Modellorganismen Spermatozopsis Similis und Chlamydomonas Reinhardtti. Eine Untersuchung der Cytoskelette und Basalapparate


Hausarbeit, 2012
18 Seiten, Note: 1,8

Leseprobe

Zusammenfassung

Die einzelligen, zweigeißeligen Grünalgen Spermatozopsis similis und Chlamydomonas reinhardtii stellen wichtige Modellorganismen für die Anwendung der cytobiologischen Methoden SDS-Page, Western Blot, die Transmissionselektronen-Mikroskopie sowie die Analyse der Funktion und die Proteinzusammensetzungen des Basalkörper.

Im Vordergrund dieser Arbeit steht das Cytoskelett und der Basalapparat. Von Bedeutung ist die Analyse und Lokalisation des Proteins α-Tubulin und die des Proteins Centrin. Über die Verteilung von Centrin im Basalapparat hinaus befindet sich Centrin in der distalen Verbindungsfibrille und im Basalkörper, wobei die Asymmetrische Struktur eine Rolle spielt.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die einzelnen Strukturen des Basalapparates der isolierten Cytoskelette in all ihren Bestandteilen analysiert werden konnten, um einen genaueren Einblick in den Aufbau der Cytoskelette der beiden Modellorganismen zu erhalten, da der Basalkörper eine sehr wichtige Rolle in eukaryotischen Zellen darstellt. Außerdem wird Centrin für die Verdopplung der Centriolen benötigt.

Auf Grund der cytobiologischen Methoden ist es uns heute möglich, eine detaillierte Forschung des Cytoskelett der Modelorganismen Spermatozopsis similis und Chlamydomonas reinhardtii zu betreiben und hoffen weiterhin auf neue Resultate auf diesem Gebiet.

Einleitung

Das Cytoskelett der eukaryotischen Zellen ist ein dynamisches, cytoplasmatisches Netzwerk bestehend aus 3 Proteinfilamenttypen. Die Mikrotubuli, die Mikrofilamente und die Intermediärfilamente unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Zusammensetzung, ihrem Aufbau und ihrer Funktion. Das Cytoskelett begeißelter Zellen z.B. der einzelligen Grünalgen Spermatozopsis similis und Chlamydomonas reinhardtii besteht aus einem Geißelapparat. Dieser Geißelapparat setzt sich aus dem Axonema und dem Basalapparat zusammen. Der Basalapparat besteht aus dem Basalkörper und weiteren assoziierten Strukturen. Die Geißelwurzeln verbinden den Basalkörper mit den Zellorganellen und sorgen dadurch für den Verlauf der Geißelwurzeln bzgl. der Zellform. Der Basalkörper dient als Bildungszentrum für die Geißel sowie als ein Organisationszentrum für das Cytoskelett.

Man unterscheidet u.a. bei der zweigeißeligen Grünalge Spermatozopsis similis 2 Klassen von fibrillären Geißelwurzeln: einerseits die mit den mirkotubulären Geißelwurzeln assoziierten System-1-Fibrillen namens SMAF („striated microtubule associated fibers“), andererseits die System-2-Fibrillen, die NBBC („nulceus-basal body connector“).

Die Proteinzusammensetzung, sowie die ubiquitär verbreiteten centrosomalen Proteine, wie Centrin und α-Tublin der isolierten Cytoskelette, lassen sich durch cytobiologische Methoden wie die differentielle Zentrifugation, die SDS-Page (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) und durch den Western-Blot nachweisen. Des Weiteren erfolgt die ultrastrukturelle Lokalisation der Proteine im Cytoskelett durch die Immunfluoreszenz-Mikroskopie und die Immunogold-Elektronenmikroskopie.

Material und Methoden

SDS-Page der verschiedenen Bestandteile des Cytoskeletts der Grünalge Spermatozopsis similis

Die Durchführung, Materialien (z.B. Puffer) sowie die Methoden wie z.B. die differentielle Zentrifugation wurden wie im Skript (Seiten 8-13) vorgenommen.

Es erfolgte anschließend eine Durchführung der Proteinbestimmung nach Neuhoff. An Hand der ermittelten Werte wurde eine Eichgerade erstellt und die Menge in µl der einzelnen Proben konnte bestimmt werden, die dann in die einzelnen Taschen der SDS-Page aufgetragen werden.

Antikörperfärbung des Western-Blot

Die Durchführung und Handhabung der Materialien und Methoden erfolgte wie im Skript (Seite 15) beschrieben. Der verwendete Stamm: Spermatozopsis similis.

Indirekte Immunofluoreszenz-Mikroskopie der Cytoskelette der Grünalge Spermatozopsis similis

Die Materialien, die Durchführung der Methoden sind wie im Skript (Seite 16, 17) beschrieben.

Es wurde ein Axiophot Fluoreszenzmikroskop mit der Leica CDF369FX Kamera verwendet.

Für die „Multiwell“-Objektträgern wurde ein Volumen von ca. 25 bis 30µl pro Well verwendet. Der primäre Antikörper wurde bei Well 3, ein monoklonaler anti-Centrin mit einer Verdünnung von 1:1 und ein monoklonaler anti-α-Tubulin 1:80, aufgetragen. Bei Well 7 befand sich Anti-α-Tubulin (Verdünnung 1:50) für die Gruppen A bis D und für die Gruppen E bis G eine Verdünnung von 1:100. Auf alle weiteren Wells wurde der übliche Blockpuffer aufgetragen.

Als sekundäre Antikörper bei Well 2 und 3 diente Anti-Maus-IgG-Cy3-Konjugat (Verdünnung von 1:600) und bei Well 6 und 7 das Anti-Kaninchen-IgG-Oregon Green 488- Konjugat (Verdünnung 1:500).

Transmissionselektronenmikroskopie

Immunogoldmarkierung von isolierten Cytoskeletten der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii

Diese Methode wurde wie im Skript (Seite 20, 21) beschrieben durchgeführt.

„Whole-mount“- Elektronenmikroskope isolierter Cytoskelette von Spermatozopsis similis

Die Durchführung, die Materialien sowie die Methoden wurden gemäß Skript (Seite 18- 20) vorgenommen. Das Transmissions-Elektronenmikroskop JEM-2100 der Firma JEOL und der Gatan Erlangshen ES500W CCD-Kamera wurde verwendet.

Serienschnitte des Basalapparates der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii

Die Vorbereitung für die Serienschnitte unter dem Transmissionselektronenmikroskop erfolgte wie im Skript beschrieben. Es wurde das Transmissions-Elektronenmikroskop JEM-2100 der Firma JEOL und Gatan Erlangshen ES500W CCD-Kamera verwendet.

Ergebnisse

SDS-Page der verschiedenen Bestandteile des Cytoskeletts der Grünalge Spermatozopsis similis

Nach der Isolierung der Bestandteile der Cytoskelette wie der „Ganzen Zellen“, des „Cytoskelett“ und des „Cytosol“ aus der Grünalge Spermatozopsis similis durch die differentielle Zentrifugation, erfolgte das Auftragen in die einzelnen Taschen der SDS-Page. Die Proteine werden nach ihrer Molekülgröße getrennt.

In Abb.1 erkennt man das Ergebnis der durchgeführten SDS-Page. Die mit dem Stern ( ) markierten Banden zeigen, dass es sich um das Hauptprotein Tubulin mit einem Molekulargewicht (MG) von 55kDa handelt. Das Molekulargewicht von Tubulin ist weit höher als das von Centrin. Im Fall von Centrin beträgt dieses ca. 20kDa und wurde in Abb. 1 mit einem Dreieck ( ) gekennzeichnet.

Bei ca. 200kDa befindet sich in Tasche 2 und 3 ein Protein, welches als Pfeil ( ) markiert wurde. Als Beispiel ist zu erwähnen, dass keine Bande bei 14,5 kDa (Lysozym) und somit kein Protein zu erkennen ist.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: SDS-Page. Links: Auftragung des Markers M (Roti®-Mark Standard, Roth) von 5µl. Bande 1: Darstellung der „Ganzen Zellen“(GZ), Auftragung von 4µl. Bande 2 stellt das „Cytoskelett“ (CSK) dar. Aufgetragen wird 3µl. Bande 3: Darstellung des „Cytosol“ (CSO). Die Auftragung erfolgt mit 1,2µl.

Mit dem Stern markierte Bande stellt das Protein Tubulin mit einem Molekulargewicht von 55kDa dar. Die mit dem Pfeil markierten Banden haben ca. ein Molekulargewicht von 200 kDa. Das Protein Centrin mit einem Molekulargewicht von 20 kDa wird durch die mit dem Dreieck markierte Bande dargestellt.

Antikörperfärbung des Western-Blot

Bei Tasche 2 ist zu erkennen, dass bei der Amidoschwarz-Färbung die Proteinbande Tubulin im Vergleich zu den anderen beiden Banden nur schwach sichtbar ist.

Die Antikörperfärbung des Western-Blots zeigt, dass eine geringe Probenkonzentration des Cytoskeletts vorhanden ist. Man sieht in Abb. 2 kein Centrinsignal. Die Taschen 1 bis 3 von Anti-Centrin sind leer.

Deutlich zu erkennen ist das Protein Tubulin mit einem Molekülgewicht von 55kDa bei Tasche 1 und 2 von Anti-α-Tubulin. Man sieht klar die monospezifische Reaktion der Großen Untereinheit der RuBisCo (Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase) bei 55kDa.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: Antikörperfärbung Western Blots. Links: Marker-Tasche (M) mit Angabe der Molekülgröße in kDa. Auftragung von 5 µl Amidoschwarz; Tasche 1 bis 3. Auftragung von 6µl „Ganzen Zellen“ (GZ), 3µl von „Cytoskelett“ (CSK) und 8µl von „Cytosol“ (CSO). Monoklonaler Anti-Centrin auf Bande 1 bis 3: Auftragung von 6µl GZ, 3µl CSK und 8µl CSO. Monoklonales Anti-α-Tubulin Bande 1-3 rechts: Auftragung von 2µl GZ, 1µl CSK und 3µl CSO. Sternmarkierung: Protein Tubulin.

Indirekte Immunofluoreszenz-Mikroskopie der Cytoskelette der Grünalge Spermatozopsis similis

Man kann in Abb. 3A Centrin (zwei grün fluoreszierende Spots) deutlich erkennen, die den Basalapparat darstellen.

Die DNA, die mit dem fluoreszierenden Farbstoff DAPI (4‘6-diamidino-2-phenylindole) angefärbt worden ist, wird in Abb. 3B als große blaue fluoreszierende Punkte wahrgenommen. Tubulin hingegen ist in Abb.3C in rot fluoreszierender Farbe dargestellt. Ersichtlich sind das komplette Cytoskelett mit bananenförmiger Struktur und die Geißeln. Bei Tubulin handelt es sich um den Grundbaustein des Proteinfilaments Mikrotubulus.

Die Abb. 4 zeigt die eben genannten angefärbten Proteine in schwarzweiß.

Um die einzelnen Postionen der Proteine zu verdeutlichen, wurden die einzelnen Bilder A, B und C übereinander gelegt (Abb.5).

Erkennbar sind die einzelnen Positionen der Bestandteile des Cytoskeletts.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3: Indirekte Immunofluoreszenz-Mikroskopie. Darstellung in Farbe. Bild A: Sichtbarmachung von Centrin (grün) der isolierten Cytoskelette von Spermatozopsis similis. Bild B: Darstellung der DNA (blau). Bild C: Darstellung von Tubulin (rot).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.4: Indirekte Immunofluoreszenz-Mikroskopie. Darstellung in Schwarz-weiß. Bild A: Sichtbarmachung von Centrin der isolierten Cytoskelette von Spermatozopsis similis. Bild B: Darstellung der DNA. Bild C: Darstellung von Tubulin.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.5: Darstellung des Cytoskeletts (in Farbe) durch die Indirekte Immunofluoreszenz-Mikroskopie. Centrin, DNA und Tubulin wurden übereinander gelegt.

Transmissionselektronenmikroskopie

Immunogoldmarkierung von isolierten Cytoskelleten der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii

Im Vordergrund steht die Lokalisation von α-Tubulin und Centrin im Basalapparat bzw. im Cytoskelett von Chlamydomonas reinhardtii. In Abb. 6 befindet sich eine schematische Darstellung der Centrin-Verteilung im Basalapparat. Von Bedeutung sind die beiden Geißeln, die am Basalkörper anhaften. Die erste Geißel (Abb.6/1) steht für den „älteren“ Basalkörper und die zweite Geißel (Abb.6/2) für den „jüngeren“ Basalkörper.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 6: [1] Immunogoldmakierung von Ultradünnschnitten unter Einbettung der isolierten Cytoskeletten von Chlamydomonas reinhardtii. Schematische Darstellung der Centrinverteilung (blau markiert) im Basalapparat. Darstellung des Basalapparates mit 2 Geißeln am Basalkörper (1 und 2).

Abkürzungen: pbb: two probasal bodies; dcf: distal connecting fiber; 1s, 1d, 2s, 2d entsprechend den Geißelwurzeln; SMAF: striated microtubule-associated fibers; tf: transitional fibers, NBBC: nucleus-basal body connector.

[...]


[1] Abbildung von W estermann und Geimer („Centrin im Basalapparat von Chlamydomonas“), Bildunterschrift modifizert

Ende der Leseprobe aus 18 Seiten

Details

Titel
Modellorganismen Spermatozopsis Similis und Chlamydomonas Reinhardtti. Eine Untersuchung der Cytoskelette und Basalapparate
Hochschule
Universität Bayreuth
Note
1,8
Autor
Jahr
2012
Seiten
18
Katalognummer
V374797
ISBN (eBook)
9783668522503
ISBN (Buch)
9783668522510
Dateigröße
1285 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
Cytoskelett, Basalapparat, Proteine, Modelorganismen, Transmissionselektronen-Mikroskopie, Chlamydomonas
Arbeit zitieren
Eva Maria Kalbhenn (Autor), 2012, Modellorganismen Spermatozopsis Similis und Chlamydomonas Reinhardtti. Eine Untersuchung der Cytoskelette und Basalapparate, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/374797

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