II

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis   IV

Tabellenverzeichnis V   

Abk  ürzungsverzeichnis  VI

1.  EINLEITUNG  1

1.1  Cyanobakterien  1

1.2  Synechocystis sp. PCC 6803  3

1.3  Elektronentransportwege in Cyanobakterien  3

1.4  Enzyme des Wasserstoffmetabolismus  5

1.4.1  Die Nitrogenase  5

1.4.2  Die aufnehmende Hydrogenase  6

1.4.3  Die bidirektionale Hydrogenase  6

1.5  Eisen und Nickel in Cyanobakterien  8

1.6  Die Urease  9

1.7  Die Nitratreduktase  10

1.8  Verwendete Mutanten von Synechocystis sp.  10

2.  ZIELSETZUNG  12

3.  MATERIAL UND METHODEN  13

3.1  Arbeitsmaterialien  13

3.2  Kulturmedien und Lösungen  13

3.3  Anzuchtbedingungen  15

3.3.1  Eisenmangel  16

3.3.2  Nickelmangel  17

3.3.3  CO 2 -Mangel  17

3.3.4  Anaerobe Inkubation  17

3.3.5  Ausschalten der Nitratreduktase  18

3.4  Physiologische Methoden  18

3.4.1  Bestimmung der optischen Dichte  18

3.4.2  Bestimmung der Chlorophyllkonzentration  19

III

3.4.3  Wasserstoffmessung mit Hilfe der Clark-Elektrode  19

3.4.3.1  Messung der Hydrogenase-Gesamtaktivität  20

3.4.3.2  Messung der Wasserstoffaufnahme  21

3.4.3.3  Photowasserstoffmessung  21

3.4.4  Aktivitätsmessung der Urease  22

3.4.5  Messung der Lumineszenz  23

3.5  Proteinchemische Methoden  24

3.5.1  Bestimmung des Proteingehalts  24

3.5.2  Zellaufbruch für Ureaseaktivitätsmessung  25

3.5.3  Präparation von Gesamtmembranen  25

3.5.4  Blaue native Gele (BN-Gele)  26

3.5.5  Nitratreduktase-Nachweis  29

4.  ERGEBNISSE UND DISKUSSION  31

4.1  Eisenmangel  31

4.2  Nickelmangel  36

4.3  CO 2 -Mangel  40

4.4  Anaerobiose  43

4.5  Stickstoffversorgung und Wasserstoffaufnahme  45

5.  ZUSAMMENFASSUNG  53

6.  AUSBLICK  55

LITERATURVERZEICHNIS   56

DANKSAGUNG   64

IV

Abbildungsverzeichnis   

Abbildung  1.1: Vertreter der einzelnen Ordnungen von Cyanobakterien  

Abbildung  1.2: Phycobilisomen  

Abbildung  1.3: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Synechocystis sp.  

Abbildung  1.4: Schema der Elektronentransportwege in Synechocystis sp.  

Abbildung  1.5: Schematische Darstellung der bidirektionalen Hydrogenase  

Abbildung  1.6: hox-Operon von Synechocystis sp.  

Abbildung  1.7: Modell des aktiven Zentrums der NiFe-Hydrogenase  

Abbildung  4.1.1: Wachstum des WT mit verschiedenen Eisenkonzentrationen  

Abbildung  4.1.2: Vergleich der H 2 aseaktivität des WT in Abhängigkeit von  

der  Eisenkonzentration  

Abbildung  4.1.3: Wachstumsvergleich des WT und der lux-11-Mutante mit  

verschiedenen  Eisenkonzentrationen  

Abbildung  4.1.4: BN-Gel des WT  

Abbildung  4.1.5: Vergleich der H 2 aseaktivität des WT und der lux-11-Mutante in  

Abh  ängigkeit von der Eisenkonzentration  

Abbildung  4.1.6: Lumineszenz der lux-11-Mutante in Abhängigkeit von der  

Eisenkonzentration   

Abbildung  4.2.1: Wachstum des WT und der hupE-Mutante  

Abbildung  4.2.2: H 2 aseaktivität des WT und der hupE-Mutante  

Abbildung  4.2.3: Lumineszenz der lux-11-Mutante in Abhängigkeit von der  

NTA  -Konzentration  

Abbildung  4.3.1: Wachstum des WT und der lux-11-Mutante mit 2 CO 2  

Abbildung  4.3.2: Lumineszenz der lux-11-Mutante unter CO 2 -Mangel  

Abbildung  4.3.3: H 2 aseaktivität des WT und der lux-11-Mutante unter  

CO  2 -Mangel  

Abbildung  4.4.1: H 2 aseaktivität des WT und der lux-11-Mutante unter  

anaeroben  Bedingungen  

Abbildung  4.5.1: Wachstum des WT und der Ox-Mutante  

Abbildung  4.5.2: Durch Nitratreduktase entstandenes Nitrit  

Abbildung  4.5.3: H 2 aseaktivität des WT und der Ox-Mutante  

Abbildung  4 5 4: Schreiberkurven der Wasserstoffaufnahme  

Abbildung 4.5.5: Wasserstoffaufnahme des WT und der Ox-Mutante 50

Abbildung 4.5.6: Schreiberkurven der Photowasserstoffproduktion 51

Abbildung 4.5.7: Photowasserstoffproduktion des WT und der Ox-Mutante 52

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Konzentrationen der Eisenlösungen (autokl. Und nicht autokl.) 16

Tabelle 2: Konzentrationen der Eisenlösungen (nicht autokl.) 16

Tabelle 3: Verschiedene NTA-Konzentrationen 17

Tabelle 4: Zusammensetzung der Proben für die Kalibrierungsgerade 24

Tabelle 5: Ansatz für ein Minigradientengel 28

Abkürzungsverzeichnis

AA Acrylamid ACA 6-Aminocapronsäure ADP Adenosindiphosphat Ag Silber APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenosintriphosphat bidest. zweifach destilliert BN-Gel blaues natives Gel bp Basenpaar(e) BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) c Konzentration Chl Chlorophyll Cm Chloramphenicol Co(NO 3 ) 2 Kobaltnitrat CuSO 4 Kupfersulfat DM Dodecylmaltosid Natriumdithionit (Na 2 SO 3 ) DT DTT Dithiotreithol E Erythromycin e ^- Elektron EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alii Fe Eisen FeNH 4 -Citrat Eisen-Ammonium-Citrat [FeS] Eisen-Schwefel FMN Flavinadeninmononukleotid FMNH 2 reduziertes Flavinadeninmononukleotid g Gramm oder Erdbeschleunigung Gm Gentamycin h Stunde H 2 Wasserstoff H 2 ase bidirektionale Hydrogenase

VII

H 3 BO 3 Borsäure H 2 O Wasser HCl Salzsäure K 2 HPO 4 Dikaliumhydrogenphosphat Km Kanamycin K m Michaelis-Menten Konstante KP i Kaliumphosphat l Liter M Molmasse

Mikroeinstein (µE/m ² /s) µE µg Mikrogramm mg Milligramm MgCl 2 Magnesiumchlorid MgSO 4 Magnesiumsulfat min Minute µl Mikroliter ml Milliliter µmol Mikromol mmol millimol MnCl 2 Manganchlorid mV Millivolt MV Methylviologen (1,1-Dimethyl-4,4-bipyridinium-dichlorid) NaCl Natriumchlorid Na 2 CO 3 Dinatriumcarbonat NADH reduziertes Nikotinamidadenindinukleotid Na 2 EDTA Dinatriumethylendiamintetraessigsäure Na 2 S 2 O 3 Dinatriumthiosulfat NaMoO 4 Natriummolybdat NaNO 3 Natriumnitrat NaOH Natriumhydroxid Na 2 WO 4 Dinatriumwolframat NH 3 Ammoniak NH 4 Cl Ammoniumchlorid nm Nanometer

N-NEDA N-(1-Naphthyl)ethylenediamindihydrochlorid Nitrilotriessigsäure (N(CH 2 -COOH) 3 ) NTA O 2 molekularer Sauerstoff OD 750 optische Dichte bei 750 nm PCC Pasteur Culture Collection PQ Plastochinon PSI Photosystem I PSII Photosystem II rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RT Raumtemperatur s Sekunde TEMED N, N, N’, N’-Tetraethylmethyldiamin TES N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure Tris 2-Ammino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol U Unit (Umsatzrate) (v/v) Volumen/Volumen WT Wildtyp (w/v) Gewicht/Volumen ZnSO 4 Zinksulfat

1. Einleitung

1.1 Cyanobakterien

Die gramnegativen Cyanobakterien umfassen mehr als 150 Gattungen, die ca. 2000 Arten enthalten. Sie stellen damit die größte und mannigfaltigste Gruppe der phototrophen Bakterien dar (Houchins 1984).

Anhand fossiler Sedimentablagerungen wurde das Alter dieser Organismen auf 2,5-3,5 Milliarden Jahre geschätzt (Whitton und Potts 2000). Man findet sie heutzutage in vielen unterschiedlichen Habitaten. Sie kommen unter anderem in Süß- und Salzwasser, in heißen Quellen und gefrorenen Gewässern vor. Einige Gattungen bilden Symbiosen mit anderen Lebewesen. So entsteht durch die Verbindung mit Pilzen der Organisationstyp der Flechten (Rai et al. 2000). So unterschiedlich wie die besetzten Habitate ist auch die Morphologie der Cyanobakterien. Es lassen sich fünf morphologische Gruppen unterscheiden (Rippka et al. 1979) (Abbildung 1.1):

Allen Cyanobakterien gemein ist die Fähigkeit, oxygene Photosynthese zu betreiben. Sie hatten dadurch großen Einfluss auf die Entstehung einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre. Heute sind Cyanobakterien zu ca. 1/3 an der

Gesamtsauerstoffproduktion beteiligt (Schopf 2000).

Sie unterscheiden sich von anderen photosynthetisch aktiven Bakterien durch das Vorkommen von Chlorophyll a und von PSII, wodurch die Wasserspaltung möglich wurde. Zudem wird angenommen, dass die Cyanobakterien durch Endosymbiose zur Chloroplastenentwicklung geführt haben (Douglas 1994). Außerdem besitzen Cyanobakterien als charakteristisches Merkmal Phycobilisomen (Abbildung 1.2 A). Sie sind Bestandteil der Lichtsammelkomplexe und sitzen halbkreisförmig auf der Thylakoidmembran (McConnel et al. 2002). Die Phycobilisomen setzen sich aus einer Mischung der Pigmente Phycoerythrin, Phycocyanin und Allophycocyanin zusammen und ermöglichen das Einfangen sehr geringer Lichtintensitäten. Zudem engen ihre Absorptionsspektren die „Grünlücke“ des Chlorophylls ein (Abbildung 1.2 B).

A

1.2 Synechocystis sp. PCC 6803

Synechocystis sp. PCC 6803 (Abbildung 1.3)

gehört zur Ordnung Chroococcales der Gattung Synechocystis. Es ist ein nichtstickstofffixierendes Cyanobakterium, das die Fähigkeit zum photoautotrophen Wachstum besitzt. Darüber hinaus kann es unter LAHG-Bedingungen (light activated heterotrophic growth) auf Glucose wachsen (Anderson und McIntosh 1991). Das Genom ist komplett sequenziert (Kaneko et al. 1996) und im Internet unter www.kazusa.or.jp/cyano.html frei zugänglich. Es hat eine Größe von 3.573.470 bp mit 3168 Leserahmen. Aufgrund

seiner natürlichen Kompetenz, Fremd-DNA aufzunehmen, ist Synechocystis leicht zu transformieren und damit ideal geeignet für molekularbiologische Untersuchungen.

1.3 Elektronentransportwege in Cyanobakterien

In Cyanobakterien gibt es keine Zellkompartimentierung. Der photosynthetische und der respiratorische Elektronentransport sind über gemeinsame Komponenten sehr eng miteinander verbunden (Schmetterer 1994). So ist z.B. der Cytochrom-b 6 f-Komplex Bestandteil beider Elektronentransportwege und auch der Plastochinonpool wird von beiden Wegen genutzt. Abbildung 1.4 zeigt schematisch die Elektronentransportwege in Synechocystis sp. PCC 6803. Es gibt drei Hauptwege der Elektronen:

1. Der lineare photosynthetische Elektronentransport vom PSII zum PSI und über Ferredoxin weiter in die CO 2 -Fixierung,

2. der respiratorische Elektronentransport vom NADPH oder vom Succinat über den Plastochinonpool und die Cytochrom-bd-Oxidase auf Sauerstoff und

3. der zyklische Elektronentransport rund um das PSI, in den auch Ferredoxin involviert ist.

Elektronen können über gemeinsam genutzte Komponenten zwischen den einzelnen Wegen wechseln. Der Plastochinonpool z.B. wird nicht nur vom PSII reduziert, sondern auch von der NAD(P)H-Dehydrogenase (NDH) und der Succinat-Dehydrogenase. Ferredoxin ist nicht nur am photosynthetischen und zyklischen Elektronentransport beteiligt, sondern liefert auch Elektronen für die Nitrat- und die Nitritreduktase.

An vielen dieser Reaktionen sind Protonen beteiligt. Der Wasserstoffmetabolismus hat somit großen Einfluss auf den gesamten Elektronentransport. Außerdem scheint die Hydrogenase mit der NDH-1 verbunden zu sein (Appel et al. 2000).

1.4 Enzyme des Wasserstoffmetabolismus

In Cyanobakterien können drei Enzyme am Wasserstoffmetabolismus beteiligt sein. Die Nitrogenase fixiert Stickstoff und bildet dabei Wasserstoff, die aufnehmende Hydrogenase verarbeitet diesen produzierten Wasserstoff und die bidirektionale Hydrogenase ist sowohl in der Lage, Wasserstoff zu verbrauchen, als auch ihn zu bilden.

1.4.1 Die Nitrogenase

Nitrogenasen dienen der Stickstofffixierung. Sie katalysieren die Reduktion von Stickstoff zu Ammonium unter ATP-Verbrauch. Als Nebenprodukt entsteht Wasserstoff:

N 2 + 8 e ^- + 8 H ⁺ + 16 ATP 2 NH 3 + H 2 + 16 ADP + 16 P i

Die Nitrogenasen aus verschiedenen Organismen weisen eine große Ähnlichkeit in ihren physikalischen und katalytischen Eigenschaften auf (Winter und Burris 1976). Sie sind aus einem Proteinkomplex, bestehend aus einer Dinitrogenase-Reduktase und einer Dinitrogenase, aufgebaut.

Die Dinitrogenase-Reduktase nimmt dabei Elektronen von einem externen Elektronendonor (z.B. Ferredoxin) auf und leitet sie unter ATP-Verbrauch an die Dinitrogenase weiter (Houchins 1984). Diese katalysiert die eigentliche Reduktion des Stickstoffs. Der dabei gebildete molekulare Wasserstoff kann durch die aufnehmende Hydrogenase (siehe 1.3.2) oxidiert und die Elektronen so dem Energiestoffwechsel wieder zugeführt werden.

Der Nitrogenasekomplex ist äußerst sauerstoffempfindlich. Aerobe Cyanobakterien, die mithilfe der Nitrogenase Stickstoff fixieren, haben daher unterschiedliche Strategien entwickelt, um den Sauerstoffgehalt zum Zeitpunkt der Stickstofffixierung in der Zelle gering zu halten. In den einzelligen autotrophen Formen findet eine zeitliche Trennung statt. Die Stickstofffixierung ist durch einen Tag-Nacht-Rhythmus von der Sauerstoffproduktion durch die Photosynthese getrennt (Fay 1992, Bergmann et al. 1997). Einige filamentöse Cyanobakterien haben hingegen eine räumliche Trennung dieser beiden Prozesse vorgenommen. So findet die Photosynthese in den vegetativen Zellen statt, während die Stickstofffixierung in

besonderen Zellen, den Heterocysten, abläuft (Wolk 1996). In diesen Zellen kommt kein PSII vor, somit unterbleibt die O 2 -Freisetzung. Außerdem ist die Atmungsrate gegenüber den vegetativen Zellen erhöht. Zusammen mit einer verdickten Zellwand, die Gasdiffusion in die Zelle erschwert, wird so für einen sehr geringen Sauerstoffpartialdruck in den Heterocysten gesorgt.

1.4.2 Die aufnehmende Hydrogenase

Die aufnehmende Hydrogenase kommt in allen stickstofffixierenden Cyanobakterien vor (Tamagnini et al. 2000) und somit nicht in Synechocystis sp. PCC 6803. Sie verbraucht den durch die Nitrogenase produzierten Wasserstoff über die Knallgasreaktion (2 H 2 + O 2 2 H 2 O), wodurch ATP gebildet wird. Durch den

Verbrauch von Sauerstoff wird die Nitrogenase vor Inaktivierung geschützt (Bothe et al. 1977). Außerdem liefert die aufnehmende Hydrogenase Elektronen für die Nitrogenase.

Da ihr ein N-terminales Signalpeptid fehlt (Carrasco et al. 1995, Happe et al. 2000), ist die aufnehmende Hydrogenase sehr wahrscheinlich an die cytoplasmatische Seite der Thylakoid- oder Cytoplasmamembran gekoppelt (Appel und Schulz 1998).

1.4.3 Die bidirektionale Hydrogenase

Die bidirektionale Hydrogenase kann zum einen durch die Reduktion von Protonen Wasserstoff produzieren, zum anderen ist sie aber auch in der Lage, Wasserstoff zu

verwerten: 2 H ⁺ + 2 e ^- H 2 .Da sie aber einen geringen K m -Wert von 2,3 µM für Wasserstoff hat (Houchins und Burris 1981), wird vermutet, dass sie unter physiologischen Bedingungen bevorzugt in Richtung der Wasserstoffaufnahme arbeitet (Schmitz et al. 1995). Sie liegt löslich oder locker an die Membran gebunden vor (Serebryakova et al. 1994) und ist wie die Nitrogenase extrem sauerstoffempfindlich. Die biologische Aufgabe der bidirektionalen Hydrogenase ist noch nicht abschließend geklärt. Sie könnte bei höheren Lichtintensitäten als Elektronenventil im photosynthetischen Elektronentransport dienen (Appel et al. 2000). Es wird aber auch vermutet, dass sie durch die Oxidation von Wasserstoff Elektronen an die Atmungskette weitergibt (Schmitz et al. 1995).

Abbildung 1.5 zeigt die schematische Zusammensetzung des Enzyms. Es handelt sich um ein Pentamer, das aus einem Hydrogenaseteil, kodiert von hoxYH, und einem Diaphoraseteil, kodiert von hoxFU, aufgebaut ist. HoxE stellt eine weitere Diaphoraseuntereinheit dar.

Alle hox-Gene bilden im Genom von Synechocystis sp. PCC 6803 ein Operon, welches als ein einziges Transkript abgelesen wird (Phunpruch 1999) (Abbildung 1.6).