Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis.......................................................................................................................   2

Abk  ürzungen  4

1.  Einleitung  5

1.1  Die ATP-Synthase von Escherichia coli.  5

1.2  Interaktionen zwischen der Untereinheit b und den anderen Statorkomponenten.  8

1.3  Aufgabenstellung dieser Arbeit.  10

2.  Material und Methoden  11

2.1  Stämme, Plasmide, Primer und Antikörper.  11

2.2  Zellanzucht  14

2.2.1  Medien.  14

2.2.2  Komplementationstest.  14

2.2.3  Zellanzucht  15

2.3  Molekularbiologische Methoden.  15

2.3.1  2-Stufen-PCR  15

2.3.2  Restriktion der Plasmid-DNA  16

2.3.3  Agarose-Gelelektrophorese mit Ethidiumbromid-Färbung  16

2.3.4  Gel-Extraktion.  17

2.3.5  Ligation der DNA-Fragmente  17

2.3.6  Transformation von DH5α und DK8  17

2.3.7  Reinigung der Plasmid-DNA  17

2.3.8  Konstruktion der Plasmide  18

2.3.8.1  Herstellung der a-b-Konstrukte.  18

2.3.8.2  Herstellung der a-b-α-Konstrukte  18

2.3.8.3  Herstellung der b-β-Konstrukte.  18

2.4  Präparative Methoden  19

2.4.1  Präparation invertierter Membranvesikel.  19

2.4.2  Quervernetzung mit Kupfer-Phenanthrolin (CuP) an invertierten  

Membranvesikeln   20

2.5  Analytische Methoden.  20

2.5.1  BCA-Proteinbestimmung  20

2.5.2  Messung der ATPase-Aktivität  21

2.5.3  Messung der ATP-getriebenen Protonentranslokation mittels ACMA-  

Fluoreszenz   22

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2.5.4  SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)  23

2.5.5  Immunoblotanalyse  24

3  Ergebnisse  24

3.1  Interaktion zwischen den Untereinheiten b und a  25

3.1.1  Funktionelle Charakterisierung  25

3.1.2  Quervernetzung zwischen den Untereinheiten b und a.  27

3.2  Interaktion zwischen den Untereinheiten b und β.  30

3.2.1  Funktionelle Charakterisierung  30

3.2.2  Quervernetzung zwischen den Untereinheiten b und β.  32

3.3  Interaktion zwischen den Untereinheiten a, b und α.  33

3.3.1  Funktionelle Charakterisierung  33

3.3.2  Quervernetzung zwischen den Untereinheiten a, b und α.  34

4  Diskussion  36

4.1  Ausblick  37

5  Literatur.  39

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Abkürzungen

ACMA 9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridin

Amp Ampicillin

APS Ammoniumpersulfat

BCA Bicinchoninsäure

Carb Carbenicillin

CuP Kupfer-1, 10-Phenanthrolin

DCCD N, N’-Dicyclohexylcarbodiimid

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure

Glyc Glycerin

LB Luria Bertani

MM Minimalmedium

NEM N-Ethylmaleimid

OD Optische Dichte

PAP Probenauftragungspuffer

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

TEMED N, N, N’, N’-Tetrachloro-2-trifluoromethylbenzimidazol

WT Wildtyp

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1. Einleitung

1.1 Die ATP-Synthase von Escherichia coli

Das Molekül Adenosintriphosphat (ATP) kommt in allen lebenden Organismen vor. ATP ist der universelle Überträger chemischer Energie in der Zelle, mit dessen Hilfe endergonische Prozesse angetrieben werden, wie Synthese von organischen Molekülen, aktiver Stofftransport über Biomembranen in die Zellen oder hinaus, sowie Bewegungen wie zum Beispiel bei der Muskelkontraktion. Deshalb wird ATP auch als die Energiewährung der Zelle bezeichnet (Greie et al., 2001). Die drei Phosphatgruppen des Adenosintriphosphates sind durch zwei energiereiche Phosphoanhydrid-Bindungen miteinander verbunden. Werden diese Bindungen durch Enzyme hydrolytisch gespalten, entsteht das Adenosindiphosphat (ADP) bzw. das Adenosinmonophosphat (AMP) und jeweils anorganisches Phosphat (P i ). Jede Spaltung liefert eine Hydrolyseenergie von ∆g’ 0 = -30,5 kJ/mol. Bei der Phosphorylierung kommt es jedoch zu einer Übertragung einer Phosphatgruppe auf ein anderes Molekül bedingt durch das hohe Gruppenübertragungspotential von ATP für Phosphatgruppen. Häufig entsteht auch ein Energiegewinn durch Hydrolyse bei der Freisetzung der Komponente. Außerdem fungiert ATP als Coenzym bei der Aktivierung von Metaboliten wie z.B. Aminosäuren. Aufgrund der zentralen Funktion des ATPs, ist dessen Synthese die in der Natur am häufigsten vorkommende Reaktion (Nelson & Cox, 2001).

Die Regeneration von ATP aus AMP bzw. ADP wird durch zwei verschiedene Prozesse in Organismen realisiert, die als Substratkettenphosphorylierung und Elektronentransport-phosphorylierung bekannt sind. Bei der Substratkettenphosphorylierung wird ATP durch direkte Übertragung einer Phosphatgruppe auf ADP von einem Intermediärsubstrat im Katabolismus gebildet. Im zweiten Mechanismus, der oxidativen Phosphorylierung, koppelt die ATP-Synthase die ATP-Bildung mit dem energetisch begünstigten Transport von Protonen (oder anderen Ionen) entlang eines Protonengefälles über eine Membran, um so die Energie für die Synthese von ATP aus ADP und P i aufzubringen Dieser elektrochemische ^{+ +} oder Δµ Na Ionen-Gradient (Δµ H ) wird durch Elektronentransportprozesse während der

Zellatmung oder der Photosynthese über der Membran generiert (Greie et al., 2001). Der membrangebundene Enzymkomplex wird als F 1 F 0 -ATP-Synthase bezeichnet und kommt in hoch konservierter Form in der Plasmamembran von Prokaryoten, in der inneren Mitochondrienmembran von Eukaryoten und in der Thylakoid-Membran der Chloroplasten von Pflanzenzellen vor. Obwohl bei verschiedenen Organismen die Anzahl der Proteinuntereinheiten zwischen 8-16 variiert, weisen alle ATP-Synthasen einen transmembranen F 0 -Teil und einen cytoplasmatischen F 1 -Teil auf. Die F 1 F 0 -ATP-Synthase tritt speziell bei Bakterien abhängig vom Verhältnis der Substrate und Produkte entweder als ATP-verbrauchende Protonenpumpe oder als Protonen-getriebene ATP-Synthase auf. Unter anaeroben Bedingungen besteht bei E. coli die Hauptaufgabe des Enzyms darin, ATP zu hydrolysieren um die protonenmotorische Kraft zu erzeugen (Dimroth et al., 2006).

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Alle F-ATPasen weisen eine hohe Homologie Struktur und Funktionsweise auf. Die F 1 F 0 -ATP-Synthase von E. coli wird aufgrund Zusammensetzung als Modellenzym genommen 2001/Abb. 1). verschiedenen Untereinheiten der F 1 F 0 -ATP-Synthase von E. coli werden alle durch das atp-Operon kodiert und liegen auf dem Chromosom. Zusätzlich gehört zum atp-Operon (Tab. 1) das atpI-Gen, dessen Funktion nach wie vor unbekannt ist.

Tab. 1: Das atp-Operon und die Untereinheiten der F 1 F 0 -ATP-Synthase von E. coli

Der F 1 -Teil, der als ATPase fungiert, besteht aus fünf verschiedenen Untereinheiten mit der Stöchiometrie α 3 β 3 γδε. Der Aufbau der Untereinheiten α und β ist ähnlich. Beide besitzen eine N-terminale β-Faltblatt-Domäne, eine in der Mitte gelegene Nucleotid-Binde-Domäne und eine C-terminale α-helikale Region, die zahlreiche polare Reste beinhaltet und wichtig für die regulatorische Funktion ist. Die Untereinheiten α und β sind alternierend in einem hexameren Ring um die zentral gelegene γ-Untereinheit angeordnet. Die γ-Untereinheit ragt mit ihren asymmetrischen α-Helices in das Hexamer hinein und ist nur in der N-terminalen „crown region“ des Hexamers nicht vorhanden. Vom Hexamer erstreckt sich die γ-Untereinheit zum F 0 -Teil und bildet zusammen mit ε einen 4,5 nm langen Stiel, den „central stalk“, der F 1 mit F 0 verbindet. Die Untereinheit ε ist ein 15 kDa großes, lösliches Polypeptid. Es besteht aus einer C-terminalen Helix-Loop-Helix-Haarnadel-Domäne und einer N-terminalen β- Sandwich-Domäne(Dunn et al., 2004). Die Untereinheit δ befindet sich außen im oberen Bereich des α 3 β 3 -Hexamers. Die N-terminalen 134 Reste der 176 Reste großen Untereinheit δ sind hauptsächlich α-helikal, sonst ist noch wenig über δ bekannt (Greie et al., 2001). Der F 0 -Teil besitzt die protonentranslozierende Funktion und setzt sich aus den Untereinheiten a, b 2 und einem oligomeren c 10 -Ring zusammen (Stöchiometrie ab 2 c 10 , Dimroth et al., 2006). Die monomere Untereinheit c ist eine helikale Haarnadel mit zwei transmembranen α-Helices, die durch einen kurzen Bereich hydrophiler Aminosäuren verbunden sind. Beide Endigungen des Proteins sind zur periplasmatischen Seite der Membran orientiert, während der hydrophile Loop zum Cytoplasma zeigt. Die Untereinheit c ist über γ und ε mit dem F 1 -Teil verbunden. Das N-terminale Viertel der Untereinheit a besteht aus fünf transmembranen Helices. Der N-Terminus liegt im Periplasma und die C-

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terminalen Dreiviertel des Proteins sind zum Cytoplasma orientiert. Es wurden zwei cytoplasmatische Loops und zwei periplasmatische Domänen gefunden. Insgesamt gibt es in diesem Bereich vier transmembrane Helices (Greie et al., 2001). Die Untereinheit b besteht aus 156 Aminosäuren und liegt als Homodimer vor, welches sich von der periplasmatischen Seite der Membran bis zum F 1 -Bereich erstreckt und größtenteils α-helikal ist. Die Untereinheit b kann in vier Domänen eingeteilt werden, der unpolaren N-terminalen transmembranen Domäne (Reste 1-24), einer „tether“-Domäne (Reste 25-52), einer Dimerisierungsdomäne (Reste 53-122) und einer δ-Bindedomäne (Reste 123-156). Die Dimerisierung ist reversibel und die Bindungen sind nur schwach; sie ist aber für die Assemblierung und Funktionalität des Enzyms unentbehrlich (Dunn et al., 2004). Die Untereinheiten a und c sind an der Translokation von Protonen über die Membran beteiligt. Hierfür wird bei E. coli derzeit das „two-channel“-Modell bevorzugt. Dieses Modell besagt, dass in a zwei Halbkanäle, der „Inlet-Channel“ und der „Outlet-Channel“ seitlich zueinander verschoben liegen (Abb. 2). Sie führen jeweils von der Mitte der Membran zum Periplasma bzw. zum Cytoplasma. Das Proton tritt auf der Seite mit dem geringeren pH-Wert (Periplasma) über den „Inlet-Channel“ ein und trifft in der Mitte der Membran auf den Aspartatrest 61 eines c-Monomers (cD61). Das Proton bindet und vollführt eine 360°-Rotation innerhalb des c-Oligomers. Das Aspartat 61 wird dann durch den Argininrest 210 der a-Untereinheit (aR210), welches an der ac-Grenzfläche liegt, wieder deprotoniert. Das Proton tritt auf der Seite mit dem höheren pH-Wert (Cytoplasma) über den „Outlet-Channel“ aus. Außerdem kann an das Aspartat 61 DCCD (N, N’-Dicyclohexylcarbodiimid) binden; die

durch die asymmetrische Bewegung der Untereinheit γ im α 3 β 3 -Hexamer. Die insgesamt drei Konformationen von β werden als „open“ (O), „tight“ (T) und „loose“ (L) bezeichnet (Abb. 3). Sie weisen unterschiedliche Bindungsaffinitäten für ATP, ADP und P i auf. Während eine Einheit geöffnet ist und ADP und P i binden kann (o-Zustand, für „open“), ist die benachbarte Einheit in der T-Form (für „tight“). In diesem Zustand findet die Synthese von ATP aus ADP und P i statt. In der L-Form (L für „loose“) liegt das Produkt ATP vor und wird energieabhängig entlassen. Da sich die Untereinheit γ in 120°-Schritten bewegt, durchläuft jede β-Untereinheit pro 360°-Drehung alle drei Konformationen und im F 1 -Komplex werden insgesamt drei Moleküle ATP generiert. Diese Vorgänge wurden als „binding-change“-Mechanismus bekannt (Greie et al., 2001) und Paul Boyer erhielt hierfür den Nobelpreis.

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F 0 -Teil wird als Kopplung bezeichnet. Der c-Ring bei E. coli besteht aus 10 Monomeren und befördert daher zehn Protonen über die Membran bei einer kompletten Drehung. Demgegenüber steht eine Generierung von 3 Molekülen ATP pro kompletter Drehung des F 1 -Teils; dies entspricht einem Verhältnis ATP zu H ⁺ von 3:10. Da die Anzahl der Monomere im c-Ring bei verschiedenen Organismen variieren kann (10-15 Monomere), ändert sich das ATP/H ⁺ -Verhältnis entsprechend (Dimroth et al., 2006). Für die Synchronisation der Kopplung gibt es zwei verschiedene Modelle, den „stepping-Mechanismus“ und den „elasticstrain-Mechanismus“. Beim „stepping-Mechanismus“ ist jede Drehbewegung der Untereinheit c an einen Teilschritt der Rotation von γε und somit an eine Teilreaktion bei der ATP-Synthese geknüpft. Bei einem Verhältnis ATP zu H ⁺ von 3:10 gegenüber 3:15 muss es hierbei bislang schwer zu verstehende Änderungen im Mechanismus geben. Beim „elasticstrain-Mechanismus“ wird die Energie jeder Drehbewegung des c-Rings vermutlich im Stator (ab 2 α 3 β 3 δ) gespeichert, bis sie ausreicht, um die Untereinheiten γε um 120° zu drehen und somit ein ATP-Molekül zu generieren. Für die Speicherung der Energie im Stator bieten sich die Untereinheiten b 2 und γ an, die sich verdrillen. Hier ist daher eine gewisse Flexibilität im Molekül gegeben, während die Interaktion des b-Dimers mit den anderen Untereinheiten des Stators im F 1 - und F 0 -Bereich für eine ebenso notwendige Stabilität des Moleküls sorgt. Allerdings reichen die bislang in der Vergangenheit charakterisierten Interaktionen der Untereinheit b mit den anderen Untereinheiten des Stators nicht aus, um die Stabilität innerhalb des Stators zu gewährleisten bzw. um das „elastic-strain-Modell“ zu verifizieren.

1.2 Interaktionen zwischen der Untereinheit b und den anderen

Statorkomponenten

Im Folgenden wird auf die bislang charakterisierten Interaktionen von b mit den übrigen Statorkomponenten (aα 3 β 3 δ) näher eingegangen.

Im transmembranen F 0 -Bereich zeigten Kumamoto et al. (1986), dass Suppressormutanten einen durch die Mutation bG9D bedingten Funktionsverlust der ATPase teilweise wieder aufheben. Die Suppressormutationen liegen in Position 240 der a-Untereinheit (aP240A, aP240L). Die Ergebnisse lassen vermuten, dass diese Positionen in räumlicher Nähe zueinander liegen könnten. Entsprechende Cysteinmutanten wurden von Brandt im Zuge seiner Bachelorarbeit (2007) konstruiert. Die Mutanten mit den Austauschen bG9C und aP240C bildeten hierbei einen pH-abhängigen Crosslink, der aber schwächer ausfiel als z.B. der charakterisierte Crosslink von Fillingame et al. (2000) von bN2C mit aL228C (in derselben Arbeit wurde des weiteren ein Crosslink von bN2C mit der Position 227 in a erhalten); deshalb wurden weitere Cysteinmutanten um die sich in der fünften transmembranen Helix befindende Position aP240 konstruiert. Von ihnen bildeten aL237C,

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