Versuchsprotokoll: Messung der Responsivität von TLR9 auf extrazelluläre Stimuli mittels Luziferase-Reportergen-Assay


Praktikumsbericht / -arbeit, 2011
4 Seiten, Note: 1

Leseprobe

Zielsetzung

Die Zellen des Immunsystems besitzen unterschiedliche Strategien zur Reaktion auf extrazelluläre Stimuli (z.B. Pathogene). Beginnend bei der Bindung des Antigens durch einen spezifischen Rezeptor wird eine intrazelluläre Signalkaskade in Gang gesetzt, die zumeist in einer Aktivierung von Trankskriptionsfaktoren (TF) resultiert. Diese TF vermitteln schließlich im Nukleus die transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen. Eine Rezeptorfamilie mit wichtiger Funktion bei der Immunantwort auf verschiedene Pathogene sind die sog. „toll- like“ Rezeptoren (TLR), deren Stimulation über die Aktivierung von Signaltransduktoren, z.B. des nukleären TF κB (NF-κB) im Falle des TLR9, die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen befördert.

Das Ziel dieses Versuchs war die Untersuchung der Stärke der Aktivierung von NF-κB als Reaktion des TLR9 auf unterschiedliche Antigene, um dadurch Aussagen über die natürlichen, spezifischen Liganden des Rezeptors treffen zu können.

In dem durchgeführten Versuch wurden TLR9-exprimierende HEK293-Zellen („human embryonic kidney cells“) verwendet und mit Plasmiden transfiziert, die für das Enzym Luziferase kodierende Gene enthielten, deren Promotoren eine NF-κB-spezifische Erkennungssequenz aufwiesen. Die Auslösung der TLR9-Signalkaskade durch ein passendes Antigen sollte sich daher in der Bildung von aktivem NF-κB niederschlagen und in der Folge die Transkriptionsaktivität des Reporterenzyms Luziferase erhöhen. Durch die Zugabe von Luziferin, das bei der Umsetzung durch die Luziferase bioluminesziert, war es aufgrund der Korrelation der Stärke eines TLR9-Stimulus mit dem bei der Reaktion emittierten Licht möglich, die immunologische Reaktion von TLR9-exprimierenden Zellen auf diverse Antigene zu untersuchen.

Mit dieser Technik wurden die bakteriellen Antigene Lipopolysaccharid (LPS) und Pam3Cys, PolyIC, ein Analogon viraler dsRNA, sowie die Oligodesoxynukleotide (ODN) 1668 (mit normalem CpG-Motiv) und 1720 (mit invertiertem CpG-Motiv) auf ihre Interaktion mit dem TLR9 getestet.

Erwartet wurde eine starke Reaktion auf das ODN 1668 aufgrund des enthaltenden, für den TLR9 hochaffinen CpG-Motivs als optimale Erkennungssequenz, wohingegen im Falle der Substanzen LPS, Pam3Cys und PolyIC durch das Fehlen dieser Sequenz von keiner NF-κB- Aktivierung ausgegangen wurde. Eine eventuelle schwache Antwort auf das ODN 1720, das sich vom ODN 1668 einzig durch die Inversion des CpG-Motivs unterscheidet, wurde diskutiert.

Ergebnisse

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Ergebnisse der Messung der Lumineszenz infolge der Luziferase-Reaktion

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 2: Darstellung der Messwerte in Relation zum absoluten Mittelwert der Kontrolle

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Diagramm 1: Mittelwerte der relativen Abweichungen der Lumineszenz vom Mittel der Kontrolle im Falle der fünf getesteten Antigene (mit Standardabweichung)

Diskussion

Anhand der Ergebnisse konnten unsere Erwartungen verifiziert werden.

Die Stärke der Lichtemission ist, wie oben erläutert, abhängig von der Aktivierung des TLR9 und nachfolgend des NF-κB. Aus diesem Grunde zeigte die Negativkontrolle, die ausschließlich Medium (DMEM + 10 % FCS) und keinen Stimulus enthielt, nur kaum Lumineszenz. Um signifikante Abweichungen von diesem „Hintergrund“ besser darstellen zu können, wurden die restlichen Werte in Relation zum arithmetischen Mittel der drei Kontrollwerte gesetzt (Tabelle 2, Diagramm 1).

Die bakteriellen Antigene sowie das dsRNA-Analogon zeigten mit der 0,97-fachen (LPS), der 0,56-fachen (Pam3Cys) bzw. der 1,06-fachen (PolyIC) Induktion keine statistisch bedeutende Abweichung vom Hintergrundwert. Dies legt den Schluss nahe, dass die drei Substanzen nicht vom TLR9 erkannt und somit nicht die intrazelluläre Signaltransduktion initiieren können. In der Folge wird kein aktives NF-κB gebildet, wodurch die Expression des Luziferase-Reportergens nicht ablaufen kann und damit die Katalyse der lumineszierenden Reaktion ausbleibt.

Im Falle des DNA-Oligonukleotids 1720 konnte zwar mit der 1,49-fachen Induktion eine stärkere Aktivierung des TF als bei den drei o.g. Pathogenen gemessen werden, jedoch ist der Unterschied zum Hintergrund nicht stark genug, um als statistisch relevant eingestuft zu werden.

Nach einer Aussetzung der HEK-Zellen mit dem ODN 1668 indes, lässt sich eine 34,83-fache Lumineszenz, verglichen mit der Kontrolle, beobachten. Die mit dem Wert verbundene hochsignifikante Abweichung spricht für eine starke Responsivität der Zellen für diesen Stimulus.

Aufgrund der Tatsache, dass die beiden getesteten ODN bis auf das invertierte CpG-Motiv des 1720-Strangs identisch sind, bestätigen die Ergebnisse unseres Versuchs das CpG-Motiv als spezifische Erkennungssequenz des TLR9. Die Spezifität des Rezeptors für dieses Motiv ist dabei derart ausgeprägt, dass schon die Inversion der beiden relevanten Basen ausreicht, um die Affinität für den Rezeptor um mehr als das 23-fache zu verringern. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass Proteine (LPS, Pam3Cys) bzw. RNA (PolyIC) nicht vom TLR9 erkannt werden, was den Stellenwert von CpG DNA bei der Stimulation einer TLR9- vermittelten Immunantwort weiter untermauert.

[...]

Ende der Leseprobe aus 4 Seiten

Details

Titel
Versuchsprotokoll: Messung der Responsivität von TLR9 auf extrazelluläre Stimuli mittels Luziferase-Reportergen-Assay
Hochschule
Philipps-Universität Marburg
Note
1
Autor
Jahr
2011
Seiten
4
Katalognummer
V182193
ISBN (eBook)
9783656057130
Dateigröße
485 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
tlr, toll like, luziferase, luziferin, hek293, responsivität, angeborene immunität, angeborenes immunsystem, NF-kB, CpG DNA
Arbeit zitieren
Sandro Halwe (Autor), 2011, Versuchsprotokoll: Messung der Responsivität von TLR9 auf extrazelluläre Stimuli mittels Luziferase-Reportergen-Assay, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/182193

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