Vorgänge in der Säule (Injektion):

Während des Säulendurchlaufes

Am Ende des Säulendurchlaufes

Unter idealen Bedingungen, d.h. bei Verwendung von unpolaren Trennflüssigkeiten gilt: Eine Trennung ist möglich, wenn die Siedepunkte der Komponenten verschieden sind. Auftrennung erfolgt in der Reihenfolge der Siedepunkt.

Bei unpolaren Trennflüssigkeiten sind die Wechselwirkungskräfte Komponente/Trennflüssigkeit im Allgemeinen gering. Bei gleichen Siedepunkten ist eine Trennung möglich, wenn sich die Komponenten in den relativen Wechselwirkungskräften gegenüber der Trennflüssigkeit unterscheiden.

Unter realen Begingungen gilt also: 2 Komponenten lassen sich bei gleichen Siedepunkten umso besser trennen je größer der Unterschied in der Wechselwirkungen mit der Trennflüsigkeit ist. Bei gleichen Siedepunkten wandern insbesondere polare Komponenten auf polaren Trennflüssigkeiten im Allgemeinen langsamer als unpolare. Erhöht man die Arbeitstemperatur so reichern sich die Komponenten in der mobilen, d.h. kürzere Aufenthaltszeiten, d.h. im Allgemeinen schlechtere Trennungen. Bei tiefer Temperatur steigen im Allgemeinen die Unterschiede in den Retensionszeiten, dafür verbreitern sich aber die Peaks.

Anmerkung: ähnlicher Effekt bei einer zu kleinen Strömungsgeschw-indigkeit. 1.6.2.) Erläuterung des Chromatographie-Prinzips am Beispiel der GC

Die Komponenten der Analysenprobe verteilen sich in unterschiedlichem Ausmaß zwischen der stationären und moblen Phase. Diejenigen Moleküle, welche in die mobile Phase gelangen werden weiter transportiert und verteilen sich im nächsten Abschnitt der Säule erneut zwischen den beiden Phasen.

Für eine Modellrechnung unterteilt man die Säule in einzelne Abschnitte, innerhalb derer sich die Verteilungsgleichgewichte zwischen mobiler und stationärer Phase einstellen sollen. Die Lage des Verteilungsgleichgewichtes sei urch den Verteilungskoeffizienten beschrieben: Stoffemenge der Komponente i in der mobilen Phase i = K

Stoffemenge der Komponente i in der stationären Phase

= V stationäre V mobil ( ) ( )

Die Trennung selbst wird in Doppelschritte unterteilt:

Schritt A Schritt B

Die flüssigchromatographische Trennung einer Siebenstoffmischung von Herbiziden(UnkrautvernichtungsmittelN) in 6 Minuten wäre vor zehn Jahren eine Sensation gewesen.

Bis dahin war eine derartige Leistungsfähigkeit nur in der Gaschromatographie möglich. Mit Flüssigchromatographie in Säulen dauerten Trennungen nicht selten stundenlang. Die Dünnschichtchromatographie reduzier-te die benötigte Analysenzeit auf weniger als eine Stunde, doch sind ihre unmittelbaren Resultate qualitativer Art (Lage der Substanzflecken), besten-falls halbquantitativ (Größe der Flecken). Um eine quantitative Aussage zu erhalten, ist bereits ein ziemlicher Aufwand nötig; das Problem scheint noch nicht ganz gelöst zu sein. Dagegen liefert ein Chromatogramm, wie es in der Abbildung gezeigt wird, unmittelbar eine qualitative wie auch quantita-tive Aussage: Die Elutionszeit (Zeit, nach welcher das Signal auf dem Schreiber erscheint) ist bei den gewählten Bedingungen für jeden Stoff des Gemisches chrakteristisch und die Fläche jedes Signals ist der Menge des entsprechenden Stoffes proportional.

0 1 2 3 4 5 6 min

E

in anderes Beispiel: Die wohl schnellste Coffeinbestimmung in Getränken läßt sich mit moderner Flüssigchromatographie realisieren. Es genügt näm-lich, trinkfertigen Kaffee, Tee oder Coca-Cola auf eine geeignete Säule einzuspritzen. Das quantitative Signal liegt nach 5 Minuten vor. Aus diesen Beispielen ist zu erkennen, daß diese neue Chromatographie-Methode sehr leistungsfähig ist, das heißt, sie liefert gute Trennungen in kurzer Zeit. HPLC ist die Abkürzung für:

- High Performance Liquid Chromatographie

- Hoch Leistungs Flüssig Chromatograhpie

Schon die Erfinder der modernen Chromatograhie, Martin und Synge, zeigten 1941 mit theoretischen Überlegungen, daß für eine wirksame Chromatographie in flüssiger Phase n sehr kleine Teilchen für die stationäre Phase und dementsprechend

n hoher Druck zum Durchpressen der mobilen Phase notwendig sind. HPLC heißt deshalb auch: n High Pressure Liquid Chromatographie n Hoch Druck Flüssig Chromatographie

Definition:

Chromatographie ist ein Trennprozeß, bei welchem das Probegemisch zwischen zwei Phasen im chromatographischen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird. Eine Hilfsphase ruht, die andere Hilfsphase = stationäre Phase: entweder festes, poröses, oberflächenaktives Material in kleinen Teilchen oder festes Trägermaterial, das mit einem dünnen Flüssigkeitsfilm bedeckt ist. Strömende Hilfsphase = mobile Phase: Gas oder Flüssigkeit.

Verwendet man ein Gas, so spricht man von Gaschromatographie; bei allen Arten von Flüssigchromatographie (inkl. Dünnschichtchromatographie) ist die mobile Phase flüssig.

Experiment:

Trennung von Farbstoffen: Man fülle eine "klassische" Chromatographiesäule mit Hahn (oder ein unten verjüngtes Glasrohr von ca. 2cm Durchmesser mit Schlauchquetschhahn) etwa 20cm hoch mit einer Suspension von Kieselgel in Toluol. Nach dem Absetzen der Füllung bringt man mit einer Mikroliterspritze 50 bis 100µl Farbstofflösung (z.B. Testfarbstoff Gemisch II N der Firma Camag, Muttenz/Schweiz) auf das Bett und eluiert mit Toluol.

Beobachtung:

Die verschiedenen Farbstoffe wandern verschieden schnell durch die Säule. Das Auftrennen in sechs Zonen ist die Folge Fettrot 7B, Sudangeld, Sudanschwarz, Fettorange und Artisilblau 2RP. Stoffe, die sich bevorzugt in der mobilen Phase aufhalten, wandern rascher als Stoffe, die sich bevorzugt in der stationären Phase aufhalten.

Flüssigchromatische Trennverfahren

Die Silanolgruppen sind die aktiven Zentren des Silicagels (beim Aluminiumoxid sind es vorwiegend die Al3+ Zentren). Diese Gruppen gehen mit jedem in der Nähe liegenden Molekül eine schwache Bindung ein, wenn folgende Wechselwirkung möglich ist: Dipol-induzierter Dipol Dipol-Dipol Wasserstoffbrückenbindung Komplex-Bindung

Trägt ein Probemolekül eine funktionelle Gruppe (für die Komplex-Bindung eine Doppelbindung), so besteht die Möglichkeit einer Wechselwirkung mit den Silanolgruppen. Daraus erkennt man, daß Alkane, die nur aus >C< und >H< Atomen bestehen und auch keine Doppelbingungen enthalten, kaum in Wechselwirkung treten können; aufgrund dessen also schlecht getrennt werden können.

Die Stärke der Adsorption nehmen in folgender Reihe zu:

gesättigte KW's < Olefine < Aromaten ~ organische Halogenverbindungen < Sulfide < Äther < Nitroverbindungen < Ester ~ Aldehyde ~ Ketone < Alkohole ~ Amine < Sulfone < Sulfoxide < Amide < Carbonsäuren.

• Besitzt ein Molekül mehrere funktionelle Gruppen, so be• stimmt die polarste das Adsorptionsverhalten.

•

• Folgerungen:

•

• 1. Das Silicagel ist umgeben von der mobilen Phase, welche

• mit dem Silicagel mehr oder weniger stark in Wechsel-

• wirkung tritt. Das Probemolekül tritt nur dann in

• Wechselwirkung, wenn diese größer ist als die des

• Lösungsmittels.

•

• 2. Die Moleküle ordnen sich so an, daß die funktionelle

• Gruppe nahe am Adsorbens liegt. Die Alkanreste ragen

• wie Schwänze davon weg.

• Es werden also keine Unterschiede bei unterschiedlichen

• Alkanresten erkannt.

• Ein Gemisch aus Butanol, Pentanol und Octanol läßt sich

• also nicht gut trennen.

Flüssigchromatische Trennverfahren

1. Adsorptionschromatographie:

• Besitzt ein Molekül mehrere funktionelle Gruppen, so be• stimmt die polarste das Adsorptionsverhalten.

•

• Folgerungen:

•

• 1. Das Silicagel ist umgeben von der mobilen Phase, welche

• mit dem Silicagel mehr oder weniger stark in Wechsel-

• wirkung tritt. Das Probemolekül tritt nur dann in

• Wechselwirkung, wenn diese größer ist als die des

• Lösungsmittels.

•

• 2. Die Moleküle ordnen sich so an, daß die funktionelle

• Gruppe nahe am Adsorbens liegt. Die Alkanreste ragen

• wie Schwänze davon weg.

• Es werden also keine Unterschiede bei unterschiedlichen

• Alkanresten erkannt.

• Ein Gemisch aus Butanol, Pentanol und Octanol läßt sich

• also nicht gut trennen.

• 3. Die Stärke der Wechselwirkung hängt auch von räumlichen

• Gegebenheiten ab. Daher können Isomere gut mit der Ad• sorptionschromatographie getrennt werden.

•

• Beispiel: Trennung von Azofarbstoffen

•

• 1. Fettrot 7b

• 2. 1[(p-n-buthylphenyl)-azo]-2-Naphthol

• 3. 1[(p-methoxyphenyl)azo]-2-Naphthol

• 4. 1[(m-methoxyphenyl)azo]-2-Naphthol

• 5. 1[(o-methoxyphenyl)azo]-2-Naphthol

• Prinzip

• Um die Reversed Phase handelt es sich, wenn die statio-

• näre Phase weniger polar ist als die mobile Phase. Am

• häufigsten verwendet man chemisch gebundenes Octadecyl-

• silan (ODS), ein Alkan mit 18 C-Atomen; aber auch C8 und

• kürzere, ebenso wie Cyclohexan- und Phenylgruppen.

• Phenylreste sind etwas polarer als Alkylgruppen.

•

• Folgerung

• Wasser kan die apolaren Alkylgruppen nicht benetzen. Es

• eluiert also am langsamsten. Daraus ist zu folgen, daß,

• je größer der Wassergehalt ist, desto länger die Reten• sionszeiten sind.

•

• Verwendete mobilen Phasen in der Reversed Phase

• Meist verwendet man Gemische mit verschiedenen mit Wasser

• mischbaren Lösungsmitteln:

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• Methanol

• Acetonitril

• Äthanol

• Isopropanol

• Dimethylformamid

• n-Propanol

• Dioxan

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• Am häufigsten wird ein Gemisch von Methanol/Wasser ver• wendet, denn fast alle Substanzen können mit 10-90%

• Methanol in Wasser eluiert werden. Das verwenden dieses

• Gemisches ist auch fananziell günstig.

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• Aber: Das Gemisch hat aber auch ein sehr hohes Visko-

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