Der Einfluss abiotischer Umweltfaktoren auf die Hydrogenase des Cyanobakteriums "Synechocystis" sp. PCC 6803


Diplomarbeit, 2005
72 Seiten, Note: 1,65

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1. EINLEITUNG
1.1 Cyanobakterien
1.2 Synechocystis sp. PCC
1.3 Elektronentransportwege in Cyanobakterien
1.4 Enzyme des Wasserstoffmetabolismus
1.4.1 Die Nitrogenase
1.4.2 Die aufnehmende Hydrogenase
1.4.3 Die bidirektionale Hydrogenase
1.5 Eisen und Nickel in Cyanobakterien
1.6 Die Urease
1.7 Die Nitratreduktase
1.8 Verwendete Mutanten von Synechocystis sp

2. ZIELSETZUNG

3. MATERIAL UND METHODEN
3.1 Arbeitsmaterialien
3.2 Kulturmedien und Lösungen
3.3 Anzuchtbedingungen
3.3.1 Eisenmangel
3.3.2 Nickelmangel
3.3.3 CO2-Mangel
3.3.4 Anaerobe Inkubation
3.3.5 Ausschalten der Nitratreduktase
3.4 Physiologische Methoden
3.4.1 Bestimmung der optischen Dichte
3.4.2 Bestimmung der Chlorophyllkonzentration
3.4.3 Wasserstoffmessung mit Hilfe der Clark-Elektrode
3.4.3.1 Messung der Hydrogenase-Gesamtaktivität
3.4.3.2 Messung der Wasserstoffaufnahme
3.4.3.3 Photowasserstoffmessung
3.4.4 Aktivitätsmessung der Urease
3.4.5 Messung der Lumineszenz
3.5 Proteinchemische Methoden
3.5.1 Bestimmung des Proteingehalts
3.5.2 Zellaufbruch für Ureaseaktivitätsmessung
3.5.3 Präparation von Gesamtmembranen
3.5.4 Blaue native Gele (BN-Gele)
3.5.5 Nitratreduktase-Nachweis

4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.1 Eisenmangel
4.2 Nickelmangel
4.3 CO2-Mangel
4.4 Anaerobiose
4.5 Stickstoffversorgung und Wasserstoffaufnahme

5. ZUSAMMENFASSUNG

6. AUSBLICK

LITERATURVERZEICHNIS

DANKSAGUNG

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Vertreter der einzelnen Ordnungen von Cyanobakterien

Abbildung 1.2: Phycobilisomen

Abbildung 1.3: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Synechocystis sp

Abbildung 1.4: Schema der Elektronentransportwege in Synechocystis sp

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der bidirektionalen Hydrogenase

Abbildung 1.6: hox-Operon von Synechocystis sp

Abbildung 1.7: Modell des aktiven Zentrums der NiFe-Hydrogenase

Abbildung 4.1.1: Wachstum des WT mit verschiedenen Eisenkonzentrationen

Abbildung 4.1.2: Vergleich der H2aseaktivität des WT in Abhängigkeit von der Eisenkonzentration

Abbildung 4.1.3: Wachstumsvergleich des WT und der lux-11-Mutante mit verschiedenen Eisenkonzentrationen

Abbildung 4.1.4: BN-Gel des WT

Abbildung 4.1.5: Vergleich der H2aseaktivität des WT und der lux-11-Mutante in Abhängigkeit von der Eisenkonzentration

Abbildung 4.1.6: Lumineszenz der lux-11-Mutante in Abhängigkeit von der Eisenkonzentration

Abbildung 4.2.1: Wachstum des WT und der hupE-Mutante

Abbildung 4.2.2: H2aseaktivität des WT und der hupE-Mutante

Abbildung 4.2.3: Lumineszenz der lux-11-Mutante in Abhängigkeit von der NTA-Konzentration

Abbildung 4.3.1: Wachstum des WT und der lux-11-Mutante mit 2% CO

Abbildung 4.3.2: Lumineszenz der lux-11-Mutante unter CO2 -Mangel

Abbildung 4.3.3: H2aseaktivität des WT und der lux-11-Mutante unter CO2-Mangel

Abbildung 4.4.1: H2aseaktivität des WT und der lux-11-Mutante unter anaeroben Bedingungen

Abbildung 4.5.1: Wachstum des WT und der Ox-Mutante

Abbildung 4.5.2: Durch Nitratreduktase entstandenes Nitrit

Abbildung 4.5.3: H2aseaktivität des WT und der Ox-Mutante

Abbildung 4.5.4: Schreiberkurven der Wasserstoffaufnahme

Abbildung 4.5.5: Wasserstoffaufnahme des WT und der Ox-Mutante

Abbildung 4.5.6: Schreiberkurven der Photowasserstoffproduktion

Abbildung 4.5.7: Photowasserstoffproduktion des WT und der Ox-Mutante

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Konzentrationen der Eisenlösungen (autokl. Und nicht autokl.)

Tabelle 2: Konzentrationen der Eisenlösungen (nicht autokl.)

Tabelle 3: Verschiedene NTA-Konzentrationen

Tabelle 4: Zusammensetzung der Proben für die Kalibrierungsgerade

Tabelle 5: Ansatz für ein Minigradientengel

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. Einleitung

1.1 Cyanobakterien

Die gramnegativen Cyanobakterien umfassen mehr als 150 Gattungen, die ca. 2000 Arten enthalten. Sie stellen damit die größte und mannigfaltigste Gruppe der phototrophen Bakterien dar (Houchins 1984).

Anhand fossiler Sedimentablagerungen wurde das Alter dieser Organismen auf 2,5-3,5 Milliarden Jahre geschätzt (Whitton und Potts 2000). Man findet sie heutzutage in vielen unterschiedlichen Habitaten. Sie kommen unter anderem in Süß- und Salzwasser, in heißen Quellen und gefrorenen Gewässern vor. Einige Gattungen bilden Symbiosen mit anderen Lebewesen. So entsteht durch die Verbindung mit Pilzen der Organisationstyp der Flechten (Rai et al. 2000).

So unterschiedlich wie die besetzten Habitate ist auch die Morphologie der Cyanobakterien. Es lassen sich fünf morphologische Gruppen unterscheiden (Rippka et al. 1979) (Abbildung 1.1):

- Chroococcales (einzellig, Vermehrung durch binäre Teilung)
- Pleurocapsales (einzellig, Vermehrung durch multiple Teilung)
- Oscillatoriales (filamentöse Organismen, Teilung durch binäre Spaltung in einer Ebene)
- Nostocales (filamentöse Zellen, Produktion von Heterocysten)
- Stigonematales (sich verzweigende filamentöse Cyanobakterien)

Abbildung 1.1: Vertreter der einzelnen Ordnungen von Cyanobakterien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

von links nach rechts: Chroococcales: Synechocystis sp. PCC 6803; Pleurocapsales: Pleurocapsa sp.; Oscillatoriales: Oscillatoria sp.; Nostocales: Nostoc sp. ; Stigonematales: Stigonema sp. (Quellen: www.cyanosite.bio.purdue.edu/images/images.html;

www.una.edu/pdavis/stigonema_with_true_branching_an.html)

Allen Cyanobakterien gemein ist die Fähigkeit, oxygene Photosynthese zu betreiben. Sie hatten dadurch großen Einfluss auf die Entstehung einer sauerstoffhaltigen

Atmosphäre. Heute sind Cyanobakterien zu ca. 1/3 an der Gesamtsauerstoffproduktion beteiligt (Schopf 2000).

Sie unterscheiden sich von anderen photosynthetisch aktiven Bakterien durch das Vorkommen von Chlorophyll a und von PSII, wodurch die Wasserspaltung möglich wurde. Zudem wird angenommen, dass die Cyanobakterien durch Endosymbiose zur Chloroplastenentwicklung geführt haben (Douglas 1994).

Außerdem besitzen Cyanobakterien als charakteristisches Merkmal Phycobilisomen (Abbildung 1.2 A). Sie sind Bestandteil der Lichtsammelkomplexe und sitzen halbkreisförmig auf der Thylakoidmembran (McConnel et al. 2002). Die Phycobilisomen setzen sich aus einer Mischung der Pigmente Phycoerythrin, Phycocyanin und Allophycocyanin zusammen und ermöglichen das Einfangen sehr geringer Lichtintensitäten. Zudem engen ihre Absorptionsspektren die „Grünlücke“ des Chlorophylls ein (Abbildung 1.2 B).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.2: A Phycobilisomen, PE = Phycoerythrin, PC = Phycocyanin, AP =

Allophycocyanin B Absorptionsspektren der Pigmente der Phycobilisomen im Vergleich zu Chlorophyll a (verändert nach Heldt 1999)

1.2 Synechocystis sp. PCC 6803

Synechocystis sp. PCC 6803 (Abbildung 1.3) gehört zur Ordnung Chroococcales der W Gattung Synechocystis. Es ist ein nicht-Th stickstofffixierendes Cyanobakterium, das die Fähigkeit zum photoautotrophen Wachstum besitzt. Darüber hinaus kann es unter LAHG-Th N Bedingungen (light activated heterotrophic growth) auf Glucose wachsen (Anderson und McIntosh 1991). Das Genom ist komplett sequenziert (Kaneko et al. 1996) und im Internet unter www.kazusa.or.jp/cyano.html frei zugänglich. Es hat eine Größe von 3.573.470 bp mit 3168 Leserahmen. Aufgrund seiner natürlichen Kompetenz, Fremd-DNA aufzunehmen, ist Synechocystis leicht zu transformieren und damit ideal geeignet für molekularbiologische Untersuchungen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.3: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Synechocystis sp.

1.3 Elektronentransportwege in Cyanobakterien

In Cyanobakterien gibt es keine Zellkompartimentierung. Der photosynthetische und der respiratorische Elektronentransport sind über gemeinsame Komponenten sehr eng miteinander verbunden (Schmetterer 1994). So ist z.B. der Cytochrom-b6f- Komplex Bestandteil beider Elektronentransportwege und auch der Plastochinonpool wird von beiden Wegen genutzt. Abbildung 1.4 zeigt schematisch die Elektronentransportwege in Synechocystis sp. PCC 6803. Es gibt drei Hauptwege der Elektronen:

1. Der lineare photosynthetische Elektronentransport vom PSII zum PSI und über Ferredoxin weiter in die CO2-Fixierung,
2. der respiratorische Elektronentransport vom NADPH oder vom Succinat über den Plastochinonpool und die Cytochrom-bd-Oxidase auf Sauerstoff und
3. der zyklische Elektronentransport rund um das PSI, in den auch Ferredoxin involviert ist.

Elektronen können über gemeinsam genutzte Komponenten zwischen den einzelnen Wegen wechseln. Der Plastochinonpool z.B. wird nicht nur vom PSII reduziert, sondern auch von der NAD(P)H-Dehydrogenase (NDH) und der Succinat- Dehydrogenase. Ferredoxin ist nicht nur am photosynthetischen und zyklischen Elektronentransport beteiligt, sondern liefert auch Elektronen für die Nitrat- und die Nitritreduktase.

An vielen dieser Reaktionen sind Protonen beteiligt. Der Wasserstoffmetabolismus hat somit großen Einfluss auf den gesamten Elektronentransport. Außerdem scheint die Hydrogenase mit der NDH-1 verbunden zu sein (Appel et al. 2000).

Abbildung 1.4: Schema der Elektronentransportwege in Synechocystis sp. PCC 6803 Cyt bd ox: Cytochrom-bd-Oxidase, Cytb6/f: Cytochrom-b6/f, Cyt c ox: Cytochrom-c-Oxidase, Cyt c553: Cytochrom 553, Fd: Ferredoxin, FNR: Ferredoxin:NADPH-Oxidoreduktase, H2ase: bidirektionale Hydrogenase, NDH: NAD(P)H-Dehydrogenase, NO3- -Red: Nitratreduktase, NO2--Red: Nitritreduktase, PC: Plastocyanin, PQ: Plastochinon, P680: PSII, P700: PSI, SDH: Succinatdehydrogenase (verändert nach J. Appel)

1.4 Enzyme des Wasserstoffmetabolismus

In Cyanobakterien können drei Enzyme am Wasserstoffmetabolismus beteiligt sein. Die Nitrogenase fixiert Stickstoff und bildet dabei Wasserstoff, die aufnehmende Hydrogenase verarbeitet diesen produzierten Wasserstoff und die bidirektionale Hydrogenase ist sowohl in der Lage, Wasserstoff zu verbrauchen, als auch ihn zu bilden.

1.4.1 Die Nitrogenase

Nitrogenasen dienen der Stickstofffixierung. Sie katalysieren die Reduktion von Stickstoff zu Ammonium unter ATP-Verbrauch. Als Nebenprodukt entsteht Wasserstoff:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Nitrogenasen aus verschiedenen Organismen weisen eine große Ähnlichkeit in ihren physikalischen und katalytischen Eigenschaften auf (Winter und Burris 1976). Sie sind aus einem Proteinkomplex, bestehend aus einer Dinitrogenase-Reduktase und einer Dinitrogenase, aufgebaut.

Die Dinitrogenase-Reduktase nimmt dabei Elektronen von einem externen Elektronendonor (z.B. Ferredoxin) auf und leitet sie unter ATP-Verbrauch an die Dinitrogenase weiter (Houchins 1984). Diese katalysiert die eigentliche Reduktion des Stickstoffs. Der dabei gebildete molekulare Wasserstoff kann durch die aufnehmende Hydrogenase (siehe 1.3.2) oxidiert und die Elektronen so dem Energiestoffwechsel wieder zugeführt werden.

Der Nitrogenasekomplex ist äußerst sauerstoffempfindlich. Aerobe Cyanobakterien, die mithilfe der Nitrogenase Stickstoff fixieren, haben daher unterschiedliche Strategien entwickelt, um den Sauerstoffgehalt zum Zeitpunkt der Stickstofffixierung in der Zelle gering zu halten. In den einzelligen autotrophen Formen findet eine zeitliche Trennung statt. Die Stickstofffixierung ist durch einen Tag-Nacht-Rhythmus von der Sauerstoffproduktion durch die Photosynthese getrennt (Fay 1992, Bergmann et al. 1997). Einige filamentöse Cyanobakterien haben hingegen eine räumliche Trennung dieser beiden Prozesse vorgenommen. So findet die Photosynthese in den vegetativen Zellen statt, während die Stickstofffixierung in besonderen Zellen, den Heterocysten, abläuft (Wolk 1996). In diesen Zellen kommt kein PSII vor, somit unterbleibt die O2-Freisetzung. Außerdem ist die Atmungsrate gegenüber den vegetativen Zellen erhöht. Zusammen mit einer verdickten Zellwand, die Gasdiffusion in die Zelle erschwert, wird so für einen sehr geringen Sauerstoffpartialdruck in den Heterocysten gesorgt.

1.4.2 Die aufnehmende Hydrogenase

Die aufnehmende Hydrogenase kommt in allen stickstofffixierenden Cyanobakterien vor (Tamagnini et al. 2000) und somit nicht in Synechocystis sp. PCC 6803. Sie verbraucht den durch die Nitrogenase produzierten Wasserstoff über die Knallgasreaktion (2 H2 + O2 2 H2O), wodurch ATP gebildet wird. Durch den Verbrauch von Sauerstoff wird die Nitrogenase vor Inaktivierung geschützt (Bothe et al. 1977). Außerdem liefert die aufnehmende Hydrogenase Elektronen für die Nitrogenase.

Da ihr ein N-terminales Signalpeptid fehlt (Carrasco et al. 1995, Happe et al. 2000), ist die aufnehmende Hydrogenase sehr wahrscheinlich an die cytoplasmatische Seite der Thylakoid- oder Cytoplasmamembran gekoppelt (Appel und Schulz 1998).

1.4.3 Die bidirektionale Hydrogenase

Die bidirektionale Hydrogenase kann zum einen durch die Reduktion von Protonen Wasserstoff produzieren, zum anderen ist sie aber auch in der Lage, Wasserstoff zu verwerten:[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] Da sie aber einen geringen Km-Wert von 2,3 µM für Wasserstoff hat (Houchins und Burris 1981), wird vermutet, dass sie unter physiologischen Bedingungen bevorzugt in Richtung der Wasserstoffaufnahme arbeitet (Schmitz et al. 1995). Sie liegt löslich oder locker an die Membran gebunden vor (Serebryakova et al. 1994) und ist wie die Nitrogenase extrem sauerstoffempfindlich. Die biologische Aufgabe der bidirektionalen Hydrogenase ist noch nicht abschließend geklärt. Sie könnte bei höheren Lichtintensitäten als Elektronenventil im photosynthetischen Elektronentransport dienen (Appel et al. 2000). Es wird aber auch vermutet, dass sie durch die Oxidation von Wasserstoff Elektronen an die Atmungskette weitergibt (Schmitz et al. 1995).

Abbildung 1.5 zeigt die schematische Zusammensetzung des Enzyms. Es handelt sich um ein Pentamer, das aus einem Hydrogenaseteil, kodiert von hoxYH, und einem Diaphoraseteil, kodiert von hoxFU, aufgebaut ist. HoxE stellt eine weitere Diaphoraseuntereinheit dar.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der bidirektionalen Hydrogenase (verändert nach Tamagnini et al. 2002) Alle hox-Gene bilden im Genom von Synechocystis sp. PCC 6803 ein Operon, welches als ein einziges Transkript abgelesen wird (Phunpruch 1999) (Abbildung 1.6).

HoxH stellt die große Untereinheit des Hydrogenaseteils dar und enthält vier konservierte Cysteinreste, die an der Bindung eines Ni2 +-Ions im aktiven Zentrum beteiligt sind. Zwei dieser Cysteinreste binden darüber hinaus das Fe-Ion des aktiven Zentrums (Abbildungeiner Röntgenkristallstrukturanalyse von Desulfovibrio vulgaris; Cys: Cysteinrest, Ni: Nickelion, Fe: Eisenion, CO: Kohlenstoffmonoxid, X: Ligand zwischen Ni und Fe im oxidierten Zustand (verändert nach Foerster et al. 2003) 1.7). Die kleine Untereinheit, HoxY, besitzt vier Cysteinreste, die ein [4Fe4S]-Custer binden (Volbeda et al. 1995). Die große Untereinheit des Diaphoraseteils, HoxF, bindet NADP und FMN. Außerdem enthält es am C-Terminus vier Cysteinreste, die ein [4Fe4S]-Cluster koordinieren, und am N- Terminus eine Bindestelle für einen [2Fe2S]-Cluster. HoxU stellt die kleine Untereinheit der Diaphorase dar und hat am N-Terminus über vier Cysteinreste einen [2Fe2S]-Cluster gebunden. Darüber hinaus besitzt es ein Motiv, das einen [3Fe4S]- oder einen [4Fe4S]-Cluster (Appel und Schulz 1996, Schmitz und Bothe 1996) und noch zwei weitere [4Fe4S]-Cluster koordiniert. HoxE bindet einen [2Fe2S]-Cluster, so dass am Aufbau der Hydrogenase insgesamt 26 bzw. 27 Fe-Ionen beteiligt sind.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.6: hox-Operon von Synechocystis sp. PCC 6803 (Abbildung J. Appel)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.7: Modell des aktiven Zentrums der NiFe-Hydrogenase, angefertigt nach

1.5 Eisen und Nickel in Cyanobakterien

Eisen ist für Cyanobakterien ein essentielles Spurenelement, da es eine große Rolle in lebenswichtigen Prozessen spielt. So ist es z.B. maßgeblich in der Photosynthese und der Respiration an der Elektronenweiterleitung beteiligt.

Die Auswirkungen von Eisenmangel auf Cyanobakterien sind sehr gut untersucht (Straus 1994). Es sind verschiedene Wege bekannt, eine geringe Eisenkonzentration zu kompensieren. So weisen Cyanobakterien unter Eisenmangel einen deutlich geringeren Pigmentgehalt auf: Die Anzahl der Phycobilisomen wird reduziert und die Produktion von PSI und PSII aufgrund ihres hohen Eisenbedarfs eingeschränkt. Außerdem werden eisenhaltige Cofaktoren gegen solche ausgetauscht, die kein Eisen beinhalten. So wird z.B. Ferredoxin gegen Flavodoxin getauscht. Daneben gibt es noch eine Reihe weiterer physiologischer und morphologischer Veränderungen. Auch wenn weitestgehend alle eisenhaltigen Bestandteile der Zelle unter Eisenmangel untersucht wurden, gibt es bisher keine Aussagen darüber, wie die Zellen im Hinblick auf ihre Hydrogenase auf Eisenmangel reagieren.

Nickel ist ebenfalls wichtig für Cyanobakterien. Es sind bisher neun Nickelenzyme bekannt (Mulrooney und Hausinger 2003), von denen aber nur zwei in Synechocystis sp. PCC 6803 vorkommen. Neben der bereits beschriebenen NiFe-Hydrogenase gibt es noch die Urease (siehe 1.6). Beide Enzyme enthalten in ihrem aktiven Zentrum Nickelionen. Die Nickelaufnahme in Prokaryoten erfolgt über zwei Arten von Transportsystemen. Zum einen werden ABC-Transporter (ATP-binding cassettes), besonders gut charakterisiert in E. coli, verwendet. Zum anderen gibt es Nickel/Kobalt-Permeasen. Diese werden in drei Klassen eingeteilt. Es gibt selektive Nickeltransporter, z.B. HoxN aus Ralstonia eutropha, und weiterhin Nickel/Kobalt- Transporter, die eine höhere Affinität für Kobalt besitzen und solche, deren Affinität auf der Seite des Nickels liegt (Hebbeln und Eitinger 2004).

In Synechocystis sp. PCC 6803 wurde bisher kein Nickeltransporter gefunden. Wegen der beiden vorkommenden Nickelenzyme muss aber Nickel von den Zellen aufgenommen werden können. Über Sequenzanalysen wurde HupE als potentieller Nickeltransporter identifiziert (Dörte Hoffmann, persönliche Mitteilung), auch wenn die Homologie zu bekannten Nickeltransportern nicht sehr hoch ist.

1.6 Die Urease

Stickstoff ist ein lebenswichtiges Element, da es in den zwei dominierenden biologischen Makromolekülen, Proteinen und Nukleinsäuren, vorkommt. Cyanobakterien nutzen hauptsächlich anorganische Stickstoffquellen, wie z.B. Nitrat (siehe 1.7), Luftsticktoff (siehe 1.4.1) oder Ammonium. Einige Arten sind jedoch auch in der Lage, sich organischer Stickstoffquellen zu bedienen (Flores und Herrero 1994). So katalysiert die Urease (Urea-Amidohydrolase) die Umsetzung von Harnstoff (Urea) in Ammonium. Dabei bildet sich zuerst Ammonium und Carbamat. Das Carbamat zerfällt spontan in ein weiteres Ammonium und CO2, so dass insgesamt aus einem Molekül Harnstoff zwei Moleküle Ammonium entstehen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Urease besteht aus den Untereinheiten UreA (ca. 11 kDa), UreB (ca. 12-14 kDa) und UreC (ca. 60-61 kDa) und enthält im aktiven Zentrum zwei Ni2 +-Ionen. Zur Synthese des Apoproteins werden drei akzessorische Proteine (UreD, UreF und UreG) benötigt (Moncrief und Hausinger 1997). Es wird angenommen, dass die Nickelionen von dem Metallochaperon UreE angeliefert werden. Das Holoprotein entsteht mithilfe von CO2 unter GTP-Hydrolyse (Hausinger et al. 2001).

1.7 Die Nitratreduktase

Eine wichtige anorganische Stickstoffquelle stellt das Nitrat (NO3-) dar. Es wird mittels der Nitratreduktase zu Nitrit (NO2-) reduziert, welches über die Nitritreduktase weiter zu Ammonium (NH4+) reduziert wird.

Die Nitratreduktase der Cyanobakterien ist ein 75-85 kDa großes einzelnes Protein, dessen strukturelles Gen narB ist. Sie enthält in ihrem aktiven Zentrum, wie alle Nitratreduktasen, Molybdän als Cofaktor. In Bakterien handelt es sich dabei um den MGD-Cofaktor (bis-Molybdopteringuanindinukleotid) (Moreno-Vivián et al. 1999). Das Mo-Atom wird hierbei über zwei Pterin-Cofaktoren koordiniert, wobei jedes Pterin- Molkül ein Guaninnukleotid und verschiedene Liganden besitzt (Moura et al. 2004). Außerdem enthält das Enyzm einen N-terminalen [FeS]-Cluster, aber im Gegensatz zu den eukaryotischen Nitratreduktasen keine Häm-Gruppe (Moreno-Vivián et al. 1999).

Die Aufnahme des Nitrats in die Zelle erfolgt über ein von nrtABCD kodiertes Nitrattransportsystem. In den meisten Fällen bilden die Gene für die Nitritreduktase (nirA), das Nitrattransportsystem (nrtABCD) und die Nitratreduktase (narB) ein Operon (Luque et al. 1992). Im Genom von Synechocystis sp. PCC 6803 hingegen liegt nirA nicht in einem Cluster mit den anderen Genen (Kaneko et al. 1996). Sowohl die Nitratreduktase als auch die Nitritreduktase nutzen reduziertes Ferredoxin als Elektronendonator (Manzano et al. 1976) (Abbildung 1.4). Wie aus der Abbildung zu ersehen, katalysiert die Nitratreduktase folgende Reaktion:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das Nitrit wird mithilfe der Nitritreduktase zu Ammonium reduziert. Diese Reaktion verbraucht 6 Elektronen. Um ein Molekül Ammonium zu gewinnen benötigt die Zelle demnach 8 Elektronen. Das bedeutet, dass ein großer Anteil der Elektronen, die am Ferredoxin ankommen, in der Nitratreduktion verbraucht werden.

1.8 Verwendete Mutanten von Synechocystis sp.

Von Synechocystis sp. PCC 6803 wurden bereits zahlreiche Mutanten hergestellt. In dieser Arbeit wurde neben dem Wildtyp (WT) von Synechocystis sp. PCC 6803 (Anderson und McIntosh 1991) mit vier vom WT abgeleiteten Mutanten gearbeitet. Zum einen wurde die Deletionsmutante ΔhupE verwendet (zur Verfügung gestellt von Dörte Hoffmann, CAU Kiel). Das Gen hupE kodiert für ein Membranprotein, das aus mindestens sechs Transmembranhelices besteht und als potentieller Nickeltransporter in Synechocystis sp. PCC 6803 gilt (siehe 1.5). Daneben wurde eine weitere Deletionsmutante, kurz Ox genannt (zur Verfügung gestellt von Wim Vermaas, Arizona State University, USA), verwendet. Bei dieser Mutante sind alle drei respiratorischen terminalen Oxidasen des Elektronentransportes in Synechocystis sp. PCC 6803, die Cytochrom-c-Oxidase, die alternative Cytochrom-c-Oxidase und die Cytochrom-bd-Oxidase, ausgeschaltet (siehe Abbildung 1.4). Die Mutante betreibt deswegen keine Atmung mehr und ist ohne Licht nicht lebensfähig.

Darüber hinaus wurde mit einer Mutante (zur Verfügung gestellt von Kirstin Gutekunst, CAU Kiel) gearbeitet, genannt lux-11, die ein Konstrukt aus dem Promotorfragment des hox-Operons vor luxAB bzw. nur die Strukturgene luxAB der Luciferase enthalten. Die Luciferase katalysiert folgende Reaktion:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

RCHO ist ein Aldehyd, das natürlich lumineszierende Bakterien selbst herstellen. Die Proteine, die zur Synthese des Aldehyds notwendig sind, werden von luxCDE kodiert (Meighen 1991).

Der Promotor wurde nicht in den Synechocystis-WT transformiert, sondern in luxCDE-Mutanten von Synechocystis. Diese Mutanten enthalten die Gene zur Biosynthese des Aldehyds und wurden verwendet, um den toxischen Effekt der externen Aldehydzugabe zu vermeiden (Fernández-Piñas und Wolk 1994). Sie unterscheiden sich in ihrer Hydrogenaseaktivität nicht vom WT (Kirstin Gutekunst, persönliche Mitteilung) und wurden durch eine Transformation mit dem pILA-Vektor (Kunert et al. 2000), in den verschieden lange Promotorfragmente des hox-Operons (siehe Abbildung 1.6) kloniert wurden, hergestellt. In dieser Arbeit wurde mit der lux-11-Mutante gearbeitet. Sie enthält ein 702 bp langes Fragment des Hox- Promotors.

2. Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkung von abiotischen Faktoren auf die Expression und die Aktivität der bidirektionalen Hydrogenase von Synechocystis sp. PCC 6803 mithilfe des WT und verschiedener Mutanten zu untersuchen. Dadurch sollte ein besserer Einblick in die Funktion und Regulation der Hydrogenase gewonnen werden.

Im einzelnen wurden folgende Punkte bearbeitet:

1. Die Hydrogenase von Synechocystis sp. gehört zum NiFe-Typ. Wie in der Einleitung erwähnt, enthält das Enzym ein Atom Nickel und 26-27 Atome Eisen. Aus diesem Grund sollte der Einfluss der Eisen- und Nickelversorgung der Zellen und der Nickeltransport über die Membran untersucht werden. Hierzu wurde neben dem WT die hupE-Mutante untersucht. HupE stellt einen potentiellen Nickeltransporter dar.
2. Die Konzentration von CO2 und O2 haben direkte Auswirkungen auf den Elektronentransport. CO2 wird für die Dunkelreaktion benötigt und O2 in der Atmung. Ein Mangel an einem der beiden Stoffe sollte kompensatorische Reaktionen auslösen und Einfluss auf die Expression der Hydrogenase haben.
3. Die Stickstoffversorgung entweder mit Nitrat oder Ammonium verändert ebenfalls den Elektronenfluss, da in dem einen Fall mehr Elektronen in die Reduktion von Nitrat fließen müssen, die in dem anderen nicht benötigt werden. Es sind daher Veränderungen in der Aktivität der Hydrogenase, aber auch dem Wasserstoffmetabolismus insgesamt zu erwarten und zu messen. Außer dem WT kam hierbei die Ox-Mutante zum Einsatz. Ihr fehlen alle drei respiratorischen terminalen Oxidasen, weshalb keine Atmung mehr betrieben werden kann.

3. Material und Methoden

3.1 Arbeitsmaterialien

Die für diese Arbeit verwendeten Chemikalien besitzen den Reinheitsgrad „pro analysis“ und wurden von den Firmen Difco (Kansas City, USA), Fluka (Deisenhofen), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma (München) bezogen. Die Firmen Amersham Bioscience (Freiburg) und Roth (Karlsruhe) lieferten die verwendeten Antibiotika.

Die eingesetzten Medien und Lösungen wurden mit Aqua bidest. aus einer Seradest Anlage SD2000 (USF Elga Seral, Ransbach-Baumbach) hergestellt. Alle verwendeten Kulturmedien, Glas- und Kunststoffgeräte sowie die meisten Lösungen wurden bei 120 °C für 20-40 min autoklavie rt. Lösungen, die hitzeempfindliche Bestandteile aufwiesen, wurden mit Hilfe eines 0,2 µm Sterilfilters (Roth, Karlsruhe) filtriert.

3.2 Kulturmedien und Lösungen

Für die Versuche wurde BG11-Medium (Rippka et al. 1979) in verschiedenen Abwandlungen benutzt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

[...]

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Details

Titel
Der Einfluss abiotischer Umweltfaktoren auf die Hydrogenase des Cyanobakteriums "Synechocystis" sp. PCC 6803
Hochschule
Christian-Albrechts-Universität Kiel  (Botanisches Institut)
Note
1,65
Autor
Jahr
2005
Seiten
72
Katalognummer
V158493
ISBN (eBook)
9783640720323
ISBN (Buch)
9783640720729
Dateigröße
2011 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
Wasserstoffmessung, Nitratreduktase, CO2, Lumineszenz, OD-Messung, bidirektionale Hydrogenase, Eisenversorgung, Stickstoffversorgung, Wasserstoffmetabolismus
Arbeit zitieren
Melanie Egert (Autor), 2005, Der Einfluss abiotischer Umweltfaktoren auf die Hydrogenase des Cyanobakteriums "Synechocystis" sp. PCC 6803, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/158493

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