dependent, but it becomes constant at flow rates ≥ 0,2 ml/min and it does not reach plasma values. This results show that the

transport mechanisms of ammonia and potassium are different and that potassium could not be used as an internal standard for the flowdependent measurement of ammonia. At the performance of an ”oral amino-acid-tolerance-test” (OATT) with healthy volunteers, the ammonia level in plasma will be low, whereas the content in saliva increases on account of the increase of urea and its biodegradation.

It is assumed that at patients with liver desease or urea cycle disorder a correlation between plasma ammonia and ammonia in saliva will be found after increasing the amino acid metabolim.

VI

Inhaltsverzeichnis

1.  Einleitung  1

1.1  Biosensoren  1

1.2  Monitoring-Systeme zur Bestimmung metabolischer Stoffwechsel-Parameter  5

1.3  Stand der Technik  5

1.3.1.  Implantation von Biosensoren.  5

1.3.2  Kontinuierliche Probennahme-Systeme.  6

1.4  Anwendungsbereiche der Mikrodialyse.  9

1.5  In-vivo Recovery unter Anwendung der Mikrodialyse  10

1.5.1  No-net-flux-Methode  10

  ,  11

1.5.2.  Zero-flow-Methode  

1.5.3  Near-Equilibrium-Dialyse.  11

1.6  Diabetes mellitus  12

1.6.1  Der Typ I Diabetes.  12

1.6.2  Der Typ II Diabetes.  12

1.6.3  Komplikationen und Spätfolgen des Diabetes mellitus  13

1.7  Hyperammonämie  14

1.7.1  Harnstoffzyklus.  14

1.8  Ziel der Arbeit  16

2.  Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe  18

2.1  Material  19

2.1.1  Chemikalien  19

2.1.2  Pufferlösungen  19

2.1.3  Geräte.  20

2.1.4  Verbrauchsmaterial  20

2.2  Methoden.  21

2.2.1  Bioanalytisches Mikrosystem  21

2.2.2  Mikrodialyse  28

2.2.3  Kombination der Mikrodialyse mit dem “Bioanalytischen Mikrosystem“  29

2.2.4  Referenzmessung mit dem CMA-600-Analysator.  30

2.2.5  Bestimmung des technischen Delays der Glukose- und Laktatmessung  32

2.2.6  Bestimmung der Wiederfindungsrate des Analyten (Recovery) unter Einsatz des  

  CMA-70 Mikrodialyse-Katheters  33

2.2.7  Monitoring von Glukose- und Laktat im subkutanen Gewebe und Bestimmung der  

  Plasmawerte  35

VII

Inhaltsverzeichnis

3.  Ergebnisse.  37

3.1  Kalibration der Sensoren.  37

3.2  Bestimmung des technischen Delays für Glukose und Laktat.  39

3.2.1  Berechnung des technischen Delays der Sensorergebnisse  39

3.2.2  Berechnung des technischen Delays der CMA-Ergebnisse  40

3.2.3  Experimentelle Bestimmung des technischen Delays der Sensordaten  41

3.3  Bestimmung der relativen Recovery.  42

3.3.1.  Relative Recovery in-vitro in Abhängigkeit von der Flussrate.  42

3.3.2  Relative Recovery in-vitro bei konstanter Flussrate  43

3.3.3  Bestimmung der in-vivo Recovery mit der “zero-flow-Methode“  45

3.4  Bestimmung von Glukose im subkutanen Gewebe und im Plasma  47

3.4.1  Physiologisches Delay der Glukosemessung im subkutanen Gewebe.  47

3.4.2  Relative Recovery der mit dem Sensor ermittelten Glukosewerte im subkutanen  

  Gewebe bezogen auf die Plasma-Glukose-Werte  48

3.4.3  Kinetik der Plasmawerte im Vergleich zu den Sensor Ergebnissen  49

3.4.4  Quotient Plasmaglukose zu Glukose im subkutanen Gewebe  50

3.4.5  Korrelation der relativen Recovery mit dem BMI der Probanden  50

3.5  Simultane Bestimmung von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe.  51

3.5.1  Korrelation der Sensorergebnissen mit den Plasmawerten  52

3.5.2  Korrelation der Sensorergebnisse mit der Referenzmethode.  53

3.6  Vergleich der Glukosemessung abdominal und antebrachial  55

3.6.1  In-vitro Assay zur Untersuchung der Fluidikprobleme bei Messungen von Glukose  

im  subkutanen antebrachialen Gewebe.  56

4.  Diskussion.  58

5.  Etablierung einer non-invasiven Ammoniakmessung im  

  Speichel und dessen Bestimmung mit einem Glutamatsensor  63

5.1  Material  66

5.1.1  Chemikalien  66

5.1.2  Pufferlösungen  67

5.1.3  Geräte.  68

5.1.4  Verbrauchsmaterial  68

VIII

Inhaltsverzeichnis

5.2  Methoden.  69

5.2.1  Amperometrische Bestimmung von Ammonium mit dem Glutamatsensor  69

5.2.2  Ammonium-Assay  70

5.2.3  Absorptionsspektrum des Co-Enzyms NADPH  71

5.2.4  Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor.  72

5.2.5  Spritzenpumpen  75

5.2.6  Gewinnung von Parotisspeichel.  82

6.  Ergebnisse.  83

6.1  Absorptionsspektren des Co-Enzyms NADPH.  83

6.2.  Bestimmung der GLDH-Aktivität mit dem Photometer.  84

6.2.1  Kalibration der GLDH mit dem Photometer.  86

6.3  Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor  87

6.3.1  Flussratenabhängigkeit des Glutamatsensors.  87

6.3.2  Einfluss von 2-Oxoglutarat auf den Glutamatsensor  88

6.3.3  Effekt von 2-Oxoglutarat auf die GLOD-Aktivität.  89

6.3.4  Variation von 2-Oxoglutarat im Photometer-Assay.  90

6.3.5  Variation von NADPH im Photometer-Assay  92

6.3.6  Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der GLDH-Aktivität  93

6.4  Evaluierung des Ammonium-Assays mit dem Glutamatsensor unter Einsatz der  

  Spritzenpumpen  95

6.4.1  Berechnung des Totvolumens der Messapparatur  95

6.4.2  Verschleppungen von Glutamat im Sensor.  98

6.4.3  Verschleppung der Glutamat-Dehydrogenase im Messsystem.  98

6.4.4  Präzisionstest der Spritzenpumpen  99

6.5  Vergleich des Ammonium-Assays innerhalb und außerhalb des  

  Mikrosystems.  102

6.5.1  Ammoniumkalibration innerhalb des Mikrosystems  102

6.5.2  Ammoniumkalibration im Reagenzglas.  102

6.6  Einfluss von endogenem Glutamat auf den Ammonium-Assay.  103

6.6.1  Einfluss von endogenem Glutamat auf den Photometer-Assay  104

6.6.2  Einflusses von endogenem Glutamat auf den Sensor-Assay  105

6.7  Reproduzierbarkeit des Ammonium-Assays  107

6.8  Bestimmung der Wiederfindungsrate von Ammonium im Sensor-Assay.  108

6.9  Korrelation der Sensorergebnisse mit der Referenzmethode.  109

IX

Inhaltsverzeichnis

6.10  Evaluierung einer möglichen Korrelation von Ammonium im Speichel  

  und im Plasma.  110

6.10.1  Ammoniumgehalt der Speichel- und Plasmaproben.  111

6.10.2  Ammonium-und Kaliumgehalt des Parotisspeichels in Abhängigkeit  

  von der Flussrate  112

6.10.3  Vergleich von Ammonium und Kalium im Parotisspeichel  114

6.10.4  Korrelation des Ammoniumgehalts im Speichel und im Plasma.  115

6.10.5  Ammonium- und Kaliumgehalt im Parotisspeichel in Abhängigkeit von der  

  Flussrate und der gesammelten Probenmenge  116

7.  Diskussion.  118

8.  Kapitel-übergreifende Diskussion und Ausblick.  121

9.  Anhang.  123

9.  1 Abkürzungen und Symbole.  123

9.2  Zusammensetzung der beim oralen-Aminosäure-Toleranz-Test eingesetzten  

  Aminosäuremischung der SHS-Gesellschaft  124

9.3  Massenwirkungsgesetz.  125

10.  Literatur  126

X

1. Einleitung

Biochemische Parameter für die Diagnose physiologischer Abnormitäten werden normalerweise in diskreten Proben analysiert, wobei die biochemische Analyse gewöhnlich in medizinischen Laboren mit spezifischen, meist sehr teuren Geräten durchgeführt wird. Hierbei geht vom Zeitpunkt der Probennahme bis zum Vorliegen des Untersuchungsergebnisses für Mediziner und Patienten oft wertvolle Zeit verloren. Außerdem können lange Standzeiten der Proben das Ergebnis verfälschen.

Die Entwicklung von Analysemethoden, die ein kontinuierliches Monitoring von Körperflüssigkeiten in der Klinik oder zu Hause ermöglichen, ist daher von großem Interesse für die klinische Diagnostik. Sie ermöglichen die Erfassung von Messwert-Änderungen innerhalb kurzer Zeitintervalle, die bei der Gewinnung diskreter Proben übersehen werden könnten.

Der Einsatz von Biosensoren, gekoppelt mit einem miniaturisierten, kontinuierlichen Probennahme-System liefert realisierbare und kostengünstige Voraussetzungen für ein reproduzierbares “on-line-bedside“ Analyse-System.

1.1 Biosensoren

Ein Biosensor besteht im Wesentlichen aus zwei Komponenten, einem biologischen Rezeptor, der die spezifische Erkennung des Analyten ermöglicht, sowie einem Signalwandler, dem 1,2 . Transducer. Beide Elemente zusammen ergeben den Biosensor

Die Biokomponente bestimmt die Selektivität des Sensors, die entweder auf einer Affinität zum Analyten (Antikörper), oder aber auf einer katalytischen Umsetzung des Analyten durch 3 . Enzyme beruht

Das dadurch entstehende Signal wird auf einen “Transducer“ übertragen, der die Wandlung des Signals in eine physikalisch messbare Größe ermöglicht.

Als “Transducer“ kommen optische, elektrochemische, mechanische oder kaloriemetrische 4 . Technologien zur Anwendung

Abb. 1 Schematische Darstellung eines Biosensors

1

Einleitung

5 Eingesetzte Komponenten zur Herstellung von Biosensoren

Tab. 1 Biokomponenten zur Herstellung von Biosensoren

Die meisten in der Literatur beschriebenen Biosensoren beruhen auf einer enzymatischen Katalyse des Analyten. Die Enzyme können aus Mikroorganismen wie Pilzen und Bakterien 6 . gewonnen und aufgereinigt werden

Meist setzt das entsprechende Enzym nur den Analyten um, einige Enzyme benötigen jedoch eine weitere Komponente, ein sogenanntes Co-Substrat. Bei diesen Reaktionen kann entweder die Zu- bzw. Abnahme eines Produktes oder aber die Zu- bzw. Abnahme des Co-Substrates detektiert werden.

Die Wahl des Detektors ist abhängig von deren Sensitivität sowie der Anwesenheit störender Substanzen in der zu analysierenden Matrix.

Am häufigsten werden optische- und elektrochemische “Transducer“ eingesetzt. Optische Methoden haben, durch das spezifische Absorptionsverhalten verschiedener Analyten oder Co-Substrate, den Vorteil hoher Selektivität, während die Sensitivität limitiert ist. Elektrochemische Sensoren zeigen dagegen eine sehr hohe Sensitivität, hier stellen jedoch Störungen durch Interferenzmoleküle ein Problem dar, das durch Modifikation der Elektroden 7 . reduziert werden kann

Die Detektion eines Analyten durch elektrochemische Sensoren kann entweder potentiometrisch, konduktometrisch oder amperometrisch erfolgen:

Bei der potentiometrischen Messung wird die Änderung des Potentials einer Probenlösung

8 , während bei der konduktometrischen Messung die Änderung der ohne Stromfluss bestimmt

9 . Leitfähigkeit bestimmt wird

Beim Einsatz von amperometrischen Biosensoren wird die zu detektierende Substanz direkt 11,12 an inerten Elektroden umgesetzt und so ein elektrischer Strom oder über Mediatoren

generiert, welcher in bekannter Relation zur Analytkonzentration steht. Die Amperometrie beruht auf der Messung eines bei konstantem Potential generierten Stromes an der 13 . Der Strom resultiert aus einer elektrochemischen Oxidation oder Arbeitselektrode Reduktion einer elektroaktiven Spezies.

2

Biosensoren

V = Volt

I = Strom

I=0

V A

¹⁴ Abb. 2 Vereinfachte Darstellung eines Potentiostaten für eine Drei-Elektroden-Konfiguration nach A.Cass

Zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode, die den Stromkreis schließt, wird das für die gewünschte Reaktion erforderliche Potential angelegt.

Eine dritte, potentiometrisch (d.h. ohne Stromfluss) betriebene Referenzelektrode mit konstantem Potential kontrolliert den Betrag der Potentialdifferenz zwischen Arbeitselektrode und Messlösung. Die elektronische Schaltung, die als Potentiostat bezeichnet wird, regelt nun die zwischen Arbeits- und Gegenelektrode angelegte Spannung auf einen Wert, bei dem die gemessene Potentialdifferenz zwischen Arbeits- und Referenzelektrode dem vorgegebenen Wert entspricht.

Biosensoren sind im Vergleich zu klassischen analytischen Messgeräten kompakte und mobile Analysesysteme, die eine preisgünstige, schnelle und kontinuierliche Erfassung verschiedener Parameter vor Ort ermöglichen.

Der Bedarf an biochemischen Sensoren wächst ständig. Dabei stehen Anwendungen in der 15,16 , der Biotechnologie 17,18 sowie im Umweltbereich 19 und in der Lebensmittel-Medizin 20 im Vordergrund. Analytik

Der derzeit am meisten untersuchte physiologische Parameter ist Glukose, das im Mittelpunkt der Diabetesforschung steht.

Laktat ist ein biochemischer Indikator des anaeroben Metabolismus von Patienten. Es besteht eine negative Korrelation zwischen der Laktatkonzentration im Blut und der 21 . Durch Zunahme der Glykolyse verbunden mit Sauerstoffmangel Sauerstoffversorgung

kommt es zur Erhöhung des Laktats im Gewebe und im Blut, Laktat ist daher ein interessanter Parameter für die Sportmedizin, außerdem ist Laktat bei der Diagnose von Infarkten und 22,23,24 . Durch das Monitoring von Laktat ist die frühzeitige Schock von großem Interesse

Erkennung eines Sauerstoffdefizits im Gewebe und damit eine präventive Intervention 25 . Laktat steigt bei erhöhter Ketoazidose diabetischer Patienten, durch verstärkte möglich 26 . NADH-Freisetzung, bei verstärkter Verstoffwechslung von Fettsäuren, ebenfalls an

3

Einleitung

27 entwickelt. Das hier realisierte Der erste Glukosesensor wurde 1962 von Clark et al.

Messprinzip beruht auf der Messung der Sauerstoffabnahme, welcher als Co-Substrat der Glukose-Oxidase fungiert. Die Reduktion von O 2 erfolgt hierbei bei einem konstanten Potential von - 0,7 Volt. Später wurde die Glukosekonzentration eines Analyten durch das 28 . Monitoring des bei dessen Oxidation gebildeten Wasserstoffperoxids bestimmt

Ein kontinuierliches und zuverlässiges Monitoring von Glukose, Laktat und anderen wichtigen metabolischen Parametern wie Glutamin, Glutamat und Ammonium sind von großer Bedeutung für die medizinische Diagnostik und stellen eine große Herausforderung für Forschungsgruppen und Mediziner dar.

Für Patienten mit Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes mellitus oder Harnstoffzyklus-Störungen würde der Einsatz von miniaturisierten und kontinuierlich messenden Analysegeräten zu Hause eine enorme Verbesserung der Lebensqualität bedeuten. Voraussetzung dafür ist jedoch ein kontinuierlicher Kontakt des Sensors mit der Matrix, was mit zwei verschiedenen Methoden erreicht werden kann:

- direkte Messung der entsprechenden Parameter innerhalb des Körpers durch die Implantation eines Sensors

- Kombination eines biokompatiblen, kontinuierlichen Probenahme-Systems mit dem Analysesystem

Ein direkter Einsatz von Sensoren im Blut kann zur Agglutination des Blutes führen, während 29 . es in anderen Kompartimenten zu Wundreaktionen und Entzündungen kommen kann Außerdem ist eine Messung der absoluten Konzentration des interessierenden Analyten über einen längeren Zeitraum nicht zuverlässig, da eine “in-vivo Kalibration“ des Sensors nicht möglich und eine Änderung der Sensitivität des Sensors sowie eine Drift des Nullpunkts nicht 30 . auszuschließen ist

Um derartige Komplikationen zu vermeiden, wird in der folgenden Arbeit die Mikrodialyse als bindendes Glied zwischen dem Körper und dem Sensor eingesetzt. Das Material dieses Systems ist biokompatibel und schließt durch eine semipermeable Membran große Moleküle aus, so dass die Messung der Probe im Biosensor ohne Aufarbeitung durchgeführt werden kann.

Die Verwendung eines “Multi-Biosensors“ in Kombination mit der Mikrodialyse ermöglicht ein lückenloses Monitoring metabolisch wichtiger Parameter wie Glukose, Laktat, Glutamin und Glutamat während Operationen oder bei der Intensiv-Überwachung stoffwechselkranker Patienten. Hier ist eine zuverlässige und einfache Analyse kritischer Stoffwechselparameter mit minimalem Zeitverlust (Lag-Phase) zwischen der Probennahme und dem Ergebnis der Messung unerlässlich. Auch für die Einstellung der Insulingabe bei Insulin abhängigen Diabetespatienten ist ein Langzeit-Monitoring von Glukose von großer Bedeutung. Für die Selbstüberwachung dieser Patienten ist ein einfaches portables System erforderlich, das die gewonnene Probe ohne Aufarbeitung analysiert und die Ergebnisse unmittelbar verarbeitet und anzeigt.

Eine kontinuierliche Glukosemessung zur Stoffwechselkontrolle bei Diabetes mellitus ist ein herausragendes Ziel der aktuellen Diabetesforschung. Durch eine Kopplung des Glukosesensors mit einer Insulinpumpe wäre es möglich, die Kontrolle und Einstellung der Diabetespatienten zu automatisieren, wodurch eine enorme Verbesserung der Lebensqualität der einzelnen Personen erreicht werden könnte.

4

Monitoring-Systeme

1.2 Monitoring-Systeme zur Bestimmung metabolischer Stoffwechsel-Parameter

Ein kontinuierliches Monitoring metabolischer Parametern ist von großem Interesse für die biomedizinische Forschung sowie für die klinische Diagnostik in der Humanmedizin. Die derzeit routinemäßig angewandten Untersuchungsmethoden zur Bestimmung der Metaboliten im Plasma sind oft schmerzhaft für den Patienten, laborintensiv und teuer, es sind wiederholt diskrete Probennahmen und ein geschultes Labor-Personal erforderlich. Die so erhaltenen Messdaten liefern außerdem nur eine Momentaufnahme der physiologischen Bedingungen.

Die Realisierung eines kontinuierlichen Monitoring-Systems für die Analyse wichtiger Stoffwechselparameter wie Glukose, Laktat und Ammonium könnte das Risiko einer Stoffwechselentgleisung bei betroffenen Patienten drastisch senken. Der Einsatz von elektrochemischen multifunktionellen Biosensoren bietet die Möglichkeit eines simultanen Monitorings und liefert kontinuierliche oder zirkadiane Profile der interessierenden Metaboliten.

Das Prinzip der Messung beruht im Wesentlichen auf der Oxidation des Analyten durch die entsprechenden Oxidasen, die auf der Oberfläche einer Elektrode immobilisiert vorliegen, und der amperometrischen Bestimmung des dabei gebildeten Wasserstoffperoxids bei konstantem Elektroden-Potential.

Ein kontinuierliches in-vivo bzw. ex-vivo Monitoring der betreffenden Analyten erfordert jedoch den ungehinderten Zugang zu einer für den Metaboliten repräsentativen Körperflüssigkeit.

Dieser kann durch verschiedene non-invasive bzw. minimal-invasive Methoden erzielt werden, deren Anwendung in mehreren Arbeitsgruppen intensiv untersucht wird und bis dato noch mit großen Schwierigkeiten verbunden ist.

1.3 Stand der Technik

31, 32, 33, 34 1.3.1. Implantation von Biosensoren

Die Implantation von Biosensoren als eine potentielle Möglichkeit zur Durchführung eines invivo Monitorings ist limitiert durch die Stabilität der Sensorsignale innerhalb des Gewebes, 30 . Eine sowie durch Wundreaktionen im Körper nach der Implantation der Sensoren Verunreinigung der Elektroden während einer Messung kann zur Reduktion der Sensor- ³⁵ .Um dies zu vermeiden entwickelten Prof. Vadgama und seine Sensitivität führen

36,37,38 einen mit Puffer durchspülten Glukose-Sensor (open-mikroflow), bei Arbeitsgruppe

welchem mit einer konstant niedrigen Flussrate Puffer vom Sensor in Richtung der Analytlösung gepumpt wird. Hierdurch werden Moleküle mit großem Volumen (Proteine) daran gehindert auf der Elektrode zu adsorbieren. Die Menge des Analyten die den Sensor erreicht wird dabei allerdings ebenfalls reduziert, wodurch die Sensitivität des Sensors indirekt herabgesetzt wird.

Um eine Schätzung der absoluten Konzentration des interessierenden Analyten durch einen implantierten Sensor über einen längeren Zeitraum durchführen zu können, ist eine “in-vivo Kalibration“ des Sensors erforderlich. Diese ist bei Diabetes-Patienten jedoch problematisch; 39 . da keine stabile Gleichgewichtslage (steady state) zu erwarten ist

5

Einleitung

Um die mit der Implantation eines Biosensors beschriebenen Schwierigkeiten zu umgehen ist die Kombination eines ex-vivo gelegenen Biosensors mit einem minimal-invasiven Probennahme-System sinnvoll.

1.3.2 Kontinuierliche Probennahme-Systeme

Die kontinuierliche Gewinnung von Proben aus dem vaskulären System, aus dem Interstitium oder aus der Parotis-Speicheldrüse kann durch die Anwendung verschiedener minimalinvasiver bzw. non-invasiver Methoden erzielt werden.

Zu unterscheiden sind hierbei die Methoden der inversen Iontophorese die eine transkutane Probennahme ermöglicht, sowie der Mikroperfusion, der Ultrafiltration und der Mikrodialyse, die unter Anderem als subkutane Probennahme-Systeme eingesetzt werden können. Diese Systeme bieten einen minimal-invasiven Zugang zu den Körperflüssigkeiten und dienen als Anwendungs-Schnittstelle zwischen Sensor und Gewebeflüssigkeit.

Die Gewinnung von Parotisspeichel kann entweder durch das Einführen eines Katheters in den “Stenonschen Gang“ der Speicheldrüsen erfolgen, was jedoch ohne lokale Anästhesie nicht durchgeführt werden kann, oder durch eine non-invasive, schmerzfreie Sammlung des 40 . In der Parotisspeichels über eine auf der Speicheldrüse fixierte Saugvorrichtung vorliegenden Arbeit erfolgte die Gewinnung von Parotisspeichel durch eine transparente Sammelvorrichtung (Curby-Cup), die in Kapitel 5.2.6 ausführlich beschrieben wird.

1.3.2.1 transkutane Gewinnung der Probe

41 a.) mit Hilfe einer Vakuumpumpe (Saugmethode)

durch das Anlegen eines leichten Vakuums (400 mm Hg ) auf der Haut kann interstitielle Flüssigkeit gewonnen werden

- es können jedoch nur sehr geringe Probenvolumina gewonnen werden

- durch das angelegte Vakuum werden Rötungen der Haut verursacht

42 b.) unter Anwendung einer inversen Iontophorese (Gluko-Watch)

durch Anlegen eines geringen Stromes von 0,3 mA (für 3 Minuten) wird Glukose im Co- + -Ionenzu einer kathodischen Elektrode transportiert, die akkumulierte Transport mit Na

Glukose wird enzymatisch oxidiert, wobei H 2 O 2 freigesetzt wird. Nach 3 Minuten wird am elektrochemischen Biosensor eine Spannung von 0,42 mV angelegt und das H 2 O 2 wird oxidiert und amperometrisch gemessen. Danach beginnt der nächste Zyklus der Probensammlung.

-Kalibration des Sensors nur durch eine Blutmessung möglich (Finger-Stick-Test)

-Messung des Glukosegehalts der Probe erfolgt alle 20 Minuten bis zu maximal 12 Stunden

-Temperatur- und / oder Transpirationsänderungen können das Sensorsignal beeinträchtigen

6

Monitoring-Systeme

1.3.2.2 subkutane Gewinnung der Probe

43, 44, 45 a) unter Anwendung der offenen Mikroperfusion

ein Doppellumen-Katheter, der mit einer entsprechenden Einführnadel im untersuchten Gewebe platziert werden kann, wird über das Innenvolumen (0,1 mm I.D.) mit Hilfe einer

Spritzenpumpe (1-4 µl/min) mit Lösung gespült, das äußere Volumen (0,2 mm I.D.) ist mit 24

Löchern versehen, hier findet die Äquilibrierung der Perfusionslösung und der Analyten statt, der Katheter wird mit einer Peristaltikpumpe gekoppelt, die den Fluss aufrecht erhält; der Analyt gelangt über einen Doppellumen-Katheter in den Stromfluss des Probennahme- Systems und wird von dort weitergeleitet bis zum Sensor, der außerhalb des Gewebes platziert ist.

- die Sensorkalibration und die Messung des Analyten erfolgen ex-vivo

- eine Änderung der Recovery; sowie der Flussrate kann nicht ausgeschlossen werden

- eine permanente Kontrolle der Recovery ist unabdingbar, und muss mittels parallel durchgeführter Messung der elektrischen Leitfähigkeit ermittelt werden

- beim Einsatz des Katheters in der Vene kann es zu Verstopfungen kommen

- Störungen der Messungen durch Luftblasen sind nicht auszuschließen

46, 47 b) unter Anwendung der Ultrafiltration

Diese ermöglicht die Gewinnung von Probe durch eine semipermeable Membran, wobei die treibende Kraft durch einen Unterdruck im Sammelgefäß realisiert wird. Eine kleine hohle Faser (4 cm lang, ID 0,24 mm; AD 0,29 mm) wird im Gewebe platziert und mit einem Auslassschlauch verbunden, an dem ein Unterdruck (z.B. mit einer Monovette) erzeugt wird.

Die Bestimmung des Analyten erfolgt mit einem elektrochemischen Biosensor der in einem Fließ-Injektions-Analysator integriert ist.

- die Wiederfindungsrate ist 100 % und nicht Flussraten abhängig

- geringes Probenvolumen im Interstitium führt zur Reduktion der Flussrate

- Anlagerung von Proteinen auf der Oberfläche des Katheters führen zur Reduktion des Signals bzw. der Recovery

Ist das Probenvolumen der zu untersuchenden Gewebeflüssigkeit minimal, wie zum Beispiel im Gehirn oder im subkutanen Gewebe, so ist die Mikrodialyse die Methode der Wahl.

7

Einleitung

^48,49,50 c) Mikrodialyse

Die Mikrodialyse ist ein Probennahme-System, das auf der Diffusion löslicher Moleküle im Gewebe durch eine semipermeable Membran entlang eines Konzentrationsgradienten basiert. Die semipermeable Membran stellt die Kontaktfläche zur untersuchten Körperflüssigkeit dar und setzt daher eine hohe Biokompatibilität voraus. Da sie in Abhängigkeit ihres spezifischen Ausschlussvolumens (cut off) die Diffusion großer Moleküle verhindert, ermöglicht sie eine gewisse Selektion der Moleküle im Dialysat.

Gewebe

Das Perfusat, eine mit dem Blut isotone Lösung, wird über den Einlass-Schlauch des Mikrodialyse-Katheters mit Hilfe einer kontinuierlich transportierenden oder pulsierenden Pumpe (Pulsvolumen 0,5 µl) durch die semipermeable Dialysemembran gepumpt. Über den Auslass-Schlauch des Katheters wird das Dialysat gewonnen, das mit Molekülen der untersuchten Probe (z.B. dem Interstitium) angereichert ist.

Die “relative Recovery“ der interessierenden Analyten ist definiert als der prozentuale Anteil im Dialysat, bezogen auf die Konzentration des Analyten in der originalen Körperflüssigkeit (Plasma). Die “absolute Recovery“ ist definiert als die absolute Menge des Analyten bezogen 51 . Die Recovery ist abhängig vom Material und der Größe der auf ein Zeitintervall

semipermeablen Membran, sowie von der Flussrate der Perfusionslösung. Je höher die Flussrate, desto niedriger ist die “relative Recovery“, während die “absolute Recovery“ steigt. Die “relative Recovery“ ist direkt proportional zur Oberfläche der Dialysemembran.

8

Mikrodialyse

1.4 Anwendungsbereiche der Mikrodialyse

Mikrodialyse kann außer im Gehirn sowohl intravenös als auch subkutan eingesetzt werden. Bei der intravenösen Anwendung ist eine Heparinzugabe erforderlich, um die Agglutination der Probe zu vermeiden, außerdem ist eine Blockade der Membran durch Makromoleküle nicht auszuschließen.

Alternativ dazu kann die Mikrodialysesonde subkutan eingesetzt werden. Dies ist einerseits für Moleküle sinnvoll, die durch Diffusion aus der Blutbahn ins subkutane Gewebe gelangen und die physiologischen Gegebenheiten des Blutes widerspiegeln, andererseits können mit dieser Methode lokale Veränderungen im untersuchten Gewebe analysiert werden.

Die Mikrodialyse ermöglicht ein kontinuierliches Monitoring physiologischer Parameter und eignet sich daher hervorragend für kinetische Experimente.

Die Sensitivität kinetischer Untersuchungen ist jedoch abhängig von der Flussrate der Perfusionslösung; wird diese zu langsam gewählt (< 1 µl/min), so ist es nach der herkömmlichen Methode schwierig, schnelle Änderungen zu erfassen, da die Analyse der Probe mit dem CMA-Analysator, einem speziell für Mikrodialyse-Anwendung entwickeltes Gerät zur Untersuchung kleiner Probenvolumina, eine bestimmte Mindestmenge an Dialysat erfordert. Bei zu hohen Flussraten (> 10 µl/min) nimmt das Signal stark ab und geht eventuell im Rauschen unter.

Wird die Mikrodialyse mit einem Biosensor gekoppelt, so kann auch bei niedrigen Flussraten ein kontinuierliches Monitoring ohne jeglichen Informationsverlust erfolgen.

Ein kontinuierliches Monitoring von Glukose im subkutanen Gewebe unter Anwendung der Mikrodialyse, gekoppelt mit einem Biosensor, wurde bislang in der Arbeitsgruppe von Prof. 52 Cammann der Universität Münster durchgeführt

Hierbei wurde ein CMA-60 Mikrodialyse-Katheter (Membranlänge 30 mm) verwendet, die Probe wurde mittels eines elektrochemischen Biosensors unter Einsatz der zwei Elektroden-Methode gemessen. Das Perfusat wurde mit einer Minimed-Pumpe in programmierbaren Zeitintervallen in den Katheter gepumpt. Die Äquilibrierung des Analyten erfolgte über 10 Minuten im “stop-flow-Modus“ der Pumpe, wodurch eine 100 %ige Recovery erreicht wurde. Beim nächsten Bolus wurde das Dialysat in den Sensor gepumpt. Das Sensorsignal konnte somit nur alle 10 Minuten abgelesen und die entsprechende Glukosekonzentration berechnet werden.

Die Insertion des CMA-60 Mikrodialyse-Katheters mit der entsprechenden Injektionsnadel (A.D. 1,4 mm, Länge 54 mm) ist jedoch sehr schmerzhaft und kann zur Ausbildung von Entzündungen führen, ihre Anwendung in der Pädiatrie ist daher nicht zumutbar.

Perdomo et al. führten in-vitro Messungen in Serumproben, unter Anwendung eines CMA-20 Mikrodialyse-Kathetes (Membranlänge 10 mm), kombiniert mit einem amperometrischen Glukose- und Laktatsensor durch. Die Mikrodialysesonde befand sich hierbei vor dem Sensor-Chip, der Fluss wurde mit einer Peristaltik-Pumpe, die hinter der Sensoreinheit lokalisiert war, aufrecht erhalten. Ein Thermostat hielt die Temperatur im Sensor konstant bei 20 °C. Die in-vitro Messungen der Serum-Proben ergaben jedoch, im Vergleich zu den durchgeführten wässrigen Kalibrationsmessungen, eine höhere Reaktionszeit, was möglicherweise auf einen langsameren Austausch der Metaboliten entlang der 53 . Mikrodialysemembran zurückzuführen ist

9

Einleitung

Die Verwendung eines CMA-70 Mikrodialyse-Katheters zur Probengewinnung in der Pädiatrie hat sich bereits in früher durchgeführten Untersuchungen bewährt.

Baumeister et al. setzten den Katheter bei neugeborenen Kindern im subkutanen Gewebe ein und durchspülten ihn mit einer physiologischen Lösung bei einer Flussrate von 0,3 µl/min.

Das Perfusat wurde in Mikrogefäßen gesammelt und anschließend, unter Verwendung eines CMA-600-Analysators, der in Kapitel 2.2.4 ausführlich beschrieben wird, analysiert. Der Mikrodialysekatheter wurde im subkutanen Gewebe bis maximal sechzehn Tage bei uneingeschränkter Funktion verwendet. Eine Infektion der Einstichstelle konnte nicht ⁵⁴ . beobachtet werden

In der vorliegenden Arbeit wurde der CMA-70 Mikrodialyse-Katheter, der eine minimal- 55 , invasive Probennahme ermöglicht, mit einem “Bioanalytischen Mikrosystem“ kombiniert um ein zuverlässiges, simultanes Langzeit-Monitoring von Glukose und Laktat zu realisieren.

1.5 In-vivo Recovery unter Anwendung der Mikrodialyse

Da die Proben nicht direkt aus dem subkutanen Gewebe gewonnen werden, kann nicht angenommen werden, dass die gemessene Konzentration eines Analyten dem tatsächlichen Gehalt der Probe entspricht. Es ist daher erforderlich, die “in-vivo Recovery“ zu 56,57 . Sie ist definiert als der prozentuale Anteil des Analyten im Dialysat, bezogen bestimmen

auf das umgebende Medium und kann mit verschiedenen Methoden ermittelt werden.

58,59 1.5.1 No-net-flux-Methode

Hierbei erfolgt die Messung der Zu- oder Abnahme eines endogenen Moleküls “A“, während das gleiche Molekül in verschiedenen Konzentrationen der Perfusionslösung zugesetzt wird. Durch eine lineare Regression kann der Punkt ermittelt werden, bei welchem keine Diffusion stattfindet.

10

Mikrodialyse

60,61 1.5.2 Zero-flow-Methode

Die Dialysatkonzentration des interessierenden Analyten wird nach der Perfusion des Mikrodialyse-Katheters bei verschiedenen Flussraten bestimmt.

Unter Verwendung einer nichtlinearen Regression kann die extrazelluläre Konzentration des Moleküls bei einer Flussrate von Null errechnet werden.

62

1.5.3 Near-Equilibrium-Dialyse

Eine möglichst lange Dialysemembran und eine möglichst niedrige Flussrate erhöhen die Diffusionszeit der entsprechenden Moleküle und führen zu einer Recovery von bis zu 100 %

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Einleitung

1.6 Diabetes mellitus

Die Blutglukose-Homöostase wird sehr komplex und beim Stoffwechselgesunden in sehr engen Grenzen reguliert. Letztlich ist die Höhe des Blutzuckers das Ergebnis von anabolen und katabolen Prozessen, einschließlich der resorbierten Glukose aus der Nahrung. Steigt der Blutglukose-Spiegel z.B. nach einer Nahrungsaufnahme an, so erfolgt die Sekretion 63 . von Insulin durch die Pankreas, welches die Aufnahme von Glukose in die Zellen stimuliert Außerdem stimuliert Insulin die Glykogensynthese und die Speicherung von überschüssigem Brennstoff in Form von Fett.

Insgesamt begünstigt Insulin die Umsetzung der Glukose zu zwei Speichersubstanzen:

In der Leber und in den Muskeln wird Glykogen gebildet, während im Fettgewebe Triacylglyceride synthetisiert werden.

Diabetes mellitus entsteht durch einen Defekt der Produktion oder der Wirkung des Insulins.

Diabetes mellitus ist von der Weltgesundheitsorganisation als ein Zustand der chronischen Hyperglykämie, als Folge eines relativen, oder absoluten Insulinmangels, definiert. Eine Hyperglykämie liegt vor, wenn der Glukosegehalt im Blut im nüchternen Zustand 6,7 mM 64 . (120 mg/dl) oder postprandial 10mM (180 mg/dl) überschreitet

Die Verbreitung von Diabetes mellitus liegt in den USA und den westeuropäischen Ländern 65 etwa bei 5%. Allein in Deutschland leiden sechs Millionen an dieser Stoffwechselkrankheit

Es werden grundsätzlich zwei Typen des Diabetes mellitus unterschieden:

1. 2.

1.6.1 Der Typ I Diabetes

Tritt überwiegend im Kindes- und Jugendalter auf, und beruht auf einer genetisch 66 . Beim Typ I prädeterminierten Zerstörung der Insulin produzierenden B-Zellen der Pankreas Diabetes handelt es sich um eine Autoimmunkrankheit, die zum vollständigen Verlust der Insulinproduktion führt. Patienten mit Typ I Diabetes sind daher von einer kontrollierten Insulinzufuhr abhängig.

1.6.2 Der Typ II Diabetes

Tritt, familiär gehäuft, gewöhnlich erst jenseits des 40. Lebensjahres auf, und ist primär nicht Insulin abhängig. Bei den meist übergewichtigen Patienten liegt eine Störung der Sekretion und zellulären Wirkung von Insulin vor (Insulinresistenz der Zellen), was kompensatorisch zur Hyperinsulinämie führt. Ist die Kompensation der B-Zellen erschöpft, kommt es zur 67 . Hyperglykämie

12

Diabetes Mellitus

Eine Hypoglykämie liegt vor, wenn der Blutzuckerspiegel unter 2,8 mmol/l (50 mg/dl) absinkt. Erste Symptome eines abfallenden Blutglukose-Spiegels sind Unwohlsein, Müdigkeit und Konzentrationsschwäche bis hin zu geistiger Verwirrung. Noch weiteres Absinken führt zu Koma, Krampfanfällen und - bei extremer Hypoglykämie- zum Tod.

Im Falle einer Hypoglykämie kommt es zur Aktivierung der Insulin-Antagonisten wie Adrenalin, Noradrenalin, Glukagon und Wachstumshormonen. Durch diese kontrainsulinären Hormone wird vermehrt Glykogen abgebaut und die Glukoneogenese aus entsprechenden Vorstufen gefördert. Diese Mechanismen laufen auch bei einem Diabetes Patienten ab, sind genügend Glykogenreserven vorhanden, so kann die Absenkung des Blutglukosespiegels kompensiert werden, überwiegt jedoch der medikamentös induzierte blutzuckersenkende Effekt von exogen gespritztem Insulin, so sind die Kompensationsmechanismen nur begrenzt 68 . wirksam und bald erschöpft

69 1.6.3 Komplikationen und Spätfolgen des Diabetes mellitus

Mikroangiopathie:

Kapillarenverengung, die zur Erblindung (Retinopathie), zu nekrotischen Veränderungen der Füße (Gangrän) und zur Schädigung des Nervensystems (Neuropathie) führen können.

Makroangiopathie:

Arteriosklerose die in Verbindung mit Hypertonie zu erhöhtem kardiovaskulärem Risiko führt.

Glukosurie:

Erhöhte Glukosewerte im Blut führen zu erhöhter Ausscheidung von Glukose im Urin, durch verstärkte Ausscheidung von Wasser und Elektrolyten kann dies zum Koma 70 . führen

Ketoazidose:

Durch einen kompletten Insulinmangel beim Typ I Diabetes kann Glukose nicht mehr in die Zellen aufgenommen werden, wodurch es zu erhöhter Lipolyse und dadurch zu 71,72 . Durch eine erhöhte erhöhtem Anteil an freien Fettsäuren im Blut kommt

Fettsäureoxidation kommt es zu einer Akkumulation von Acetyl-CoA in der Leber, das entweder in den Zitronensäurezyklus eintreten, oder in Ketokörper umgewandelt und in andere Gewebe transportiert werden kann. Dort werden die Ketonkörper schließlich oxidiert und liefern einen Großteil der benötigten Energie. Das Gehirn, das normalerweise bevorzugt Glukose als Brennstoff verwertet, kann sich anpassen und die Ketonkörper “Acetoacetat“ sowie “D-β-Hydroxybutyrat“ verwenden.

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Einleitung

1.7 Hyperammonämie

Ammoniak ist ein primäres Abbauprodukt der Aminosäuren (AS) und wird in allen Organismen gebildet. Der Abbau der AS erfolgt primär in der Leber, im Cytosol wird die Aminogruppe unter Einwirkung von Transaminasen auf 2-Oxoglutarat übertragen, wodurch Glutamat gebildet wird. Ein Teil des Glutamats wird in die Mitochondrien transportiert, wo durch die Aktivität des Enzyms Glutamatdehydrogenase (GLDH) Ammoniumionen freigesetzt werden, die direkt in den Harnstoffzyklus eingeschleust werden. Im Cytosol der Muskelzellen erfolgt der Transfer der Aminogruppe auf Pyruvat, wodurch Alanin gebildet wird, dies wird zur Leber transportiert, wo die Aminogruppe auf das Molekül 2-Oxoglutarat transferiert wird und Pyruvat freigesetzt wird. Die Reaktion wird von dem Enzym Alanin-Aminotransferase (ALT) katalysiert.

Bei dieser Reaktion wird Glutamat gebildet, das in die Mitochondrien transportiert wird. Das in den Muskeln gebildete Pyruvat aus der Glykolyse gelangt auf diesem Weg zur Leber, wo es für die Glukoneogenese verwendet werden kann.

In anderen Geweben wie z.B. dem Gehirn wird überschüssiges Ammonium auf Glutamat übertragen und zu Glutamin umgebaut, die Reaktion wird durch das Enzym Glutaminsynthethase katalysiert. Glutamin dient als ungiftige und neutrale interzelluläre Transportform, da es Zellmembranen leicht passieren kann. Es wird über die Blutbahn in die Leber transportiert, hier setzt das Enzym Glutaminase Ammonium frei, das dabei entstehende Glutamat kann wiederum von der GLDH desaminiert werden, die freigesetzten Ammoniumionen werden über den Harnstoffzyklus entsorgt.

1.7.1 Harnstoffzyklus

⁷³ . (E = Enzym) Abb. 7 Schematische Darstellung des Harnstoffzyklus nach L.Stryer

14

Hyperammonämie

Der erste Schritt des Harnstoffzyklus findet in der mitochondrialen Matrix statt. Das durch die + reagiert mit oxidative Desaminierung von Glutamat durch die “GLDH“ freigesetzte NH 4 einem Molekül Hydrogencarbonat zu Carbamoylphosphat.

Die Reaktion wird von dem Enzym Carbamoylphosphat-Synthetase (E1) katalysiert, welches durch N-Acetyl-Glutamat stimuliert wird.

Das Carbamoylphosphat gibt nun seine Carbamoyl-Gruppe an Ornithin ab, wobei Citrullin gebildet wird.

Diese Reaktion wird von der Ornithin-Carbamyl-Transferase (E2) katalysiert. Das Citrullin wird nun aus der mitochondrialen Matrix ins Cytosol geschleust, wo die übrigen Reaktionen des Harnstoffzyklus stattfinden.

Die zur Harnstoffsynthese benötigte zweite Aminogruppe tritt in Form von Aspartat in den Zyklus ein. Die Überführung der Aminogruppe vom Glutamatpool in Aspartat erfolgt durch die Wirkung des Enzyms Aspartat-Transaminase, die sowohl im Cytosol als auch in den Mitochondrien lokalisiert ist.

Im nächsten Schritt des Zyklus kondensiert die Aminogruppe des Aspartats unter ATP-Verbrauch mit dem Carbamoylrest des Citrullins, diese Reaktion wird von der Argininsuccinat-Synthetase (E3) katalysiert, es entsteht Argininsuccinat. Es folgt die Spaltung des Argininsuccinats zu Arginin und Fumarat durch das Enzym Argininsuccinase (E4). Das bei dieser Reaktion entstehende Arginin ist die unmittelbare Vorstufe des Harnstoffs, über das Molekül Fumarat steht der Harnstoffzyklus mit dem Citrat-Zyklus (auch Tricarbonsäure-Zyklus genannt) in Verbindung.

Unter der Katalyse des Enzyms Arginase (E5) wird Harnstoff aus Arginin abgespalten und dadurch das am Anfang des Harnstoffzyklus stehende Ornithin regeneriert. Der gebildete Harnstoff diffundiert von der Leber in das Blut und wird von der Niere in den Harn ausgeschieden.

Man unterscheidet erworbene Hyperammonämien, die vorwiegend bei Erwachsenen auftreten und auf schweren Leberschädigungen zurückzuführen sind, von den angeborenen 74,75,76 . Stoffwechselstörungen, die meist auf Störungen des Harnstoffzyklus beruhen Als Ursache einer Hyperammonämie bei angeborenen Harnstoffzyklusstörungen treten Störungen der am Harnstoffzyklus beteiligten Enzyme auf, wie zum Beispiel:

- Mangel an Carbamylphosphat-Synthetase (E1) „CPS-Mangel“

- Mangel an Ornithin-Transcarbamylase

- Mangel an Argininsuccinat-Synthetase

- Mangel an Argininsuccinase

- Mangel an Arginase

Die Störungen führen zu einer abnorm hohen Ansammlung von Ammoniak im Blut sowie im Gewebe (primäre Hyperammonämie). Bei Neugeborenen treten bereits innerhalb der ersten 24 oder 48 Lebensstunden typische Symptome auf, wie Trinkschwäche, Erbrechen, abnorme Atmung, Lethargie, Krämpfe und Koma. Eine sekundäre Hyperammonämie tritt auf, wenn der Harnstoffzyklus durch das Auftreten anderer Stoffwechselerkrankungen beeinträchtigt ist.

Um eine Hyperammonämie zu verhindern ist bei diesen Patienten eine AS- arme Diät unerlässlich. Da jedoch zehn der AS essentiell sind, das heißt von Menschen nicht synthetisiert werden können, kann man diese durch die Gabe der Keto-Verbindungen der entsprechenden AS ersetzen. Durch Transaminierung können die essentiellen AS dann nach Bedarf aus den nicht essentiellen hergestellt werden, gleichzeitig wird vermieden, dass die 77 . nicht essentiellen AS ihre Aminogruppe ans Blut abgeben

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Einleitung

1.8 Ziel der Arbeit

Die Bestimmung verschiedener metabolischer Parameter in Körperflüssigkeiten wird routinemäßig in der medizinischen Diagnostik eingesetzt, wonach die dabei gewonnenen Resultate häufig als Basis für therapeutische Maßnahmen dienen. Die meisten der bisher verwendeten Methoden sind jedoch diskret und invasiv. So beruhen die derzeit angebotenen Methoden zur Messung des Blutzuckerverlaufs bei Diabetikern sowie die Bestimmung von Ammonium bei metabolischen Störungen des Harnstoffwechsels auf schmerzhaften Kapillarblutmessungen mit Analysegerätezeitkonstanten von einigen Minuten. Wegen ihrer geringen Anzahl von Messungen im Tagesverlauf gibt diese Methode nur ein grobes Abbild der tatsächlichen Situation wider, da schnelle Änderungen des Blutbildes nicht erfasst werden können.

Die Etablierung eines kontinuierlichen Messverfahrens zur Überwachung des Blutzuckers durch Kopplung von Biosensoren mit Mikrodialysesonden bietet die Möglichkeit zur Aufnahme eines kontinuierlichen Zeitprofils unter minimal-invasiven Bedingungen. Die Verwendung von Biosensoren für das “online Monitoring“ im klinischen Bereich stellt hohe Anforderungen an das komplette Messsystem, es sollte nicht nur robust, klein und handlich, sondern auch leicht zu bedienen sein. Biokompatibilität und Zuverlässigkeit sind 78 . weitere Voraussetzung für die klinische Anwendung

Eine alternative Bestimmung des Ammoniums im Parotisspeichel würde zu einer enormen Erleichterung in der klinischen Diagnostik führen, da die für Kinder oft schmerzhafte invasive Gewinnung der Blutproben durch eine non-invasive, schmerzfreie Methode ersetzt werden könnte. Die Bestimmung des Ammoniumgehalts im Parotisspeichel für die klinische Diagnose setzt jedoch eine Korrelation der Plasmawerte mit den Ammoniumwerten im Parotisspeichel voraus.

Ziel der Doktorarbeit ist es, minimal-invasive bzw. non-invasive Probennahme-Systeme mit bioselektiven Techniken zu kombinieren, um ein kontinuierliches Monitoring klinisch relevanter Metaboliten wie Glukose, Laktat und Ammonium bei stoffwechselkranken Kindern zu etablieren.

Im ersten Teil der Arbeit sollte das “Online-Monitoring“ von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe von gesunden Probanden mit unterschiedlichem Körpermassen-Index (BMI), durch die Kombination von Biosensoren mit einem Mikrodialyse-Katheter als Probennahme-System realisiert und optimiert werden.

Durch die Kopplung der beiden Systeme soll ein minimal-invasives Messverfahren entwickelt werden, das ein kontinuierliches Monitoring verschiedener Parameter im subkutanen Gewebe ermöglicht. Die Zeitkonstanten für das technische Delay des kombinierten Systems sollten ermittelt und optimiert werden.

Es sollte das Profil des Glukosegehalts im Verlauf eines “doppelten oralen Glukose-Toleranztestes“ (2oGTT) im abdominalen und antebrachialen subkutanen Gewebe mit dem Profil der Plasmawerte verglichen werden. Die Untersuchung der Kinetik von Glukose und Laktat im Verlaufe des 2oGTT sowie die Bestimmung der in-vivo Recovery und der relativen Recovery von Glukose sollte Aufschluss geben über die Perfusion und den Stoffwechsel des subkutanen Gewebes in Abhängigkeit vom BMI der Probanden.

Die Korrelation der Sensorergebnisse mit etablierten Referenzmethoden sollte ermittelt werden um die Zuverlässigkeit der gewonnenen Ergebnisse zu überprüfen.

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Ziel der Arbeit

Im zweiten Teil sollte die non-invasive Gewinnung von Parotisspeichel mit einer speziellen Sammel-Vorrichtung, dem Curby-Cup, bei gesunden Probanden durchgeführt und deren Ammoniumgehalt unter Einsatz eines Glutamat-Biosensors bestimmt und mit entsprechenden

Plasmawerten verglichen werden.

Hierzu sollte die Bestimmung von Ammonium mit einem amperometrischen Glutamat-Biosensor etabliert und optimiert werden. Unter Anwendung eines tragbaren Analysators mit integrierten Spritzenpumpen, sollte eine präzise Dosierung von Probe und Reagenzien sowie eine effektive Reinigung des Systems zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen erzielt werden.

Da der Ammoniumgehalt im Parotisspeichel mit steigender Flussrate abnimmt, sollte dessen Verhalten in Abhängigkeit von der Flussrate der gewonnenen Probe genauer untersucht und mit dem Verhalten von Kalium bei entsprechenden Flussraten verglichen werden. Kalium zeigt bei niedrigen Flussraten ebenfalls eine Abnahme der Konzentration mit zunehmender Flussrate, bei höheren Flussraten (> 0,2 ml) bleibt der Gehalt jedoch unabhängig von der Flussrate konstant. Es sollte daher festgestellt werden, ob sich das Ammoniumion, das die gleiche Ladung besitzt wie das Kaliumion, in gleicher Weise verhält. Dies hätte zur Folge, dass Kalium als interner Standard bei der Ammonium-Messung verwendet werden könnte, und eine zusätzliche Bestimmung der Flussrate im Parotisspeichel nicht erforderlich wäre.

Die erforderlichen Analysen für das Glukose- und Laktatmonitoring, sowie für die Bestimmung von Ammonium im Parotisspeichel wurden in enger Zusammenarbeit mit der Universitäts-Kinderklinik durchgeführt, in deren klinischem Labor verschiedene Referenzmessungen durchgeführt wurden.

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2. Monitoring von Glukose und Laktat im subkutanen Gewebe

Biochemische Parameter im Blut bzw. im Plasma können Aufschluss geben über die Regulationsmechanismen von Homöostase und das Ausmaß einer bestehenden Krankheit. Die Blutentnahme mit anschließender Analytik im Labor ist jedoch Patienten unfreundlich, laborintensiv und meist teuer. Außerdem können schnelle Änderungen eines interessierenden Metaboliten mit dieser Methode nicht erfasst werden.

Ein “in-vivo Monitoring“ der betreffenden Parameter mit einem “Bioanalytischen

Mikrosystem“ liefert dagegen schnelle und zuverlässige Ergebnisse ohne Informationsverlust. Ein kontinuierliches Monitoring der Blutbestandteile ist jedoch aufgrund der komplexen Zusammensetzung des Blutes mit einigen Schwierigkeiten verbunden.

Um eine Agglutination des Blutes zu vermeiden, muss sowohl intra- als auch extravaskulär Heparin zugesetzt werden. Endogene Moleküle (Enzyme) können die Zusammensetzung der Probe mit der Zeit verändern. Werden diese Moleküle auf Grund ihrer Größe durch eine semipermeable Membran zurückgehalten, kann dies zur Blockade der Membran führen. Ein alternatives Kompartiment zur Untersuchung physiologischer Parameter stellt das subkutane Gewebe dar, welches unter Einsatz eines Mikrodialyse-Katheters eine indirekte 79 . Die so gewonnene Probe kann ohne prä-Probennahme über Diffusionsvorgänge ermöglicht analytische Behandlung direkt im Sensor gemessen werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein kontinuierliches Monitoring von Glukose und Laktat im intakten subkutanen Gewebe durch die Kombination von amperometrischen Biosensoren mit dem Mikrodialyse-Katheter als Probennahme-System realisiert.

Durch Diffusion entlang der semipermeablen Membran wird die Dialyseflüssigkeit mit den interessierenden Metaboliten aus dem subkutanen Gewebe angereichert. Das Dialysat wird zum Sensor weitergeleitet, der eine quantitative Bestimmung der Metaboliten ermöglicht. Die Zusammensetzung des gewonnenen Dialysats liefert Informationen über den lokalen Metabolismus des untersuchten Gewebes und ermöglicht einen Vergleich mit den entsprechenden Plasmawerten.

Um eine Drainage der Probe zu verhindern und eine Recovery von bis zu 100 % zu erreichen, wurden die folgenden Untersuchungen bei einer Flussrate von 0,3 µl/min durchgeführt 47 .

Da der Verbrauch der Analyten im Sensor vernachlässigbar gering ist, kann die Probe nach der Messung im Sensor für eine Referenzmessung verwendet werden. Hierzu wurden die Proben nach der Messung im Sensor in “Microvials“ gesammelt. Als Referenzmethode wurde der CMA-600-Analysator der Fa. CMA (Schweden) verwendet.

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  Material  

2.1  Material  

2.1.1  Chemikalien  

2.1.1.1  Dextro OGT 300 ml Saft N1 La Roche  

2.1.1.2  Di-Natriumhydrogenphosphat 99 p.a. Fluka  

2.1.1.3  Glukose D( )-Monohydrat 99,5 p.a. Fluka  

2.1.1.4  Glukose Reagenz für den CMA-600-Analysator Axel Semrau  

2.1.1.5  Kalibrationslösung für den CMA-600-Analysator Axel Semrau  

2.1.1.6  Laktat Reagenz für den CMA-600-Analysator Axel Semrau  

2.1.1.7  L-Lactat Natrium-Salz 99 p.a. Fluka  

2.1.1.8  Natriumchlorid 99,5 p.a. Fluka  

2.1.1.9  Natrium-di-hydrogenphosphat 99 p.a. Fluka  

2.1.2  Pufferlösungen  

2.1.2.1  Elo Mel isoton Infusionslösung 500 ml (302 mosmol/l) Fresenius Kabi  

2.1.2.2  Jonosteril Infusionslösung 500 ml (291 mosmol/l) Fresenius Kabi  

2.1.2.3  Phosphatpuffer (PBS) mit 0,1M NaCl PH 7,4  

  Reagenzien Menge g/l Molarität  

  30,51 0,085  

12  Na HPO H O  

2   2

  2,045 0,015  

  NaH PO H O  

2   2

  NaCl 5,844 0,100  

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