Nachweis von verschieden Krankheitserregern auf Lebensmitteln durch Multiplex-PCR


Facharbeit (Schule), 2017
19 Seiten, Note: 1,00

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Materialien und Methoden
2.1. Sequenzrecherche
2.2. Sequenzanalyse
2.3. Primerdesign
2.4. Laborarbeit
2.4.1.Probenbeschaffung
2.4.2.DNA-Extraktion
2.4.3.Durchführung der PCR 2.4.3.1. Zusammensetzung des PCR-Reaktionsgemisches
2.4.3.2. Herstellung der PCR-Ansätze
2.4.3.3. Verwendete Materialien, Geräte und deren Einstellung
2.4.4.Gelelektrophorese
2.4.4.1. Verwendeter Marker
2.4.4.2. Geräte und Materialien

3. Ergebnisse
3.1. PCR vom 21.03.2016
3.2. PCR vom 18.05.2016
3.3. PCR vom 30.05.2016
3.4. PCR vom 01.08.2016

4. Diskussion
4.1. Deutung der Ergebnisse
4.1.1.PCR vom 21.03.2016
4.1.2.PCR vom 18.05.2016
4.1.3.PCR vom 30.05.2016
4.1.4.PCR vom 01.08.2016
4.2. Zeit-Kosten-Faktor
4.3. Vergleich zur herkömmlichen Methode

5. Zusammenfassung

6. Danksagung

7. Quellenverzeichnis

8. Anhang
8.1. Tab. 7: Überblick der Dimer-Bindungsenergien
8.2. Beispiel für Alignement
8.3. Beispiel für Primeranalyse

1. Einleitung

Die mikrobiologische Sicherheit von Lebensmitteln ist eine weltweite Gesundheitssorge, welche stetig wächst. Durch mangelnde Hygiene können bei dem Umgang mit leicht verderblichen Nahrungsmitteln Krankheitserreger auf den Menschen übertragen werden, was schwerwiegende Folgen haben kann. Die Süddeutsche Zeitung veröffentlichte einen Bericht über kontaminierte Lebensmittel, demnach jährlich 600 Mio. Erkrankungen auftreten, wobei 420.000 von ihnen tödlich enden (Süddeutsche Zeitung 2015). Diese Krankheiten werden von einer ganzen Reihe Bakterien, Pilzen und teils auch Viren verursacht. Dabei können die von Keimen ausgestoßene Giftstoffe - oder die Keime selbst, Symptome verursachen, deren Palette so breit ist, wie deren Auslöser. Zu den wichtigsten Bakterien, die für diese von verdorbenen Lebensmitteln verursachten Krankheiten verantwortlich sind, gehören unter anderem Salmonellen, Campylobacter, EHEC und Staphylococcus aureus (pta Forum 2015).

Aus dieser Problematik geht hervor, dass eine Methode benötigt wird, welche diese Krankheitserreger schnell auf Lebensmitteln nachweisen kann. Daher beschäftigt sich diese Seminararbeit mit der Fragestellung, ob es mithilfe der Multiplex-PCR möglich ist, häufig auftretende Krankheitserreger (Salmonellen, Campylobacter jejuni, EHEC und Staphylococcus aureus) auf Lebensmitteln schnell und kostengünstig nachzuweisen.

Die Salmonellen sind die wohl bekanntesten Vertreter unter ihnen. Diese Bakteriengattung kommt natürlicherweise in Tieren aller Art vor und somit auch in Tierprodukten, wie z.B. Fleisch oder Eiern. Die verschiedenen Varianten der Krankheitserreger (Serovare) können eine Vielzahl an unterschiedlich schweren Symptome hervorrufen, welche von Durchfall bis hin zu tödlichen Erkrankungen reichen. Salmonellen sind sehr widerstandsfähig, denn sogar außerhalb des Wirtskörpers sind sie wochenlang lebensfähig und selbst Temperaturen unter dem Gefrierpunkt töten sie nicht ab. (Wikipedia 1).

Ein ähnliches Krankheitsbild weisen auch Serovare der Gattung Campylobacter auf, der häufigste Auslöser ist der Serovar Campylobacter jejuni. Diese im Volksmund eher unbekannten Bakterien lösen die meisten Lebensmittelerkrankungen aus. Wie auch Salmonellen kommen sie in Tieren vor, doch der Unterschied besteht darin, dass sie hauptsächlich im Verdauungstrakt von Geflügel und vereinzelt auch Schweinen vorkommen. Der Krankheitsverlauf ist von Symptomen wie Durchfall geprägt und endet meist ohne schwerwiegenden Folgen. Außerhalb des Wirtes können sie sich unter natürlichen Bedingungen nicht weiter vermehren, doch wegen der geringen Menge, die benötigt wird, um einen Menschen anzustecken (bei Kindern etwa 500 Bakterienzellen) ist die Infektionsrate dennoch sehr hoch. (Wikipedia 2).

Recht seltene, dennoch sehr bekannte und gefährliche Bakterien gehören zu den Stämmen der enterohämorrhagische Escherichia coli (kurz: EHEC), welche zuletzt 2011 eine Epidemie in Deutschland mit 53 Todesfällen auslösten (BfR 2016). Die von EHEC produzierten Toxine zerstören die Zellen der Darmwand und der Blutgefäßwände, vor allem in Gehirn und Nieren (Wikipedia 3), was tödliche Folgen hat, falls die Infektion nicht rechtzeitig behandelt wird.

Staphylococcus aureus ist bekannt als einer der multiresistenten Krankenhauskeime. Schätzungen gehen von 1.500 bis 40.000 Todesfällen pro Jahr aus, somit verursacht er in Deutschland mehr Todesfälle als alle anderen Bakterien. Diese Gattung ist fast überall präsent, somit auch auf Lebensmitteln und ist für gesunde Menschen in der Regel ungefährlich. Doch sobald die Bakterien durch günstige Bedingungen oder durch ein geschwächtes Immunsystem des Wirts die Gelegenheit bekommen sich auszubreiten, kommt es zu schweren Symptomen, wie z.B. einer Lungenentzündung. Die Ausbreitung im Wirt ist in vielen Fällen dann kaum noch zu stoppen, da sehr viele Stämme gegen die meisten Antibiotika resistent sind und folglich stirbt der Wirt. (Wikipedia 4).

Mithilfe einer Multiplex-PCR Probe könnte man diese vier gefährlichen Keime schnell und einfach nachweisen, sodass man nach kurzer Zeit (etwa 2-3 Stunden) feststellen kann, ob die vorliegenden Lebensmittel gesundheitsgefährdende Keime enthalten. Dies ist in Bereichen notwendig, in denen entweder ein besonderes Gefährdungsrisiko vorliegt (z.B. im Krankenhaus), oder wo eine Abtötung potenzieller Keime aufgrund bestimmter Zubereitungsweisen nicht möglich ist (z.B. Fisch für Sushi- Gerichte).

2. Materialien und Methoden

Diese Seminararbeit beruht auf dem Prinzip der PCR-Methode (Mullis et al.; 1986) im Genaueren wurde die Multiplex-PCR angewandt, bei welcher mehrere Primerpaare zusammen in einem Reaktionsgefäß die PCR-Reaktion durchlaufen.

2.1. Sequenzrecherche

Zunächst galt es geeignete Gene zu finden, welche für das jeweilige Bakterium sehr spezifisch sind. Hierfür wurden einige wissenschaftliche Publikationen gelesen, welche diese Bakterien mittels PCR nachweisen wollten. Als geeignete Gene wurden genannt: für Salmonellen das Gen stn (Ziemer, Steadham; 2003), für Campylobacter jejuni das Gen mapA (Inglis, Kalischuk; 2003), für EHEC das Gen Shiga toxin 2 (Zhao et al.; 2001) und für Staphylococcus aureus das Gen nuc (Ali et al.; 2014). Zudem wurde ein Primerpaar für das Gen 16S rRNA designt, da dieses in allen Bakterien fast unverändert vorliegt und sich somit als Universalnachweis für Bakterien eignet (Takahashi et al.; 2014). Daraufhin wurden einige Zielsequenzen der einzelnen Gene und Sequenzen nahverwandter Bakterien, welche mittels des Dienstes BLAST (Online-Dienst 4) ermittelt wurden, bei Genbank (Online-Dienst 1) gesucht. Dies erfolgte mithilfe der lat. Namen der Bakterien und Namen der Zielgene.

Die Hühnchenprimer wurden freundlicherweise von dem Schülerkurs „Welches Tier steckt in der Wurst“ von Herrn Dr. Helms, zur Verfügung gestellt.

2.2.Sequenzanalyse

Zur genaueren Analyse wurden die Sequenzen bei Genbank heruntergeladen und mit dem Software- Paket BioEdit (Software 1) analysiert (→File →Import →Sequence alignment file). Das

Alignment wurde dort erstellt (→Accessory Application →ClustalW Multiple

alignment →Run ClustalW →OK), um mögliche Gemeinsamkeiten, bzw. Unterschiede der

Basenpaarabfolge erkennen zu können. Durch den Vergleich von mehreren Zielsequenzen des gesuchten Organismus, erhält man einen Eindruck von intraspezifischer Variabilität. Mit den Sequenzen nahverwandter Organismen, welche man nicht nachweisen möchte, erkennt man konstante Eigentümlichkeiten. Wägt man nun beides miteinander ab (möglichst wenig intraspezifische Unterschiede, möglichst viele interspezifische Unterschiede), erhält man geeignete Sequenzabschnitte für das Primerdesign. Ein Beispiel für ein Alignement befindet sich im Anhang unter 8.2.

2.3. Primerdesign

Hat man nun einen geeigneten Abschnitt gefunden, kann man innerhalb dieses Abschnitts ein Primer- Motiv, je nach GC-Gehalt, mit der Länge von 20-30 Basenpaaren auswählen und auf seine Schmelztemperatur untersuchen lassen (Online-Dienst 2). Diese sollte bei allen Primern etwa bei 60°C liegen, damit die Primer zusammen im Thermocycler laufen können. Je nachdem kann der Primer am 5‘-Ende verlängert oder gekürzt werden, um auf die gewünschte Schmelztemperatur zu kommen.

Bei der Multiplex-PCR ist es noch wahrscheinlicher und kritischer, dass die Primer untereinander Dimere bilden und somit nicht mehr der PCR-Reaktion zur Verfügung stehen.

Um diese Gefahr zu verringern, wurden die einzelnen Primer miteinander mithilfe des OligoAnalyzer

3.1 (Online-Dienst 3) auf ihre möglichen Dimere (insgesamt wurden hierfür 74 Kombinationen getestet) und Haarnadelschleifen (Hairpins) überprüft. Hierbei sollte ∆G(kcal/mole) über -8 liegen, doch dies lässt sich bei der Multiplex-PCR nicht in jedem Fall einhalten. Trotzdem wurde versucht, die einzelnen Bindungsenergien möglichst gering zu halten. Eine Tabelle mit einem Überblick der Dimere und ein Beispiel für die Primeranalyse findet man unter 8.1. und 8.3. im Anhang.

Die Primer wurden auf ihre Spezifität mittels BLAST (Online-Dienst 4) untersucht. Dabei wurde die Primersequenz eingegeben und die Zielorganismen ausgeschlossen, somit erhält man eine Liste mit Organismen, welche die gleiche Sequenz der Primer haben. Sollte ein Organismus dabei sein, bei welchem es wahrscheinlich wäre, dass er in der Probe enthalten ist und man ihn nicht nachweisen möchte, dann wäre es sinnvoll, neue Primer zu designen. Die hier verwendeten Primer sind auf ihr Zielorganismus spezifisch und passen nicht zu anderen Organismen, welche in den Proben enthalten sein könnten.

Hat man geeignete Primersequenzen gefunden, kann man sie nun bei BioEdit einfügen (→Sequence →New Sequence →Sequence Type:DNA →Apply and Close).

Bei den Rückwärtsprimern ist zu beachten, dass sie als reverses Komplement vorliegen (→Sequence →Nucleic Acid →Reverse Complement). Die Primeranalysen und Hetero-Dimere befinden sich im Anhang.

2.4. Laborarbeit

2.4.1. Probenbeschaffung

Zu Beginn wurden Proben mit dem Primer-Mix mit Hühnchenprimer als Positivkontrolle untersucht. Die vier Produkte stammen aus dem Supermarkt und gleich nach dem Einkauf wurden die Proben genommen.

Um die neuen Primer für 16S-rRNA als Positivkontrolle zu testen, wurden insgesamt 18 verschiedene Speichel und Umweltproben genommen.

Insgesamt wurden mit dem Primer-Mix mit 16S-rRNA 11 Proben getestet. Diese wurden bei Fleisch von der Oberfläche mit einem Skalpell abgekratzt und in einem Reaktionsgefäß (1,5ml) 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, um mögliche Keime etwas inkubieren zu lassen. Danach wurden die Proben bei -16°C tiefgefroren. Das Skalpell wurde nach jeder Benutzung gereinigt und desinfiziert, um die möglichen Kontaminationen möglichst gering zu halten. Bei Eierschalenproben wurde die Schale mit einem Stück Watte und etwas Wasser abgerieben und danach durchlief dieses Stück Watte den gleichen Vorgang wie bei Fleischproben. Nähere Details zu den Proben sind bei den Ergebnissen aufgeführt.

Für die Versuchsreihe mit den DNA-Extrakten wurden die gleichen Proben verwendet.

2.4.2. DNA-Extraktion

Bei den PCR-Durchgängen 1-3 fand keine DNA-Extraktion statt, sondern es wurde die Zahnstochermethode angewendet. Hierbei wurde mit einem Zahnstocher ein Abrieb der Probe genommen und in das PCR-Reaktionsgemisch gegeben.

Für den PCR-Durchgang vom 01.08.2016 wurden aus den Proben DNA-Extrakte mithilfe des DNeasy® Blood & Tissue Kit hergestellt. Dabei wurde streng nach der vorgegebenen Anleitung (QIAGEN 2011) gearbeitet.

2.4.3. Durchführung der PCR

2.4.3.1. Zusammensetzungen der PCR-Reaktionsgemische

Die jeweiligen PCR-Reaktionsgemische sind zusammengesetzt aus einem Mastermix und den jeweiligen Primern. Somit ist eine beliebige Kombination aus Primerpaaren möglich, die je nach Absicht variiert. In den folgenden Tabellen werden die Zusammensetzung des Mastermixes, Primer und Primerkombinationen in den einzelnen PCR-Durchläufen dargestellt.

Tab. 1: Primer

Abbildung in dieser Leseprobe nicht1 enthalten

[...]


1 Quelle: Schülerforschungszentrum, Dr. Helms

Ende der Leseprobe aus 19 Seiten

Details

Titel
Nachweis von verschieden Krankheitserregern auf Lebensmitteln durch Multiplex-PCR
Note
1,00
Autor
Jahr
2017
Seiten
19
Katalognummer
V356915
ISBN (eBook)
9783668431461
Dateigröße
658 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
PCR, Keime, Krankheitserreger, Bakterien, EHEC, MRSA, Lebensmittel
Arbeit zitieren
Christian Hollard (Autor), 2017, Nachweis von verschieden Krankheitserregern auf Lebensmitteln durch Multiplex-PCR, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/356915

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