Aufgabe 1:

Anfertigung von Paraffinschnitten für Histologie und Immunhistochemie

Einleitung

Zur direkten Beobachtung lebender Zellen unter dem Mikroskop ist eine Herstellung eines histologischen Präparats notwendig. Dieses Präparat muss aus photophysikalischen Gründen sehr dünn sein und wird daher im Anschluss an eine chemische Fixierung und Einbettung in Paraffinblöcken (s. Aufgabe 3) an Mikrotomen in mikroskopierbare Dicken geschnitten und danach auf einen Objektträger aufgezogen. Die Anfertigung von Paraffinschnitten gehört also zu den grundlegenden histologischen Praktiken.

Verwandtes Material

Schlittenmikrotom Streckbad (20°C, 45°C) Pinsel Objektträger

verschiedene Gewebeproben, eingebettet in Paraffinblöcke

Versuchsdurchführung

Der Paraffinblock mitsamt dem eingebetteten Gewebe wurde anfangs in das Schlittenmikrotom eingespannt, eine Schnittdicke von 6 µm eingestellt und das Messer derart ausgerichtet, dass es die komplette Breite der Blockoberfläche schnitt. Zur Sammlung waren diese Schnitte danach zunächst in einem mit 20°C warmem Leitungswasser gefüllten Gefäß zwischengelagert worden, bevor die besten zwei ausgewählt und in ein mit 45°C warmes Streckbad (Leitungswasser) überführt wurden, in dem sich die partiell noch faltigen Schnitte glätteten. Nach Beendigung des Glättungsprozesses wurden die Schnitte auf einen beschrifteten Objektträger aufgebracht, auf einer Heizplatte vor- und schließlich über Nacht in einem Brutschrank bei 60°C weitergetrocknet, um als Vorbereitung auf die histologische Gewebefärbung (s. Aufgabe 2) das restliche Paraffin herauszuschmelzen.

Aufgabe 2:

Histologische Gewebefärbung

Einleitung

Aufgrund der Kontrastarmut des nach der Schnittanfertigung weitgehend durchsichtigen Gewebes ist die Unterscheidung verschiedener Gewebsteile oft sehr schwer bis unmöglich. Daher bedient man sich in der Histologie bestimmter Farbstoffe, die eine größere bzw. niedrigere oder auch eine sehr spezifische Affinität zu verschiedenen Bestandteilen von Geweben besitzen. Eine häufige Übersichtsfärbung ist die sog. HE-Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung), die als eine sukzedane

2

Kombinationsfärbung bezeichnet werden kann. Dies bedeutet, dass zuerst mit dem basisch reagierenden Hämatoxylin, das hauptsächlich für die bläuliche Kernfärbung (basophile DNA-/RNA-Komponente) zuständig ist, gefärbt wird und danach das saure Eosin, das vor allem für die rötliche Plasmafärbung ( azidophile Komponenten ) sorgt, hinzugegeben wird. Anhand dieser und weiterer Färbetechniken lässt sich ein Präparat unter dem Mikroskop kontrastreich darstellen, was die Untersuchung und Diagnose in einer adäquaten Form erst ermöglicht.

Verwandtes Material

selbst angefertigte Paraffinschnitte (s. Aufgabe 1) Färbeküvetten Xylol zur Entparaffinierung

Alkoholreihen zur Wässerung/Entwässerung der Schnitte Hämatoxylin-Gebrauchslösung (nach Mayer, filtriert) Aqua bidest.

Eosin-Gebrauchslösung (0,1%-ige wässrige Lsg., filtriert) Eindeckmedium (Depex-Kunstharz) Deckgläschen

Versuchsdurchführung

Nach der chemischen Fixierung, der Paraffin-Einbettung und der anschließenden Anfertigung der Schnitte, die über Nacht den Paraffin herausschmelzenden Trocknungsprozess durchlaufen hatten, wurden die zurückgebliebenen Paraffinreste nun mithilfe von Xylol endgültig entfernt, damit das lipophile Paraffin nicht die Bindung der zumeist wasserlöslichen Farbstoffe stört. Weiterhin wurde der Schnitt in einer absteigenden Alkoholreihe langsam rehydriert, um die Aufnahme der Farbstoffe in das Gewebe zu erleichtern. Dazu wurde dieser, aufgrund der gesundheitsschädlichen Eigenschaften von Xylol und der konzentrierten Alkohol-Lösungen unter dem Abzug, nacheinander für die angegebene Zeit folgenden Lösungen ausgesetzt:

Xylol 1 5 min

Aqua bidest. 2x3 min

Infolge der durch die oben genannte Reihe aus Xylol, absteigend konzentrierten Alkoholen und bidestilliertem Wasser vollständigen Entfernung des Paraffins, verbunden mit einer Wiederaufnahme von Wasser, wurde nun mit dem eigentlichen Färbeschritt fortgefahren. Da es sich bei der HE-Färbung um eine sukzedane Färbung handelt, wurde der Schnitt, wie folgt dargestellt, zur

3

Kernfärbung zuerst mit saurem Hämalaun nach Mayer (ein Derivat des Hämatoxylins) und danach zur Plasmafärbung mit einer 0,1%-igen Eosin-Gebrauchslösung behandelt. Als Farbstoff-Reste entfernendes Intermediat dient jeweils destilliertes Wasser.

Der Schritt des fließenden Leitungswassers ist wichtig für das sog. „Bläuen“ des Hämalauns. Dies bezeichnet die unter einem pH-Sprung (saure Lösung nach Mayer: pH ≈ 3 ; Leitungswasser: pH ≈ 6) stattfindenden Oxidation des Hämatoxylins bzw. des Hämalauns zum stabilen Hämatein-Lack, das sich erst an die entsprechenden „targets“ im Gewebe anlagern und die charakteristische bläulichviolette Färbung ausbilden kann.

Um die Färbungen zu erhalten und die Präparate dauerhaft lagern zu können, ist eine erneute Entwässerung erforderlich. Dazu wurde der Schnitt im Anschluss an die eigentliche Färbung einer Reihe aus Alkoholen aufsteigender Konzentration, gefolgt von Xylol, ausgesetzt:

Danach konnte der Schnitt zur Erstellung eines Dauerpräparats in das Kunstharz „Depex“ eingedeckt werden. Dazu wurde unter dem Abzug mit einer Pipette eine Menge des Eindeckmediums auf den Objektträger getropft, dass der gesamte Schnitt von diesem bedeckt war, und auf diese Stelle ein Deckgläschen gelegt. Dieser letzte Schritt musste besonders langsam und vorsichtig mithilfe einer dünnen Nadel durchgeführt werden, da die Gefahr der Bildung von Luftbläschen im Bereich des Gewebes bestand.

Auswertung

(Skizze als Mikroskopbild A angehängt)

Die Präparate weisen eine ungefähr gleiche Färbungsintensität auf, allerdings ist ein quasi ubiquitärer violetter Farbton zu erkennen, auch wenn die Stärke je nach Ort (nuklear, zytoplasmatisch) variiert. Dies könnte auf eine zu intensive Behandlung mit dem Hämalaun/Hämatein-Farbstoff hindeuten.

Zur näheren Betrachtung wurde das Präparat gewählt, auf dem die „Nebennierenrinde“ (Cortex glandulae suprarenalis) mitsamt angrenzendem braunem (plurivakuolärem) Fettgewebe angeschnitten war. Das braune Fettgewebe konnte anhand der plurivakuolären Adipozyten

4