Fachbuch
Fach: Pharmazie
Gebiet: Pharmazeutische Chemie
Westfälische Wilhelms-Universität Münster

Einführung in die pharmazeutische instrumentelle Analytik

von Martin Smollich
2007

Inhalt

1. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ... 2

2. Gas-Chromatographie (GC) ... 5

3. Atomabsorptions-Spektroskopie (AAS) ... 7

4. Atomemissions-Spektroskopie (Flammen-Photometrie) ... 9

5. Polarographie ... 11

6. UV-VIS-Spektrometrie ... 13

7. Fluorimetrie ... 14

8. Infrarot-Spektrometrie (IR) ... 16

9. Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) ... 18

10. Literatur ... 22

1. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Die HPLC ist neben der Dünnschicht-Chromatographie (DC) und der Säulenchromatographie (SC) die wichtigste Form der Flüssigkeits-Chromatographie. Die Vorteile der HPLC sind insbesondere ihre im Vergleich zur Säulenchromatographie erhöhte Trennleistung und Empfindlichkeit sowie die verkürzte Analysendauer. Das Prinzip von Säulen-Chromatographie und HPLC ist identisch: Die Säule enthält die sog. Säulenpackung aus porösen Teilchen, und das Zwischenkornvolumen wird mit Fließmittel durchströmt. In den Hohlräumen der Partikel steht das Fließmittel. Die Verzögerung entsteht dadurch, dass die gegebene Substanz in der stationären Phase (in den Poren) länger verweilt als das Fließmittel. Die unterschiedliche Anziehungskraft der stationären Grenzfläche auf unterschiedliche Substanzen heißt Attraktion. Verschiedene Stoffe werden so nach unterschiedlichen Zeiten eluiert und können dann detektiert werden.
Voraussetzung für eine Trennung ist die reversible Adsorption (dynamisches Gleichgewicht mit Desorption), da sonst die Substanz die stationäre Phase nicht mehr verlassen könnte. Die stationäre Phase bewirkt auch auf die flüssige Phase eine Attraktion, die jedoch geringer sein muss als die Attraktion auf die gelösten Substanzen. Maß für die Attraktion des Fließmittels durch die stationäre Phase ist die Fließmittelstärke, nach der die Fließmittel in der eluotropen Reihe geordnet sind. Die „isokratische Elution“ arbeiten mit einer konstanten Fließmittelgeschwindigkeit, die „Gradientenelution“ dagegen mit einer Fließmittelzusammen-setzung, die sich während der Elution verändert. Dies hat oft den Vorteil einer reduzierten Trennzeit mit schmaleren und höheren Banden.

Aufbau der HPLC-Apparatur
Die Versorgungseinheit besteht aus dem Fließmittelreservoir, Pumpe und Filter und erzeugt den Fließmittelfluss durch die Säule. Als Dosiervorrichtung dient das Ventil mit Probenschleife: Die Schleife kann gefüllt werden, während das Fließmittel direkt auf die Säule geht. Danach kann die Schleife zwischen Pumpenausgang und Säule geschaltet werden, so dass die Probe vom Fließmittel mitgespült wird. Die Probe gelangt so auf die Trennsäule und anschließend in den Detektor, der aus verschiedenen Systemen bestehen kann und meist mit PC, Integrator oder Schreiber gekoppelt ist. Optional ist noch ein nachgeordnetes Fraktionierungssystem.

Auswertung mit UV/VIS-Detektoren
Die Auswertung mit UV/VIS-Detektoren beruht auf der Schwächung der Lichtintensität im Zweistrahl-Photometer (nach dem Lambert-Beerschen Gesetz): Der Probenstrahl wird beim Durchgang durch die Probe geschwächt, während der Referenzstrahl durch die Luft geht und den Lichtdetektor (Photozelle) so ungeschwächt erreicht. Bei Verwendung von UV-Detektoren muss die mobile Phase bei der entsprechenden, absorbierenden Wellenlänge der Probe vollständig durchlässig sein. Die qualitative Analyse beruht auf dem Vergleich der Retentionszeiten, die quantitative Analyse erfolgt durch Integration der Extinktions-Peakflächen, aus denen dann nach dem Lambert-Beerschen Gesetz die Konzentration bestimmt werden kann:
E =
E: Extinktion
molarer Extinktionskoeffizient
c: Konzentration der Substanz
d: Lichtweg durch Probe (Küvettenlänge)

Da c und d konstant sind, ist die Extinktion der Konzentration direkt proportional.

Kalibrierung
Die Kalibrierung erfolgt durch Ermittlung der Peakfläche einer bekannten Konzentration.
a) Kalibrierung mit externem Standard
Es können sowohl eine als auch zwei Standart-Konzentrationen analysiert und die dazugehörige Fläche in ein Koordinatensystem eingetragen werden (1-Punkt-/2-Punkt-Kalibrierung). Eine Probe ist bereits ausreichend, da die Kalibriergerade zwingend durch den Nullpunkt geht:

Abbildung in Downloaddatei enthalten.

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