Die funktionelle Untersuchung von Arzneistoffen auf die Aktivität kardialer Ionenkanäle

Danksagung

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit vom 01. September 2006 bis 31. März 2007 in der Abteilung Elektrophysiologie des Naturwissenschaftlichen und Medizinischen Instituts an der Universität Tübingen unter der Leitung von Prof. Dr. Elke Guenther in Reutlingen.

An erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Dr. Elke Guenther bedanken, für die Aufnahme in ihr Team und für die Übertragung des sehr interessanten Themas. Bedanken möchte ich mich besonders für ihr Vertrauen und die stetige Unterstützung, die es mir ermöglichte, einen breiten Einblick in die Elektrophysiologie zu erlangen.

Mein besonderer Dank gilt Dr. Timm Danker, der die Betreuung dieser Arbeit übernommen hat. Timm hat sich besonders beim Erlernen der Patch-Clamp-Methode intensiv mit mir befasst und stand mir jederzeit mit fachlichem Rat zur Seite. Ohne ihn wäre ein erfolgreicher Abschluss dieser Thesis nicht möglich gewesen.

Ein herzliches Dankeschön für die sehr gute Betreuung seitens der Fachhochschule geht an Herrn Prof. Dr.-Ing. Franz Bigge. Er hat sich trotz des für ihn unbekannten Fachgebiets dazu bereit erklärt, mich während meiner Thesis zu begleiten und gab mir exzellenten und zuverlässigen Rückhalt seitens der Fachhochschule.

Dr. Udo Kraushaar, der mir mit Korrekturmaßnahmen und Verbesserungsvorschlägen für die Thesis tatkräftig zur Seite stand und sich sehr bemüht hat. Vielen Dank!

Bei Doris Gasse möchte ich mich herzlich für die Vermittlung der Grundlagen in der Zellkultur bedanken. Sie hat mich hervorragend in die Kultivierung von CHO-Zellen eingelernt und hatte stets ein offenes Ohr für Fragen und Probleme.

Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Instituts, für die immer freundliche und hilfsbereite Unterstützung und die nette Arbeitsatmosphäre.

Thoralf Hermann möchte ich für jegliche Unterstützung am Computer und die Installation diverser Software danken.

Zum Schluss möchte ich mich natürlich noch besonders bei meiner Familie und meinen Freunden bedanken, die mir tatkräftig zur Seite standen und uneingeschränkt an mich geglaubt haben. Meine Eltern haben mir durch ihre Unterstützung mein Studium erst ermöglicht und während dieser Zeit viel Halt gegeben! Herzlichen Dank!

II

1  Einleitung  1

1.1  Aufbau und Funktion des Herzens  2

1.2  Das ventrikuläre Aktionspotenzial  4

1.3  Angeborenes und erworbenes langes QT-Sydrom  5

1.3.1  Das kongenitale (angeborene) QT-Syndrom  7

1.3.2  Das erworbene QT-Syndrom  7

1.4  Der hERG-Kanal (human Ether-a go-go Related Gene)  8

1.5  Pharmakologie  10

1.5.1  Drug-Development Pipeline  10

1.5.2  Sicherheitspharmakologie in Verbindung mit dem LQTS  12

1.5.3  Cisaprid  13

1.6  Effiziente Testsysteme  14

1.6.1  Konventionelle Patch-Clamp Technik  14

1.6.2  Patch-Automat  16

1.7  Ziel der Arbeit  17

2  Material und Methoden  18

2.1  Zellkultur  18

2.1.1  Zellkultivierung  18

2.1.2  Auftauen der Zellen  19

2.1.3  Passagieren der Zellen  20

2.1.4  Zellpräparation  21

2.1.5  Viability-Test  22

2.2  Elektrophysiologie  23

2.2.1  Chemikalien und Geräte  23

2.2.2  Patch-Clamp Messstand (Setup)  24

2.2.3  Durchführung der Patch-Clamp Untersuchungen  27

2.2.4  Auswertung für die Untersuchungen für den Patch-Clamp Automaten  32

V

2.2.5  Substanzapplikation  33

2.2.6  Statistische Auswertung hERG-Ströme  34

2.2.7  Statistische Auswertung der Messergebnisse des Wirkstofftests  35

3  Ergebnisse  36

3.1  Ergebnisse der Zellkultur  36

3.1.1  Zellwachstum  36

3.1.2  Viability-Test  37

3.2  Ergebnisse aus der Elektrophysiologie  38

3.2.1  Auswertung für adhärente Zellen  39

3.2.2  Auswertung accutasebehandelte Zellen  43

3.2.3  Auswertung versenebehandelte Zellen  48

3.2.4  Gegenüberstellung der Ausbeute für die drei Behandlungsmethoden  52

3.2.5  hERG-Ströme  53

3.2.6  Elektrophysiologische Eigenschaften von hERG-Strömen  58

3.2.7  Substanzapplikation (Cisaprid)  61

4  Diskussion  64

4.1  Diskussion der Ergebnisse aus der Zellkultur  64

4.2  Diskussion der Ergebnisse aus der Elektrophysiologie  65

4.2.1  Ausbeute und passive Membraneigenschaften der drei  66

  Behandlungsmethoden  66

4.2.2  hERG-Kaliumströme  68

4.2.3  Wirkstofftest  70

5  Zusammenfassung  72

VI

  Abbildungsverzeichnis  

  Abbildung 1 Aufbau des menschlichen Herzens  

  Abbildung 2 Erregungsbildungs- und -leitungssystem des Herzens  

  Abbildung 3 ventrikuläres Aktionspotenzial  

  Abbildung 4 Arrhythmien der Herzfunktion  

  Abbildung 5 Schematische Darstellung der α-Untereinheit des hERG-Kanals  

  Abbildung 6 Die Konformation eines hERG-Kanals  

  Abbildung 7 Drug-Development Pipeline.  

  Abbildung 8 Erwin Neher und Bert Sakmann  

  Abbildung 9 Patch-Clamp Konfigurationen  

  Abbildung 10 automatisiertes Patch-Clamping.  

  Abbildung 11 Anordnung über dem Präparat  

  Abbildung 12 Funktionsprinzip eines Vorverstärkers.  

  Abbildung 13 Apparaturaufbau der Patch-Clamp Technik  

  Abbildung 14 Zelle in der whole cell-Konfiguration  

  Abbildung 15 Einzelpuls  

  Abbildung 16 Pulsprotokoll zur zuverlässigen Bestimmung des Leckstroms  

  Abbildung 17 IV-Protokoll.  

  Abbildung 18 Voll-aktivierte tail-currents.  

  Abbildung 19 Beispiel für eine hERG-Stromaufzeichnung  

  Abbildung 20 Zellwachstum der CHO hERG -K1 Linie.  

  Abbildung 21 CHO hERG -Zellen nach einem Kultivierungszeitraum von 2 Monaten  

  Abbildung 22 Vitalitätsrate für versene- bzw. accutasebehandelte CHO hERG - Zellen  

  Abbildung 23 Ausbeute erfolgreich abgeleiteter, adhärenter Zellen  

  Abbildung 24 Sealwiderstände adhärenter Zellen für alle Präparationen  

  Abbildung 25 Serienwiderstände adhärenter Zellen für alle Präparationen  

  Abbildung 26 Membranwiderstände adhärenter Zellen für alle Präparationen  

  Abbildung 27 Ausbeute erfolgreich abgeleiteter, mit Accutase suspendierten Zellen  

  Abbildung 28 Sealwiderstände von mit Accutase suspendierten Zellen  

  Abbildung 29 Serienwiderstände von mit Accutase suspendierten Zellen  

  Abbildung 30 Membranwiderstände von mit Accutase suspendierten Zellen  

  Abbildung 31 Ausbeute erfolgreich abgeleiteter, mit Versene suspendierten Zellen  

  Abbildung 32 Sealwiderstände von mit Versene suspendierten Zellen  

  Abbildung 33 Serienwiderstände von mit Versene suspendierten Zellen  

  Abbildung 34 Membranwiderstände von mit Versene suspendierten Zellen  

  Abbildung 35 Ausbeute adhärent gepatchter Zellen  

VII

  Abbildung 36 Ausbeute mit Accutase dissoziierte Zellen  

  Abbildung 37 Ausbeute mit Versene dissoziierte Zellen  

  Abbildung 38 Original hERG-Ströme in CHO hERG -Zellen  

  Abbildung 39 Mittleren hERG- Stromamplituden für die drei Behandlungsmethoden  

  Abbildung 40 Rundown, up in für die drei Behandlungsmethoden  

  Abbildung 41 Elektrophysiologische Eigenschaften für hERG-Ströme  

  Abbildung 42 Voll-aktiviertes Strom-Spannungs Verhältnis bei adhärenten Zellen  

  Abbildung 43 Dosis-Wirkungskurve für adhärent abgeleitete Zellen.  

  Abbildung 44 Dosis-Wirkungskurve für accutasebehandelte Zellen  

  Abbildung 45 Dosis-Wirkungskurve für versenebehandelte Zellen.  

VIII

  Tabellenverzeichnis  

Tabelle 1  verwendete Medien und Lösungen  19

Tabelle 2  verwendete Chemikalien und Lösungen  21

Tabelle 3  Extra- und Intrazellulärlösung  23

Tabelle 4  Geräte und Materialien  23

Tabelle 5  Auswahlkriterien für die Bewertung der gepatchten Zellen  31

Tabelle 6  Verdünnungsreihe für Cisaprid  33

Tabelle 7  Messergebnisse nach einer Gesamtmesszeit von 3 Stunden  47

Tabelle 8  Mittelwerte der Inhibition  61

IX

Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius AP Aktionspotenzial AV-Knoten Atrio-Ventrikular-Knoten Ag/AgCl Silber/Silberchlorid C Coulomb Ca Calcium CHO Ovarienzellen des chinesischen Hamsters Membrankapazität C ^M DMSO Dimethylsulfoxid E Elektrodenpotenzial EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EKG Elektrokardiogramm FDA Food and Drug Administration F Faraday-Konstante h Stunde hERG Human Ether-a-go-go-Related Gene I Strom halbmaximaler Wirkungseffekt IC ⁵⁰ in vitro lat. im (Reagenz-) Glas IV Strom-Spannung J Joule K Kelvin K ⁺ Kalium LQTS Long-QT-Syndrom M Mol min Minute Mio Millionen mM Millimol ms Millisekunden mV Millivolt n Anzahl Na Natrium OPA Operationsverstärker

X

p Wahrscheinlichkeit pA Pico Ampere R Widerstand R f Rückkopplungswiderstand R s Serienwiderstand sec Sekunde SCD sudden cardiac death SIDS sudden infant death - syndrome T Temperatur TdP Torsades de pointes U Spannung Membranpotenzial U ^pip U soll Sollspannung V 50 halbmaximale Aktivierung vgl vergleiche mit WCR whole cell-Recording z Ladungszahl

XI

1 Einleitung

Das lange QT-Syndrom (LQTS) ist eine lebensgefährliche Krankheit, die bei sonst völlig herzgesunden Menschen plötzlich zum Herztod führen kann. In der westlichen Welt stellt der plötzliche Herztod eine der häufigsten Todesursachen dar. In Deutschland sterben daran jährlich über 100 000 Menschen, in den USA geht man sogar von einer Inzidenz von über 1/1000 Einwohner pro Jahr aus (Priori S.G., 2001).

Das lange QT-Syndrom kann unter anderem durch pharmakologische Nebenwirkungen auf kardiale Ionenkanäle ausgelöst werden. Besonders häufig ist dabei der hERG-Kanal (human-ether-a-go-go-Related Gene) betroffen. Dieser ist für die schnelle Repolarisation des ventrikulären Aktionspotenzials verantwortlich.

Es bestehen Auflagen von den internationalen Zulassungsbehörden, Wirkstoffe grundsätzlich auf ihren Einfluss am hERG-Kanal zu testen. Die verschärften Anforderungen der Sicherheitspharmakologie erfordern schnelle und effiziente Testsysteme (Guenther E., BioPro, 2006). Die klassische Patch-Clamp-Technik, mit der Ionenkanäle auf ihre Funktion untersucht werden können, kann diesen Ansprüchen nicht mehr standhalten. Die sog. Patch-Automaten hingegen versprechen schnelle und kostengünstige Wirkstofftests.

In dieser Arbeit sollte eine Präparationsmethode für adhärent wachsende Zellen erarbeitet werden, mit der es möglich ist, diese bei gleich bleibenden passiven Membraneigenschaften für die Verwendung am Patch-Automaten in Suspension zu bringen.

1

1.1 Aufbau und Funktion des Herzens

Das Herz (Abbildung 1) des Menschen ist ein etwa faustgroßes muskulöses Hohlorgan und versorgt den Körper durch rhythmische Kontraktion mit Blut. Drei Milliarden Mal schlägt ein Herz während seines Lebens und bewegt dabei etwa 250 Millionen Liter Blut durch den Körper (www.medizinfo.de). Das Herz ist in der Lage, schnell auf die Anforderungen des Körpers zu reagieren und passt seine Pumpleistung so an, dass eine stets ausreichende Versorgung des Körpers mit Sauerstoff und Nährstoffen gewährleistet ist. Die normale Herzfrequenz beträgt, abhängig von Alter, Geschlecht und körperlicher Tätigkeit, zwischen 60 und 140 Schlägen pro Minute.

Es besteht aus zwei Hälften, die durch eine Scheidewand (Septum) voneinander getrennt sind. Rechtes und linkes Herz sind wiederum in einen Vorhof (Atrium) und eine Kammer (Ventrikel) unterteilt.

Abbildung 1 Aufbau des menschlichen Herzens

[www.aktion-meditech.de, 20.02.2006]

2

Das Herz besitzt zwei Typen von Herzmuskelfasern: zum einen Zellen, die Impulse bilden und weiterleiten, sowie Zellen, die Impulse mit einer Verkürzung (Kontraktion) beantworten. Der Herzzyklus, mit koordinierter Anspannung und Erschlaffung der Vorhof- und Kammermuskulatur, wird durch elektrische Impulse gesteuert. Die Erregung - auch Aktionspotenzial genannt - geht vom so genannten Sinusknoten aus.

Er wird auch als Schrittmacher des Herzens bezeichnet und bestimmt die Frequenz, mit der das Herz schlägt. Ausgehend vom Sinusknoten setzt sich die Erregung über die Vorhofmuskulatur fort bis zum zentralen Bereich der Erregungsleitung, dem Atrio-Ventikular-Knoten (AV-Knoten). Dieser befindet sich im Grenzbereich zwischen Atrium und Ventrikel und stellt die einzige überleitungsfähige Verbindung zwischen den Vorhöfen und den Ventrikeln dar (Abbildung 2).

Abbildung 2 Erregungsbildungs- und -leitungssystem des Herzens

[www.kardionet.de, 20.02.2006]

Die Erregungen werden vom AV-Knoten weiter bis zum His-Bündel geleitet und schließlich über die Bündelschenkel und deren Endaufzweigung, die Purkinje-Fäden, auf den gesamten Myokard übertragen.

3

1.2 Das ventrikuläre Aktionspotenzial

Das elektrische Aktionspotenzial der Herzmuskelzelle (Abbildung 3) dient der mechanischen Kontraktion des Herzmuskels, um das Blut in das Blutkreislaufsystem zu pumpen. Ein ventrikuläres Aktionspotenzial hat beim gesunden Menschen eine Dauer von ca. 200 - 400 ms. Im Herzmuskel werden elektrische Signale generiert und geordnet weitergeleitet. Das elektrische Signal besteht aus Ionenflüssen durch die Herzmuskelzellmembran, die entweder depolarisierend oder repolarisierend wirken (Schmidt T., 1995).

Bei Herzmuskelzellen besteht aufgrund eines Ionenungleichgewichts zwischen Intra-und Extrazellulärraum eine ständige elektrische Spannung zwischen dem Zellinneren und dem Zelläußeren. Die Spannung beträgt in Ruhe ca. -70 mV (Ruhemembranpotenzial), wobei das Zellinnere gegenüber dem Zelläußeren negativ geladen ist.

Wesentlich verantwortlich für diese Spannung sind die Eigenschaften verschiedener Gruppen von Ionenkanälen in der Plasmamembran der Zelle. Sie besitzt für die verschiedenen Ionen, wie z.B. K ⁺ , Na ⁺ oder Ca ²⁺ eine unterschiedliche Permeabilität. Diese ist durch chemische, mechanische oder elektrische Reize veränderbar.

- 70 mV

Abbildung 3 ventrikuläres Aktionspotenzial

Die grünen Pfeile zeigen schematisch die Richtung in welche die Ionen in der jeweiligen Phase fließen. Zeigt der Pfeil nach oben, bedeutet dies, Ionen fließen aus der Zelle heraus, bzw. nach unten, Ionen fließen in die Zelle hinein. [www.onmeda.de, 13.02.2007]

4

Das Ruhemembranpotenzial wird vom K ⁺ -Strom dominiert, wobei ein Subtyp von Kaliumkanälen während dieser Phase geöffnet ist.

Wird das Ruhemembranpotenzial bis zu einem Schwellenwert von ca. -50 mV depolarisiert, gehen Natriumkanäle in den offenen Zustand über. Natriumionen strömen schlagartig in die Zelle ein und depolarisieren diese auf +30 mV, man spricht vom sog. Overshoot (Schmidt T., 1995).

In der darauf folgenden Phase öffnen spannungsaktivierte Ca ²⁺ -Kanäle, was zu einem Ca ²⁺ -Einstrom in die Zelle führt. Durch das gleichzeitige, aber nur sehr verlangsamte Aktivieren von Kaliumkanälen, fließen K ⁺ -Ionen aus der Zelle und es kommt es zu einem nahezu gleich bleibenden Plateau (Plateauphase). Dadurch kann genügend extrazelluläres Ca ²⁺ in die Zelle eintreten und es kommt zur optimalen Umsetzung von elektrischer Erregung in Kontraktion der Herzmuskelzellen (Sanguinetti M.C., 2006). Durch die Aktivierung unterschiedlicher Kaliumkanäle, vor allem der hERG-Kaliumkanäle, und Abnahme der Ca ²⁺ -Leitfähigkeit kommt es zu einer vollständigen Repolarisation. Die Zelle befindet sich wieder am Ruhemembranpotenzial, welches durch einwärts-gleichgerichtete K ⁺ -Ströme stabilisiert wird (Schmidt T., 1995).

1.3 Angeborenes und erworbenes langes QT-Sydrom

Das lange QT-Syndrom (LQTS; englisch: long QT-syndrome) ist eines der best untersuchten Herzfunktionsstörungen (Finlayson K., 2004). Es ist ein kardiovaskuläres Krankheitsbild, dessen Hauptmerkmale ein abnormal verlängertes QT-Intervall (Zeitspanne von Beginn der Erregungsausbreitung über die Ventrikel, Kontraktion und deren Erregungsrückbildung) und lebensbedrohliche, vor allem durch körperliche oder emotionale Belastung ausgelöste ventrikuläre Arrhythmien, im speziellen Torsades de pointes (TdP) und Kammerflimmern, sind (Abbildung 4). Es handelt sich um eine rein funktionelle Störung, die sich an wichtigen Ionenkanälen des Herzens manifestiert. Das LQTS stellt eine relativ häufige Ursache der oftmals ungeklärten Fälle von plötzlichem Herztod (SCD = sudden cardiac death) und plötzlichem Kindstod (SIDS = sudden

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infant death syndrome) dar (Sanguinetti M.C., 2005). Die erste ausführliche Beschreibung des Syndroms erfolgte 1957 und geht auf Jervell und Lange-Nielsen zurück (Jervell A., 1957). Das LQTS manifestiert sich meistens in der späten Kindheit oder im frühen Jugendalter, nur selten bereits in den ersten Lebenstagen oder im mittleren Lebensalter.

Abbildung 4 Arrhythmien der Herzfunktion

A: Verlängerung des Herzaktionspotenzials.

B: Im Elektrokardiogramm stellt sich die Aktionspotenzialverlängerung als QT-Verlängerung dar.

C: Eine Verlängerung des QT-Intervalls kann zu Torsaden führen. Torsaden können in ein Kammerflimmern degenerieren was letztendlich einen plötzlichen Herztod hervorrufen kann. [www.univie.ac.at, 15.03.2007]

Man unterscheidet angeborene und erworbene Formen des langen QT-Syndroms. Letztere sind vor allem auf die Anwendung der verschiedensten Pharmaka, aber auch auf bestimmte kardiale Primärerkrankungen zurückzuführen, wirken jedoch in letzter Konsequenz über dieselben Mechanismen wie die angeborenen Störungen.

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1.3.1 Das kongenitale (angeborene) QT-Syndrom

Man spricht von kongenitalem langem QT-Syndrom, wenn es durch Mutation in spannungsgesteuerten Na ⁺ - oder K ⁺ -Kanälen des Herzens ausgelöst wird. Es sind sieben Formen des angeborenen langen QT-Sydroms bekannt (LQT-1 - LQT-7, Finlayson K., 2004). Allen angeborenen Formen des LQTS liegen Mutationen von verschiedenen, für fundamentale kardiale Ionenkanäle kodierenden Genen zugrunde. Diese Mutationen können zwar auch spontan erfolgt sein, zum größten Teil sind sie allerdings vererbt. Bei diesen vererbten Formen werden zwei Typen unterschieden, die aber wiederum mehrere verschiedene mutationsbedingte Genotypen beinhalten. Das Romano-Ward-Syndrom wird autosomal dominant vererbt, d.h. schon ein mutiertes Allel kann Symptome auslösen. Das sog. Jervell und Lange-Nielson Syndrom hingegen wird autosomal rezessiv vererbt, d. h. beide Allele der betroffenen Gene müssen mutiert sein, um ein Symptom hervorrufen zu können. Diese Form der Krankheit ist zusätzlich zu den kardialen Symptomen durch eine Innenohrschwerhörigkeit gekennzeichnet (Tyson J. et al., 1997).

1.3.2 Das erworbene QT-Syndrom

Häufiger als das angeborene ist das erworbene QT-Syndrom. Durch die Interaktion vieler Pharmaka mit kardialen Ionenkanälen kann es zu Störungen der ventrikulären Repolarisation und zu Arrhythmien kommen. Bis heute ist noch unklar, inwieweit diese Patienten in Wirklichkeit ein verborgenes kongenitales QT-Syndrom aufweisen.

Insbesondere die medikamentöse Inhibition von Kaliumkanälen kann diese Form des Syndroms hervorrufen (Roden et al., 1996), wobei Medikamente aus strukturell sehr heterogenen Substanzklassen wie Antihistaminika, Antimalariamittel, Antibiotika, Psychopharmaka dabei eine Rolle spielen (Crumb W., 1999). Gemeinsam ist diesen Substanzen, dass sie in der Herzmuskelzelle den Kaliumstrom während der Repolarisation hemmen und so das QT-Intervall verlängern können. Das Risiko für derartige unerwünschte Arzneimittelwirkungen ist bei niedrigen Pulsfrequenzen, weiblichem Geschlecht, erniedrigtem Kaliumspiegel im Blut, Hypertrophie des

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