DANKSAGUNG

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Zoologie der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Jürgen Markl angefertigt.

Herrn Prof. Dr. Jürgen Markl danke ich herzlich für die Überlassung des interessanten Themas und die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.

Der Firma BIOSYN (Fellbach) danke ich für die Bereitstellung der Hämolymphe.

Besonderer Dank gilt meinem Betreuer Dr. Wolfgang Gebauer für die äußerst kompetente und hilfsbereite Betreuung während der gesamten Arbeit. Auch danke ich ihm für die vielen anregenden Diskussionen zum Thema und für das Korrekturlesen meiner Arbeit.

Der gesamten Arbeitsgruppe bin ich sehr dankbar für die angenehme Atmosphäre und die große Hilfsbereitschaft bei allen kleineren und größeren Problemen.

Ein weiteres Dankeschön gilt Herrn PD Dr. Bernhard Lieb für die Zweitkorrektur dieser Arbeit.

Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich immer unterstützt haben und mir dieses Studium erst ermöglicht haben.

INHALTSVERZEICHNIS

I  INHALTSVERZEICHNIS  

II  ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS  

1  EINLEITUNG.  1

1.1  HÄMOCYANINE  1

1.2  MOLLUSKEN-HÄMOCYANINE  1

1.2.1  HÄMOCYANIN DER GASTROPODEN.  2

1.2.2  HÄMOCYANINE ANDERER MOLLUSKEN  4

1.3  ZIEL DER ARBEIT.  4

2  MATERIAL UND METHODEN  5

2.1  CHEMIKALIEN.  5

2.2  TIERMATERIAL  5

2.3  ULTRAZENTRIFUGATION.  5

2.4  PROTEINBESTIMMUNG  5

2.5  IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE.  6

2.5.1  PRINZIP.  6

2.5.2  DURCHFÜHRUNG  6

2.6  GELFILTRATION.  7

2.7  DIALYSE  8

2.8  ANALYTISCHE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PAGE)  8

2.8.1  SDS-PAGE (NACH LAEMMLI, 1970)  8

2.8.2  NATIVE-PAGE (NACH LAEMMLI, 1970)  9

2.9  ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE  11

2.10  ELEKTRONENMIKROSKOPIE  12

2.11  LIMITIERTE PROTEOLYTISCHE SPALTUNGEN.  12

2.12  AUFKONZENTRIERUNG VON PROTEINPROBEN  13

2.13  ZWEIDIMENSIONALE - IMMUNELEKTROPHORESE (NACH WEEKE, 1973)  13

2.13.1  CROSSED-LINE-IE (NACH KROLL, 1973A)  15

2.13.2  TANDE-MCROSSED-IE (NACH KROLL, 1973B)  16

I

INHALTSVERZEICHNIS

3  ERGEBNISSE.  17

3.1  PHOTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN AM GESAMT-HRH.  17

3.2  ELEKTROPHORETISCHE UNTERSUCHUNGEN AM GESAMT-HRH  18

3.3  TRENNUNG DER HRH-ISOFORMEN.  19

3.3.1  HPLC AUFTRENNUNG VON GESAMT-HRH.  19

3.3.2  UNTERSUCHUNG DER HPLC-FRAKTIONEN IN DER ZWEIDIMENSIONALEN  

IMMUNELEKTROPHORESE   19

3.3.3  UNTERSUCHUNG DER HPLC-FRAKTIONEN IN DER NATIVEN PAGE.  20

3.3.4  ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN DER HRH-ISOFORMEN.  22

3.3.5  UNTERSUCHUNG DER HRH-ISOFORMEN DURCH ZWEIDIMENSIONALE  

GELELEKTROPHORESE.   24

3.4  VERSUCHE ZUR AUFKLÄRUNG DER DOMÄNENSTRUKTUR VON HRH1.  25

3.4.1  LIMITIERTE PROTEOLYTISCHE SPALTUNG VON HRH1 MIT ELASTASE  25

3.4.2  LIMITIERTE PROTEOLYTISCHE SPALTUNG VON HRH1 MIT V8-PROTEASE  27

3.4.3  LIMITIERTE PROTEOLYTISCHE SPALTUNG VON HRH1 MIT TRYPSIN  32

3.4.4  ZUORDNUNG DER ISOLIERTEN HRH1-FUS ZUM ELASTASE-SPALTMUSTER VON HTH1  33

4  DISKUSSION  34

4.1  CHARAKTERISIERUNG DER ISOFORMEN HRH1 UND HRH2  34

4.2  ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE ANALYSEN  35

4.3  VERSUCHE ZUR AUFKLÄRUNG DER DOMÄNENSTRUKTUR VON HRH1.  36

5  ZUSAMMENFASSUNG  40

6  LITERATURVERZEICHNIS.  41

II

II ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

APS Ammoniumpersulfat BPB Bromphenolblau Da Dalton DTT Dithiotreitol EM Elektronenmikroskop FU functional unit Erdbeschleunigung (9,81m/s ² ) g h Stunde(n) HPLC High performance liquid chromatography HrH Haliotis rubra Hämocyanin HtH Haliotis tuberculata Hämocyanin IE Immunelektrophorese IEF Isoelektrische Fokussierung IEP Isoelektrischer Punkt kDa Kilodalton KLH Keyhole-Limpet-Hemocyanin (Hämocyanin von Megathura crenulata) l Liter M Mol/Liter min Minute(n) ml Milliliter mM Millimol/Liter nm Nanometer OD 280 Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 280nm PAG Polyacrylamid-Gel PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese SDS Sodiumdodecylsulfate (Natrium-dodecyl-sulfat) TEMED N,N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan UV Ultraviolett w/w Gewicht/Gewicht µl Mikroliter

1 EINLEITUNG

1.1 Hämocyanine

Hämocyanin ist das respiratorische Protein vieler Arthropoden und Mollusken. Obwohl die Arthropoden- und Mollusken-Hämocyanine den gleichen Namen tragen, und es sich bei beiden um extrazelluläre Kupferproteine handelt, sind sie nicht nah miteinander verwandt. Vielmehr weisen die Arthropoden- und Mollusken-Hämocyanine grundlegende Unterschiede in der Primär-, Tertiär- und Quartärstruktur auf und werden unterschiedlichen Protein-Superfamilien zugeordnet (Markl & Decker, 1992; van Holde & Miller, 1995; Lieb et al., 2001). Das Arthropoden-Hämocyanin besteht aus bohnenförmigen Untereinheiten zu je ca. 75kDa und liegt je nach Tierart als würfelförmiges Hexamer oder Multihexamer (bis zu 12x6) vor (Markl & Decker, 1992). Das Hämocyanin der Mollusken dagegen hat die Form eines Hohlzylinders und besteht aus einer oder mehreren dekameren Grundeinheiten. In meiner Arbeit untersuchte ich das Hämocyanin der marinen Schnecke Haliotis rubra aus der Ordnung Archeogastropoda und der Familie Haliotidae. Deswegen soll hier nur auf die Mollusken-Hämocyanine näher eingegangen werden.

1.2 Mollusken-Hämocyanine

Mollusken-Hämocyanine werden schon seit langem eingehend untersucht. Somit sind auch deren Aufbau und Funktion schon gut erforscht. Seinen Namen verdankt das Hämocyanin Léon Fredericq. Dieser isolierte im Jahre 1878 das blaue Pigment aus dem Blut eines Tintenfisches und taufte es aufgrund seines Vorkommens im Blut und seiner blauen Farbe, Hämocyanin (Blutblau) (Fredericq, 1878). Seine Untersuchungen ergaben, dass es sich dabei um ein Protein handelt, dass Sauerstoff transportiert. Mit einem Durchmesser von 35nm und einer Höhe von 18nm erreichen die Mollusken-Hämocyanine die Größe eines mittelgroßen Virus und sind damit die größten respiratorischen Proteine, die in der Natur vorkommen. Der Grundbaustein der Mollusken-Hämocyanine hat die Form eines Hohlzylinders und ist aus 10 immunologisch identischen Untereinheiten (Polypeptidketten) aufgebaut, wobei sich immer 2 Untereinheiten antiparallel zu Dimeren zusammenlagern (Orlova et al., 1997; Meissner et al., 2000). Die Untereinheit des Hämocyanins besitzt eine Molekularmasse von ca. 350-400kDa und besteht wiederum je nach Tierklasse aus sieben oder acht globulären, funktionellen Domänen (functional units,

FUs), die immunologisch sehr unterschiedlich sind. Vom N-Terminus zum C-Terminus werden die durch Linker-Regionen von ca. 10-15 Aminosäuren perlenschnurartig miteinander verknüpften FUs als FU-a bis FU-g bzw. FU-h bezeichnet. FU a-f bilden dabei im Dekamer die Wand des Hohlzylinders, FU-g und h bilden zusammen eine nach innen gerichtete Kragenregion, die bei Cephalopoden zentral, bei Gastropoden, Polyplacophoren und Bivalviern randständig auf nur einer Seite lokalisiert ist (van Holde & Miller, 1995; Terwilliger et al., 1988). Jede FU besitzt die Fähigkeit jeweils ein Molekül O 2 reversibel zu binden. Die Bindung des Sauerstoffs erfolgt an die Cu-Atome des aktiven Zentrums der jeweiligen FU. In jedem aktiven Zentrum sind zwei Cu-Atome enthalten, von denen jedes durch drei Histidinreste koordinativ gebunden ist (van Holde et al., 1992). Hämocyanin, das Sauerstoff gebunden hat, besitzt eine charakteristische blaue Färbung, die bei Verlust des Sauerstoffs auch wieder verschwindet.

Dadurch dass jede FU ein Molekül O 2 binden kann, kann ein Dekamer 80 Moleküle O ² binden. Die Tatsache, dass das Hämocyanin ein extrazelluläres Protein ist, macht diese hohe Sauerstofftransportkapazität nötig, um den kolloidosmotischen Druck der Hämolymphe niedrig zu halten. Eine weitere Zusammenlagerung zu Multidekameren oder Clustern ist wohl auch ein Mechanismus um diesen nur von der Teilchenzahl abhängigen Druck in Grenzen zu halten.

1.2.1 Hämocyanin der Gastropoden

Beim Hämocyanin der Gastropoden lagern sich nun zwei Dekamere mit ihren kragenlosen Enden zu einem aus 20 Untereinheiten bestehenden Didekamer zusammen (van Holde et al., 1992). Dieser Typ von Hämocyanin kommt beispielsweise bei der Weinbergschnecke Helix promatia vor (Lambert et al., 1995). Bei vielen Meeresschnecken findet man neben den typischen Didekameren auch noch unterschiedlich lange, tubuläre Multidekamere. Diese kommen dadurch zustande, dass sich an ein Didekamer von beiden Seiten unterschiedlich viele Dekamere, jeweils mit ihrer offenen, kragenlosen Seite anlagern (Markl et al., 1991; Harris et al., 1992; van Holde et al., 1992; Gebauer et al., 1994). Didekamere können sich aber auch zu unregelmäßigen Clustern zusammenlagern, die man neben solitären Didekameren und Multidekameren beispielsweise in der Hämolymphe der großen Schlüssellochschnecke Megathura crenulata findet (Gebauer et al., 1994).

Bei manchen Gastropoden-Hämocyaninen findet man verschiedene Isoformen. Dies wurde beispielsweise für die große Schlüssellochschnecke Megathura crenulata (englisch: keyholelimpet) und das Seeohr Haliotis tuberculata gezeigt ( Gebauer et al., 1994; Keller, 1994; Keller et al., 1999). Bei diesen nah verwandten Spezies wurden jeweils zwei Isoformen

gefunden, die als Keyhole-Limpet-Hemocyanin Typ 1 und Typ 2 (KLH1 und KLH2) bzw. Haliotis tuberculata Hämocyanin Typ 1 und Typ 2 (HtH1 und HtH2) bezeichnet wurden. Die Untereinheiten, aus denen Typ 1 und 2 bestehen, unterscheiden sich untereinander immunologisch, wobei sich KLH1 und HtH1 bzw. KLH2 und HtH2 entsprechen (Keller et al., 1999; Lieb et al., 1999). Beide Isoformen von KLH und HtH bestehen aus acht FUs (Gebauer et al., 1994; Gebauer et al., 1999; Keller et al., 1999; Lieb et al., 1999). Die Monomere vom Typ 1 bzw. Typ 2 bilden getrennte Dekamere; es wurden keine Hybridmoleküle gefunden, die gleichzeitig aus Typ 1- und Typ 2 Monomeren bestehen (Gebauer et al., 1994; Keller et al., 1999). Man hat auch festgestellt, dass das Hämocyanin vom Typ 1 bei Haliotis tuberculata nur als Dekamer oder Didekamer vorliegt (Keller et al., 1999). Bei Megathura crenulata tritt für Typ 1 noch eine weitere Aggregationsform auf, nämlich Didekamercluster (Gebauer et al., 1994). Die bei HtH beobachteten Tridekamere und bei KLH beobachten tubulären Multidekamere bestehen aus Untereinheiten vom Typ 2 (Gebauer et al., 1994, Keller et al., 1999).

Bei der marinen Gastropoden Aplysia californica dagegen wurde nur ein Typ Hämocyanin gefunden (Lieb et al., 2004). Diese Spezies hatte ihren letzten gemeinsamen Vorfahren mit Haliotis vor ca. 375 Millionen Jahren. Die Genduplikation die zur zweiten Hämocyanin-Isoform in Haliotis führte, geschah erst vor ca. 345 Millionen Jahren (Lieb et al., 2004).

Der Biosyntheseort des Hämocyanins bei Gastropoden sind die so genannten Porenzellen (Rhogocyten), die reich an rauem endoplasmatischen-Reticulum sind. Die Porenzellen sind molluskenspezifische Zellen, die verstreut im Bindegewebe verschiedener Körperteile liegen. Bei Megathura crenulata konnte aber selbst nach eingehender Untersuchung keine Hämocyaninexpression in diesem Zelltyp nachgewiesen werden (Albrecht et al., 2001). Als Grund hierfür wird vermutet, dass das Hämocyanin hier wahrscheinlich nur für kurze Zeit exprimiert wird, worauf wieder lange Phasen folgen, in denen keine Expression stattfindet (Harris & Markl, 2000). Bei Haliotis tuberculata konnten allerdings mittels Elektronenmikroskopie, immunhistochemischer Untersuchungen und durch in situ Hybridisierung unter Verwendung einer hämocyaninspezifischen cDNA Sonde auf Anhieb die Porenzellen als Biosyntheseort des Hämocyanins identifiziert werden (Albrecht et al., 2001).

Biomedizinisches Interesse speziell für das Keyhole-Limpet-Hemocyanin (KLH) besteht seit nun mehr als 30 Jahren (review zu KLH: Harris & Markl, 2000). Zu dieser Zeit wurden das erste Mal bei Experimenten an Tieren und Menschen die bemerkenswerten anregenden Eigenschaften des KLH auf das Immunsystem beobachtet (Weigle et al., 1964; Curtis et al., 1970, 1971; Herscowitz et al., 1972;). Wegen dieser Eigenschaften ist die KLH Untereinheit

heute in klinischen Produkten enthalten (BIOSYN Arzneimittel GmbH, Fellbach, Deutschland). Der Grund für diese stark anregende Wirkung auf das Immunsystem wird deutlich, wenn man den Aufbau des Hämocyanins betrachtet, denn aus immunologischer Sicht stellt das KLH mit seinen 16 immunologisch verschiedenen Domänen (acht je Isoform) ein stark antigenes Molekül dar. Nicht zu vergessen ist, dass es sich beim Hämocyanin um ein Glykoprotein mit bis zu 9% Polysaccharidanteil handelt (van Holde et al., 1992; Stoeva et al., 1999), was dessen Antigenität nochmals verstärkt. Diese Zuckeranteile sind beim KLH zum Teil strukturidentisch mit Kohlenhydraten auf der Oberfläche von Zellen von Harnblasenkarzinomen (Wirguin et al., 1995). Dadurch ist es nicht verwunderlich, dass KLH das Immunsystem ausgerechnet gegen diesen Tumortyp aktiviert (Olson et al., 1974; Jurincic et al., 1988).

1.2.2 Hämocyanine anderer Mollusken

Innerhalb der Molluskenklassen bestehen strukturelle Unterschiede im Aufbau des Hämocyanins. So bildet das Cephalopoden-Hämocyanin im Gegensatz zum Gastropoden-Hämocyanin symmetrische Dekamere mit einer zentral gelegenen Kragenregion. Diese Dekamere lagern sich nicht zu Didekameren oder anderen Aggregaten zusammen (Cuff et al., 1998). Die Untereinheiten können aus acht FUs, wie bei Sepia officinalis oder aus sieben FUs, wie bei Octopus dofleini bestehen (Miller et al., 1998). Als Syntheseort des Hämocyanins wurde bei Cephalopoden die paarige Branchialdrüse identifiziert.

Innerhalb der Bivalvier besitzen nur wenige Gruppen Hämocyanin (Terwilliger et al., 1988, van Holde & Miller, 1995). Die bisher analysierten Bivalvier-Hämocyanine liegen in Form von Di- und Multidekameren vor, die sich wie bei den Gastropoden mit der Kragenregion nach außen zusammenlagern.

1.3 Ziel der Arbeit

Im Rahmen dieser Bachelorarbeit sollte das Hämocyanin von Haliotis rubra, das bisher noch nicht untersucht wurde, charakterisiert werden. Dabei sollte unter anderem das Vorkommen verschiedener Isoformen, deren Aggregationsformen und Domänenstruktur untersucht werden. Die gewonnenen Erkenntnisse sollten dann mit der nah verwandten Schnecke Haliotis tuberculata verglichen werden, deren Hämocyanin schon gut charakterisiert ist. Die hauptsächlich verwendeten Methoden waren PAGE, Elektronenmikroskopie, HPLC und zweidimensionale-Immunelektrophorese.

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Chemikalien

Sämtliche verwendeten Chemikalien lagen in Analysen-Qualität vor und stammten von einer der folgenden Firmen: Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) oder Sigma Aldrich (Steinheim).

Zum Ansetzten sämtlicher Lösungen wurde, soweit nicht anders angegeben, nur destilliertes Wasser verwendet.

2.2 Tiermaterial

Als Ausgangsmaterial für die Untersuchungen diente Hämolymphe von Haliotis rubra. Die Hämolymphe war schon von Zellen und größeren Partikeln gereinigt und durch einen 0,1µm Filter sterilfiltriert. Das Material wurde bereitgestellt von der Firma BIOSYN in Fellbach (Deutschland).

2.3 Ultrazentrifugation

Zur Trennung des Hämocyanins von den noch vorhandenen restlichen Bestandteilen der Hämolymphe hat sich die Methode der Ultrazentrifugation bewährt. Da das Ausgangsmaterial schon durch die Firma BIOSYN von Zellen und größeren Bestandteilen gereinigt wurde, konnte man direkt durch Ultrazentrifugation des Ausgangsmaterials das Hämocyanin gewinnen. Dazu wurde die Hämolymphe in der Ultrazentrifuge Optima L-70 (Firma Beckmann (München)) bei ca. 60000g bei 4°C ü ber Nacht zentrifugiert. Das so entstandene Hämocyanin-Pellet wurde dann in Stabilisierungspuffer (0,05M Tris, 5mM CaCl 2 , 5mM MgCl 2 , 0,15M NaCl, pH 7,4) unter Schütteln (Schüttler) wieder resuspendiert. Diese so gewonnene Hämocyaninlösung diente als Ausgangsmaterial für die folgenden Experimente. In der weiteren Arbeit wird diese Hämocyaninlösung als Gesamt- Haliotis rubra Hämocyanin (Gesamt-HrH) bezeichnet.

2.4 Proteinbestimmung

Zur Bestimmung der Konzentration der so gewonnenen Hämocyaninlösung und auch alle folgenden Proteinkonzentrationsbestimmungen wurden mit dem UV/VIS-Spektrometer „ultraspec 3100 pro“ (Amershan Biosciences) durchgeführt. Dabei wurde die Absorption