Einleitung

In diesem Versuch wurde der Abbau von Neurotransmittern durch bestimmte Enzyme, der Cholinesterasen, sowie die Hemmung dieser enzymatisch katalysierten Reaktion untersucht. Nach einer kurzen theoretischen Einleitung in das Thema folgt eine genauere Beschreibung der Fragestellung.

Cholinesterasen sind Enzyme der Gruppe der Serin-Hydrolasen. Im menschlichen Körper haben Acetylcholinesterasen insbesondere die Funktion im synaptischen Spalt den Neurotransmitter Acetylcholin zu spalten. Acetylcholin ist ein chemischer Botenstoff und der Ligand der prä- sowie postsynaptischen ACh-Rezeptoren, die bei Aktivierung durch Ionenflux das nachgeschaltete Neuron de- oder hyperpolarisieren und somit die Signaltransduktion in verschiedenen neuronalen Netzwerken des Körpers steuern. Es existieren zwei Hauptgruppen der Cholinozeptoren, der nikotinerge und der muskarinerge ACh-Rezeptor. Der nikotinerge ACh-Rezeptor findet sich vor allem an der neuromuskulären Endplatte, aber auch im vegetativen Nervensystem (präganglionär, enterisches NS) sowie im Zentralnervensystem. Er besitzt ionotrope Eigenschaften, d.h., dass er bei Bindung des Liganden als Ionenkanal einen nicht selektiven Kationenflux zulässt, der einen depolarisierenden Effekt auf die Zelle hat und so die neuronale Signaltransduktion vermittelt. Der muskarinerge ACh-Rezeptor kommt in postganglionären Neuronen des Parasympathikus und ebenfalls im ZNS vor. Dieser Rezeptor ist entweder gekoppelt mit einem inhibierenden G i - Protein, das über die Inhibition der Adenylatzyklase das cAMP-System hemmt sowie durch Öffnung von Kaliumkanälen eine Hyperpolarisierung der Zelle auslöst, oder mit einem exzitatorischen, chemotaktischen G q - Protein, das mithilfe der IP 3 - DAG - Kaskade verschiedene zelluläre Prozesse aktiviert. Aufgrund ihres quasi ubiquitären Vorkommens löst die auf ACh basierende Erregungsweiterleitung verschiedene Effekte im humanen Organsystem aus. So stimuliert dieser Neurotransmitter die muskuläre Kontraktion der Skelettmuskulatur, besitzt jedoch durch seine parasympathische Aktivität auch einen Herzfrequenz senkenden Einfluss und führt zu einer Aktivierung der glatten Muskulatur des gastrointestinalen Trakts.

Ungeachtet des Rezeptortyps wird die Wirkung des ACh relativ schnell nach der Bindung aufgrund der Spaltung durch Cholinesterasen gestoppt, um so eine effektive und schnelle Aufnahme des nächsten Signals zu gewährleisten, wobei die Spaltprodukte Acetat und Cholin über endozytotische Resorptionsprozesse in die Präsynapse zurücktransportiert und erneut eingesetzt werden können. Die Inhibition der AChE durch bestimmte neurotrope Stoffe zieht daher einen verminderten Abbau des ACh und infolge des einsetzenden AChÜberangebots eine Hyperstimulation des nachgeschalteten Neurons nach sich, das nach längerer Zeit in eine Blockierung der Rezeptoren übergehen kann. Erwartbare Auswirkungen auf den menschlichen Organismus sind eine anhaltend erhöhte Kontraktilität der Skelettmuskulatur sowie eine Stimulation des Parasympathikus. Als Beispiele für letzteres seien hier die Absenkung der Herzfrequenz, die Anregung der Verdauung ( Aktivierung der glatten intestinalen Muskulatur, Stimulation der gastralen Säure-Sekretion ) sowie Vasodilatation genannt. Bei Überdosen kann es zu Muskelspasmen und Bradykardie bis zum Tod durch Herzversagen kommen.

II

Medizinische Anwendung finden AChE-Inhibitoren vor allem als Anti-Anästhetikum und der Behandlung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, wie z.B. Morbus Alzheimer, Myasthenia gravis oder Glaukomen.

Neben den AChE existiert mit den Butyrylcholinesterasen noch ein weiterer Typ von Cholinesterasen, dessen Enzyme auch Pseudocholinesterasen genannt werden, da ihre Affinität zu ACh gegenüber der AChE deutlich vermindert ist. Im Gegenzug spalten sie ACh jedoch schneller und darüber hinaus dienen ihr auch weitere cholinhaltige und nicht cholinhaltige Stoffe als Substrate. Weiterhin unterscheiden sich die beiden Typen in ihrer Lokalisation und ihrer Sensitivität gegenüber Inhibitoren. Physiologisch besitzt die BuChE eine Funktion im Metabolismus von Xenobiotika sowie untergeordnet von ACh im Nervensystem.

Zur Bestimmung der Aktivität der ChE wurde für diesen Versuch die BuChE und das Substratanalogon Butyrylthiocholin verwandt, dessen Spaltprodukt Thiocholin in der Lage ist, mit einem der Aromatringe des DTNB [ 5,5-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) ] eine Disulfidbrücke auszubilden. Das daraus resultierende weitere Spaltprodukt 5-Thio-2-Nitrobenzoat lässt sich dank seiner gelben Farbe kolorimetrisch verwenden. So war es möglich anhand der Konzentration des 5-Thio-2-Nitrobenzoats Rückschlüsse auf die Aktivität der BuChE zu ziehen.

In einem weiteren Schritt wurde dem Reagenz der ChE-Inhibitor Neostigmin hinzugefügt. Neostigmin carbamyliert die ChE im aktiven Zentrum an dem Serin-Rest, an dem im Normalfall ein Acetyl- bzw. Butyryl-Rest zur Katalyse der ACh-/BuCH-Spaltung gebunden wird, sodass kein Substrat mehr an das nun inaktivierte Enzym binden kann. Da sich jedoch der Acetyl/Butyryl-Rest sofort nach Beendigung der Reaktion wieder vom Enzym löst, der Carbamyl-Rest jedoch 0,5 - 6 Std. gebunden bleibt, wurde außerdem ein Ansatz mit Vorinkubation des Enzyms mit dem Inhibitor und ein Ansatz mit direkter Zugabe des Substrats gestartet, um einen eventuellen Einfluss auf die Art der Hemmung zu untersuchen. Durch Vergleich der gemessenen Extinktionskurven ließen sich in der Folge drei Darstellungen der jeweils zutreffenden Enzymkinetik mit vorinkubiertem, mit direkt zugegebenem und ohne Inhibitor anfertigen und vergleichen.

Chemikalien

Es wurden die im Skript S.43 genannten Chemikalien benutzt. Allerdings wiesen die Stammlösungen D und E (Butyrylthiocholinjodid I und II) nicht, wie angegeben, eine Konzentration von 100 ( Lsg. D) bzw. 10 mM ( Lsg. E) auf, sondern von 10 bzw. 1 mM.

III

Durchführung

Enzymtest 1 (Kontrolle)

Bei der Durchführung des ersten Enzymtests ohne Inhibitor folgten wir den im Skript von S. 44-45 angegebenen Schritten. Die Tabelle (S. 45) wurde in der Form berechnet, wie im Folgenden durch eine Beispielrechnung dargelegt. Wir entschieden uns jeweils für die Lösung, bei der so wenig Volumen wie möglich pipettiert werden musste, der bezüglich Pipettierfehler (für die verwandten Pipetten) kritische Punkt von 10 μl jedoch stets übertroffen wurde.

c 1 : Endkonz. V 1 : Endvolumen c 2 : Konz. der Stammlösung D/E V 2 : Volumen der Stammlösung D/E (zu pipettieren)

c 1 · V 1

Lsg. D :

Lsg. E :

In diesem Beispiel wurde für die erste Zeile der Tabelle 30 μl der Lösung E als zu pipettierende Menge gewählt.

Die Menge an Puffer, die noch hinzuzugeben war, errechnete sich einfach aus der Differenz des Gesamtvolumens von 1 ml und der bereits errechneten Volumina.

IV