Zielsetzung

Die Reaktionsfähigkeit von Zellen des angeborenen Immunsystems auf unterschiedliche Antigene stellt einen wesentlichen Teil einer schnellen und adäquaten Immunantwort dar. Aus diesem Grund ist es im Rahmen immunologischer Forschung grundlegend, die Responsivität von Zellen auf verschiedene Stimuli zu untersuchen. Diese Responsivität beruht generell auf der Ausstattung mit sog. „pattern recognition receptors“ (PRR), zu denen beispielsweise die „toll like receptors“ (TLR) gezählt werden, die nach Aktivierung über bestimmte Signalkaskaden eine erhöhte Transkription von Genen proinflammatorischer Zytokine induzieren.

Da die vermehrte Genexpression mit einer Steigerung der metabolischen Aktivität einhergeht, kann die Proliferationsrate einer Zellkultur als ein Maß für deren Responsivität in Bezug auf den verwendeten Stimulus herangezogen werden.

Der Nachweis dieser Stoffwechselaktivität erfolgt anhand diverser molekularbiologischer Methoden wie z.B. der Tetrazoliumsalz-Reaktion, die auf der Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen in viablen Zellen beruht. Diese Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen sind in der Lage, Tetrazoliumsalze zu Formazankristallen zu reduzieren, die anschließend photometrisch detektiert werden können. Dabei korreliert die Stärke der gemessenen Absorption mit der Aktivität der Dehydrogenasen und somit mit der Proliferationsrate der Zellen.

In dem durchgeführten Versuch wurden zunächst Monozyten aus einer PBMC-Fraktion („peripheral blood mononuclear cells“), die durch Dichtezentrifugation nach der Ficoll-Hypaque-Methode aus peripherem Venenblut (sog. „buffy coats“) gewonnen worden war, mittels Elutriation isoliert und nachfolgend kultiviert. Diese Monozyten setzten wir in der Folge verschiedenen Antigenen, teilweise unterschiedlich konzentriert, aus, um schließlich mit der oben vorgestellten Technik ihre Responsivität auf die Testsubstanzen zu ermitteln. Als Stimuli verwendeten wir, folgend Tabelle 1, jeweils in Doppelbestimmung das bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), das mit unmethylierten CpG-Motiven ausgestattete Oligodesoxynukleotid (ODN) 2216, das Thymidin-Analogon Imidazoquinolin Resiquimod (R848) sowie das Vesikuläre Stomatitis Virus (VSV), dessen Genom aus einer einzelsträngigen RNA mit negativer Orientierung besteht. Zusätzlich ließen wir drei Kontrollen (Medium mit/ohne AB-Serum, nur PBS) mitlaufen.

Die Detektion erfolgte im Photometer bei einer Wellenlänge von 570 nm gegen einen Referenzwert von 630 nm.

Erwartet wurden starke Aktivierungssignale im Falle von LPS, R848 sowie VSV, die durch die von Monozyten stark exprimierten TLR 4 (LPS) bzw. TLR 7/8 (R848, VSV-ssRNA) erkannt werden. Beim LPS und beim VSV erwarteten wir zudem erhöhte Werte bei steigender Konzentration.

Im Falle des ODN 2216 wurde von einer schwächeren (aber über der Kontrolle befindlichen) Stimulation ausgegangen, da der spezifische Rezeptor für CpG-DNA (TLR 9) nur in geringen Mengen bei Monozyten gefunden werden kann.

Der Kontrolle, die Medium mit AB-Serum enthielt, sprachen wir aufgrund der Wachstumsfaktoren eine geringfügige, jedoch stärkere Stimulationsfähigkeit als dem Medium ohne AB-Serum zu, während die PBS-Kontrolle kein Signal erzeugen sollte.

Ergebnisse

Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen allesamt keine signifikante Abweichung vom Kontrollwert (Medium mit AB-Serum). Aufgrund der Tatsache, dass auch die Proben der Gruppe III, die die gleichen Monozytenkulturen verwendet hatten wie wir, trotz vorheriger