Kurzzusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Verfahren zur Rauschminderung, zur Reflexionsebenenselektion und zur numerischen Autofokussierung in der digitalholographischen Mikroskopie.

Zunächst wurden die Eigenschaften der eingesetzten kurzkohärenten Superlumineszenzdioden charakterisiert und optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Rekonstruktion der hiermit aufgenommenen digitalen Hologramme mit Methoden der räumlich phasenschiebenden Interferometrie möglich ist. Die Bildweite der rekonstruierten Wellenfelder kann anschließend mittels der faltungsbasierten Propagation variiert werden. Die Untersuchungen ergaben, dass das Phasenrauschen bei Einsatz kurzkohärenter Lichtquellen im Vergleich zur Laserlichtquelle signifikant vermindert wird. Es wurde gezeigt, dass die Anwendung von angepassten Methoden der kurzkohärenten Interferometrie in der digitalholographischen Mikroskopie eine selektive Erfassung und Rekonstruktion definierter Reflexionsebenen ermöglicht. Hierbei ist die axiale Auflösung durch die Kohärenzlänge des verwendeten Lichts bestimmt; eine spektrale Bandpassfilterung des Lichts bewirkt eine definierte Erhöhung der Kohärenzlänge, wodurch die Empfindlichkeit gegenüber Fluktuationen in der Weglängendifferenz, z. B. durch mechanische Instabilitäten, vermindert wird.

Da die interferometrisch selektierte Objektebene im Allgemeinen nicht scharf abgebildet wird, wurde durch die Kombination von raumfrequenz- oder gradientenbasierten Bildschärfequantifizierungsverfahren mit der numerischen Propagation ein flexibler Autofokus für die digitalholographische Mikroskopie entwickelt. Hierdurch wird eine nachträgliche automatisierte Fokusstabilisierung sowie eine simultane scharfe Abbildung von Objekten in unterschiedlichen Gegenstandsweiten ermöglicht. Diese erlaubt in Kombination mit kurzkohärent-interferometrischen Verfahren eine reflexionsebenenselektive digitalholographische Auflichtmikroskopie mit automatisierter Optimierung der Abbildung. Hiermit konnte erstmals die durch eine lebende Zelle verursachte Phasenverzögerung in Auflicht bestimmt werden. Des Weiteren ermöglichen die bei der Autofokussierung von Messreihen erhaltenen Daten bei gleichzeitiger lateraler Maximalphasenbestimmung die quantitative dreidimensionalen Analyse von Objektbewegungen. Dieses Messprinzip ist z. B. zur Analyse von Sedimentations- und Migrationsprozessen von Zellen einsetzbar.

i

Abstract

The aim of this work was to develop methods for noise reduction, the evaluation of defined reflective object planes and numerical autofocusing in digital holographic microscopy.

At first, the properties of the applied short-coherent superluminescent diodes were characterized and optimized. It was demonstrated that digital holograms that were recorded with these light sources can be reconstructed with methods of spatial phase-shifting interferometry. Convolution-based propagation enables the variation of the image distance of the reconstructed object wave. The experiments showed that using short-coherent light sources instead of a laser significantly reduces the resulting phase noise. In addition, the application of adapted methods of short-coherent interferometry in digital holographic microscopy enables the selective acquisition and reconstruction of reflective object planes. Here, the axial resolution is determined by the coherence length of the light; spectral band-pass filtering results in a defined increase in the coherence length, thus the sensitivity to fluctuations in the optical path length difference, by mechanical instabilities for example, can be reduced.

Since the interferometrically-selected object plane is generally not sharply focused, a versatile autofocus technique for digital holographic microscopy was developed by a combination of numerical propagation with spatial-frequency- or gradient-based methods for the quantification of the image sharpness. Thus, subsequent automated focus-stabilization and the simultaneous sharp imaging of objects in different distances were proven to be possible. In short-coherent digital holographic microscopy this makes available the reconstruction of defined reflective object planes with automated optimization of the imaging conditions. Hereby, for the first time, the phase delay of a living cell could be determined in reflected-light microscopy. Moreover, the data obtained from numerical autofocusing and from tracking the maximal phase delay enables a quantitative three-dimensional analysis of object dynamics. This method can be applied in the analysis of sedimentation and migration processes of cells, for example.

iii

Inhaltsverzeichnis

  Kurzzusammenfassung  i

  Abstract  iii

1  Einleitung und Motivation  1

2  Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen  5

2.1  Kohärenz  5

2.1.1  Zeitliche Kohärenz  5

2.1.2  Räumliche Kohärenz  6

2.1.3  Kohärenzeingeschaften polychromatischer Lichtquellen  7

2.2  Digitale Holographie  9

2.2.1  Grundlagen der Holographie  9

2.2.2  Aufnahme digitaler Hologramme  10

2.2.3  Skalare Beugungstheorie  12

2.2.3.1  Fresnel-Kirchhoffsches Beugungsintegral  12

2.2.3.2  Fresnel-Approximation  13

2.2.4  Phasenschiebende Verfahren zur Objektwellenrekonstruktion  15

2.2.5  Separation der komplexen Objektwelle  19

2.2.6  Kompensation von Phasenabberationen  20

2.2.7  Interpretation der rekonstruierten Phasenverteilung  20

2.2.8  Laterales Auflösungsvermögen und Schärfentiefe  21

2.2.9  Digitale Holographie mit kurzkohärenten Lichtquellen  24

2.2.10  Reflexionsebenenselektive digitale Holographie mit kurzkohä-  

  renten Lichtquellen  25

2.3  Autofokusverfahren für die digitale Holographie  26

2.3.1  (De-)Fokussierte kohärente Abbildung  27

2.3.2  Verfahren zur Quantifizierung der Bildschärfe  30

2.3.2.1  Gewichtete Spektralanalyse (SPE)C  31

2.3.2.2  Statistische Varianzanalyse (VAR)  32

2.3.2.3  Kumulierte Gradientenbildung (GRA)  33

2.3.2.4  Kumulierte Laplace-Filterung (LAP)  35

2.3.3  Digitalholographische Autofokussierung  36

2.3.4  Autofokussierung von Amplituden- und Phasenobjekten  36

v

Inhaltsverzeichnis

3  Experimentelle Methoden  39

3.1  Kurzkohärenz  39

3.1.1  Lichtquellen  39

3.1.2  Bestimmung der Emissionsspektren  40

3.1.3  Aufnahme von Hologrammstapeln bei Variation der optischen  

  Weglängendifferenz  41

3.1.4  Bestimmung der Kohärenzfunktion  41

3.1.4.1  Visibilitätsbestimmung  43

3.1.4.2  Modulationsbestimmung mit der Fourier-Transfor-  

  mationsmethode  43

3.1.4.3  Zweistufige Modulationsbestimmung mit der Fourier-  

  Transformationsmethode  45

3.1.5  Detektion von Reflexionsebenen  45

3.1.6  Zuordnung der Kohärenzmaxima  47

3.2  Digitale Holographie  49

3.2.1  Rekonstruktion der komplexen Objektwelle  53

3.2.2  Weiterverarbeitung der Phasenverteilung  55

3.2.2.1  Filterung  55

3.2.2.2  Entfaltung von Phasensprüngen  55

3.2.3  Dreidimensionale Rekonstruktion reflektiver Objektstrukturen  56

3.3  Digitalholographischer Autofokus  57

3.3.1  Propagationsintervall und Intervallschachtelungsstrategie  58

3.3.2  Autofokus-Kriterien  59

3.3.3  Hann-Filterung  60

3.3.4  Digitalholographische Multifokusuntersuchungen  61

3.4  Reflexionsebenenselektive digitalholographische Mikroskopie in Auf-  

  licht  61

3.5  Quantitative Positionsverfolgung von Phasenobjekten  62

3.5.1  Axiale Objektverfolgung  64

3.5.2  Laterale Objektverfolgung  65

3.5.3  3D-Verfolgung  66

4  Ergebnisse und Diskussion  67

4.1  Charakterisierung der eingesetzten Lichtquellen  67

4.1.1  Emissionsspektren  67

4.1.2  Vergleich der Methoden zur Bestimmung der Kohärenzfunktion  72

4.1.2.1  Visibilitätsbestimmung  72

4.1.2.2  Modulationsbestimmung mit der Fourier-Transfor-  

  mationsmethode  73

4.1.2.3  Zweistufige Modulationsbestimmung mit der Fourier-  

  Transformationsmethode  74

vi

Inhaltsverzeichnis

4.1.3  Interferometrische Charakterisierung der Kohärenzeigen-  

  schaften  75

4.2  Digitale Holographie mit kurzkohärenten Lichtquellen  78

4.2.1  Räumliches Phasenschieben  78

4.2.2  Auflösungsquantifizierung  80

4.2.2.1  Laterale Auflösung  80

4.2.2.2  Phasenauflösung  82

4.2.2.3  Abhängigkeit der Phasenverteilung von der verwen-  

  deten Wellenlänge  83

4.2.3  Numerische Propagation rekonstruierter Wellenfelder  85

4.2.4  Einfluss des Weglängenunterschiedes auf die digitalhologra-  

  phische Rekonstruktion  86

4.2.5  Reflexionsebenenselektive digitale Holographie  88

4.2.5.1  Digitalholographische Detektion und definierte Re-  

  konstruktion von Objektebenen  88

4.2.5.2  Dreidimensionale Rekonstruktion reflektiver Objekt-  

  strukturen  89

4.3  Digitalholographischer Autofokus  92

4.3.1  Parameteroptimierung der kantendetektionsbasierenden Ver-  

  fahren zur Bildschärfequantifizierung  92

4.3.1.1  Kumulierte Gradientenbildung  92

4.3.1.2  Kumulierte Laplacefilterung  95

4.3.2  Hann-Filterung  95

4.3.2.1  Technische Amplitudenobjekte in Auflicht  97

4.3.2.2  Zellbiologische Phasenobjekte in Durchlicht  97

4.3.3  Vergleich der Autofokus-Algorithmen  99

4.3.3.1  Bildschärfequantifizierung bei Amplitudenobjekten  99

4.3.3.2  Bildschärfequantifizierung bei Phasenobjekten  102

4.3.3.3  Recheneffizienz  104

4.3.3.4  Beurteilung der Autofokus-Algorithmen  105

4.3.4  Bestimmung des Zusammenhanges zwischen Gegenstands-  

  weite und Autofokusdistanz  107

4.4  Anwendungen  109

4.4.1  Bestimmung der Phasenverzögerung von durchlaufenen Pro-  

  ben in Auflicht durch reflexionsebenenselektive digitale Holo-  

  graphie  109

4.4.2  Automatisierte Refokussierung bei digitalholographischen  

  Langzeituntersuchungen  111

4.4.3  Digitalholographische Multifokusrekonstruktion  113

4.4.4  Digitalholographische 3D-Objektverfolgung  115

4.4.4.1  3D-Objektverfolgung an Einzelzellen  115

4.4.4.2  Multifokale 3D-Verfolgung mehrerer Zellen  118

vii

Inhaltsverzeichnis

4.4.4.3  Multifokale 3D-Verfolgung bei veränderlicher Objekt-  

  form  120

5  Zusammenfassung und Ausblick  125

  Literaturverzeichnis  129

A  Anhang  141

  A.1 Technische Daten  141

  A.1.1 Kamerasensoren  141

  A.1.2 Bandpassfilter  141

  A.1.3 USAF 1951 Auflösungstesttafel  142

  A.2 Softwaremodule  142

  A.2.1 Bestimmung von Kohärenzfunktionen  142

  A.2.1.1 gIselControl  142

  A.2.1.2 KontrastGUI  143

  A.2.2 Digitalholographische Autofokussierung  144

  A.2.2.1 dcholo  144

  A.2.3 Digitalholographische Verfolgung von Objektpositionen  146

  A.2.3.1 PhaseIllustrator  146

  A.2.3.2 SortGUI  146

  A.2.3.3 Trackpoint  148

  Danksagung  149

  Veröentlichungen  153

  Abkürzungs- und Variablenverzeichnis  161

viii

1 Einleitung und Motivation

Die optische Mikroskopie bildet auch 400 Jahre nach ihren Anfängen einen tech- nologischen Eckpfeiler bei den Arbeiten zum Verständnis zellbiologischer Prozesse. Insbesondere für die Analyse dynamischer, zellulärer Lebensvorgänge (z. B. Migra- tionsvorgänge, Beeinflussung durch Wirkstoffe) sind hier Langzeituntersuchungen

von Interesse, bei denen räumlich und zeitlich hochaufgelöst die Zellmorphologie quantitativ erfasst wird.

Mit etablierten Mikroskopieverfahren wie dem Zernike-Phasenkontrast [1] oder dem differentiellen Interferenzkontrast (DIC, engl. „Differential Interference Contrast“) nach Nomarski [2, 3] kann die Morphologie lediglich qualitativ bestimmt werden. Da Fluoreszenztechniken im Allgemeinen auf der Zugabe eines zumeist toxischen Markerfarbstoffes basieren, wird hierdurch die Übertragbarkeit des zellulären Verhaltens auf ungefärbte Proben eingeschränkt [4]. Konfokalmikroskopische Verfahren wie die Multiphotonenmikroskopie [5] und die STED-Mikroskopie [6] erfordern sowohl die Verwendung von Fluoreszenzmarkern als auch eine Abrasterung des Objektbereiches, wodurch nur eine geringe zeitliche Auflösung ermöglicht wird. Ebenso benötigen (quasi-) taktile Rastersondenverfahren wie die Rasterkraftmikroskopie [7] und die optische Rasternahfeldmikroskopie [8] für die Erfassung eines Objektzustandes mehrere Sekunden. Aus diesem Grund sind diese Verfahren für die Untersuchung dynamischer Prozesse nicht einsetzbar. Hier kann die digitale Holographie neue Anwendungsfelder eröffnen.

Das holographische Prinzip nach Dénes Gábor basiert auf der interferometrischen Speicherung einer komplexen Objektwelle durch Überlagerung mit einer Referenzwelle [9]. Anschließend wird in einem separaten Auswertungsschritt die Objektwelle durch Beleuchtung des Hologramms mit der Referenzwelle rekonstruiert. Die hierbei auftretende Überstrahlung durch ein Zwillingsbild und die ungebeugte Referenzwelle wird mittels der von Leith und Upatnieks eingeführten „Off-Axis“-Geometrie („Nullte Beugungsordnung“) vermieden [10-12]. Für die analoge Aufzeichnung der Hologramme können photosensitive Materialien wie z. B. Fotoemulsionen, photorefraktive Kristalle und Photopolymere eingesetzt werden [13-16]. In der digitalen Holographie werden stattdessen digitale Rasterbildsensoren, wie z. B. CCD-Kameras, eingesetzt [17]. Anschließend wird die komplexe Objektwelle numerisch rekonstruiert und ggf. in die Bildebene propagiert [18-21]. Hierbei ermöglicht die

1

1 Einleitung und Motivation

digitale Datenverarbeitung die quantitative Bestimmung der Phasenverteilung mit interferometrischer Genauigkeit [22-24].

In Kombination mit mikroskopischen Abbildungsoptiken ermöglicht die digitale Holographie eine quantitative Phasenkontrastmikroskopie mit Anwendungsmöglichkeiten in der zerstörungsfreien Materialprüfung und in der markerfreien Lebendzellanalyse [22-28]. Applikationsbespiele hierzu sind die Bestimmung von Zelldicken [29] sowie des integralen zellulären Brechungsindexes [28, 30-32]. Hierbei wird eine zeitliche Auflösung im Bereich < 50 ms erzielt. Somit erscheint dieses Verfahren einsetzbar zur Langzeitanalyse dynamischer zellulärer Lebensvorgänge.

Ein wichtiger Einflussparameter in der Holographie ist die Kohärenz des verwendeten Lichts. Sie limitiert zum einen den rekonstruierbaren Objektraum, zum anderen beeinträchtigt sie durch unerwünschte Interferenzerscheinungen wie die Lasergranulation (Speckle) das erreichbare Signal-Rausch-Verhältnis. In der digitalen Holographie ermöglicht kurzkohärentes Licht die interferometrische Detektion und selektive Rekonstruktion von reflektiven Objektebenen [33-37]. Des Weiteren wurde gezeigt, dass durch den Einsatz kurzkohärenter Lichtquellen das Phasenrauschens vermindert wird, da sowohl Specklebildung als auch parasitäre Interferenzen unterdrückt werden [38, 39].

Im Rahmen dieser Arbeit wird die Anwendung von Methoden der kurzkohärenten Interferometrie zur ebenenselektiven und rauschminimierten Objektwellenrekonstruktion in der digitalholographischen Mikroskopie untersucht. Hierzu werden Lichtquellen mit unterschiedlichen Emissionsbreiten bezüglich ihrer spektralen und kohärenten Eigenschaften charakterisiert und auf ihre Eignung für eine räumlich phasenschiebende Objektwellenrekonstruktion überprüft. Hierbei wird insbesondere das Phasenrauschen bei Einsatz der verschiedenen Lichtquellen verglichen. Anschließend wird die Weglängendifferenzabhängigkeit der digitalhologra-

phischen Rekonstruktion bestimmt, welche die Grundlage für eine ebenenselektive Erfassung der reflektierten Lichtwellen bildet.

Die interferometrisch selektierte Reflexionsebene wird im Allgemeinen nicht scharf abgebildet. Da durch die numerische Propagation der rekonstruierten Objektwelle die Bildweite variiert werden kann, ist aber eine nachträgliche Fokussierung der Abbildung möglich. Liebling und Unser haben gezeigt, dass in der digitalen Fresnel-Holographie durch die Anwendung von Fresnelet-basierten Verfahren zur Quantifizierung der Bildschärfe die optimale Bildweite bestimmt werden kann [40]. Um die numerische Autofokussierung in der hier genutzten Bildebenenholographie umzusetzten, werden vier Bildschärfequantifizierungsverfahren in mikroskopischen Untersuchungen an Amplituden- und Phasenobjekten in Auf- und Durch-

licht optimiert und verglichen. Es wird überprüft, ob durch Kombination der reflexi- onsebenenselektiven Objektwellenrekonstruktion mit der numerischen Autofokus-

2

sierung die automatisiert-optimierte Abbildung der interferometrisch selektierten Objektebene ermöglicht wird. Des Weiteren wird durch die digitalholographische Autofokussierung die Grundlage für mikroskopische Untersuchungen dynamischer Prozesse geschaffen, für die aufgrund von Objektbewegungen sowie mechanischer Instabilitäten die permanente Kontrolle und Nachführung der Fokussierung eine wesentliche Voraussetzung darstellt [41, 42]. Ferner wird untersucht, ob Änderungen der axialen Objektposition aus den quantitativen Autofokuspositionen ermittelt werden können. Bei gleichzeitiger lateraler Positionsbestimmung wird somit die quantitative dreidimensionale Dynamikanalyse in der Mikroskopie in Aussicht gestellt.

Die Eignung der hier entwickelten und vorgestellten digitalholographischen Verfahren zur kurzkohärent-interferometrischen Ebenenselektion sowie zur numerischen Autofokussierung wird anhand von mikroskopischen Untersuchungen von dynamischen zellbiologischen Prozessen analysiert. Hierbei wird insbesondere die dreidimensionale Positionsbestimmung bei Sedimentations- und Migrationsvorgängen an lebenden Zellen überprüft.

3

2 Theoretische Grundlagen und

Vorbetrachtungen

Eine wesentliche Voraussetzung zur Anwendung von interferometrischen Messverfahren ist die Interferenzfähigkeit der eingesetzten Lichtquellen. Diese als Kohärenz bezeichnete Eigenschaft wird zunächst diskutiert. Die Anwendung kohärenter Lichtquellen in der digitalen Holographie ermöglicht die Rekonstruktion und Propagation komplexer Wellenfelder. Die hierzu erforderlichen theoretischen Grundlagen werden anschließend vorgestellt, wobei insbesondere auf die Nutzung von Lichtquellen mit kurzer Kohärenzlänge eingegangen wird. Die Kombination der numerischen Propagation von rekonstruierten Lichtwellen mit Methoden zur Bildschärfequantifizierung stellt eine numerische Autofokussierung für den Einsatz in der digitalholographischen Mikroskopie in Aussicht. Die hierzu im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Verfahren werden abschließend aus der kohärenten Abbildungstheorie hergeleitet.

2.1 Kohärenz

Im Allgemeinen wird unter Kohärenz einer elektromagnetischen Welle die Fähigkeit verstanden, bei Überlagerung Interferenzeffekte auszubilden. Durch die Beschreibung der raum-zeitlichen Korrelation ist es möglich, die Interferenzfähigkeit einer Lichtquelle zu beurteilen. Die beiden Aspekte der zeitlichen und räumlichen Kohärenz werden in den beiden folgenden Abschnitten kurz erläutert. Anschließend erfolgt eine Diskussion des Einflusses der spektralen Verbreiterung der zuvor als monochromatisch betrachteten Lichtquellen auf die Interferenzfähigkeit.

2.1.1 Zeitliche Kohärenz

Die zeitliche Kohärenz einer quasimonochromatischen elektromagnetischen Welle, deren elektrische Feldstärke durch Ψ(t) beschrieben wird, kennzeichnet die Vorhersagbarkeit des Phasenzustandes eines Wellenpunktes für den Zeitpunkt t + τ bei Kenntnis des Phasenzustandes zum Zeitpunkt t. Die Quantifizierung erfolgt

5

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

über die zeitliche Autokorrelation der Wellenfunktion Ψ(t) und wird als komplexe Selbstkohärenz Γ S (τ) bezeichnet [21]:

Hierbei bezeichnet die komplexe Konjugation. Nach Normierung ergibt sich ∗

hieraus der komplexe Kohärenzgrad γ S (τ) der elektromagnetischen Lichtwelle:

Γ S (τ)

Der Realteil ℜ des komplexen Kohärenzgrades beschreibt das durch die Überlagerung zweier Wellen entstehende Interferenzmuster. Mit der Wellenlänge λ und der Ausbreitungsgeschwindigkeit c der Wellenfunktion folgt [43]:

τc

λ

Der Betrag |γ S (τ)| des Kohärenzgrades entspricht der Einhüllenden des kosinusmodulierten Interferenzstreifenmusters und wird im Folgenden als Kohärenzfunktion γ c (τ) bezeichnet [44]: γ c (τ) = |γ S (τ)|. (2.6)

Es gilt: γ c (τ) = 0 ∀τ = 0 inkohärenter Grenzfall

0 < γ c (τ) < 1 ∀τ = 0 Teilkohärenz

Bei Teilkohärenz erreicht γ c (τ) für τ = 0 ein Maximum und fällt im Allgemeinen mit zunehmender relativer Verzögerung |τ| ab. Die mit einem Abfall auf ¹ /e des Maximums korrespondierende Zeitdifferenz wird als Kohärenzzeit τ c bezeichnet. Die Kohärenzlänge l c beschreibt die in dieser Zeit von der elektromagnetischen Welle mit der Lichtgeschwindigkeit c zurückgelegte optische Weglänge:

c

τ c . (2.8) l c =

n

In Gl. (2.8) bezeichnet n den Brechungsindex des Mediums.

2.1.2 Räumliche Kohärenz

Die räumliche Kohärenz beschreibt die Interferenzfähigkeit räumlich unterschiedlicher Bereiche einer quasimonochromatischen Wellenfront zur Zeit t. Ein hierbei

6

zentraler Aspekt ist die räumliche Ausdehnung der zu charakterisierenden Lichtquelle, wobei eine ideale Punktlichtquelle mit infinitesimaler Ausdehnung definitionsgemäß eine vollständige räumliche Kohärenz besitzt. In Analogie zur zeitlichen Kohärenz erfolgt die Definition der räumlichen Kohärenz durch die Korrelation der Wellenfelder, wobei hier zu einem vorgegebenen Zeitpunkt die Wellenfelder an räumlich unterschiedlichen Orten verglichen werden. Der zeitliche Verlauf der relativen Phasenbeziehung der beiden Wellenfelder ermöglicht hierbei die Bestimmung der räumlichen Kohärenz, wobei unabhängige Schwankungen der Phasenbeziehung zu einer verminderten räumlichen Kohärenz führen [45].

Da bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen keine räumlich ausgedehnten Lichtquellen eingesetzt werden (siehe Abschn. 3.1.1), wird auf die Berücksichtigung räumlicher Kohärenzeffekte verzichtet.

2.1.3 Kohärenzeingeschaften polychromatischer Lichtquellen

Neben schmalbandigem, langkohärentem Laserlicht werden bei den hier vorgestellten Arbeiten polychromatische Lichtquellen mit verbreitertem Emissionsspektrum eingesetzt. Aus diesem Grund wird in diesem Abschnitt der Einfluss der spektralen Verbreiterung auf die Kohärenz diskutiert, wobei insbesondere die Abhängigkeit der Kohärenzlänge von der spektralen Breite der Lichtquelle herausgestellt wird.

Der Zusammenhang zwischen der spektralen Leistungsdichte S(ν) und der komplexen Selbstkohärenz Γ S (τ) (Gl. (2.2)), welche die Interferenzfähigkeit beschreibt, ist durch das Wiener-Khinchin-Theorem gegeben [46, 47]. Es gilt:

∞ Γ S (τ) = S(ν) exp (−2πiτν) dν (2.9) 0

und

^∞ Γ(τ) exp (2πiτν) dτ. (2.10) S(ν) = 0

Hierbei beschreibt ν die Frequenz der elektromagnetischen Lichtwelle. S(ν) und Γ S (τ) - und somit auch γ c (τ) - sind über eine Fourier-Transformation verknüpft. Falls sich das Spektrum z. B. näherungsweise mittels einer Gaußfunktion beschreiben lässt, so ergibt sich für die Kohärenzfunktion ebenfalls eine gaußförmige Verteilung, wobei sich allerdings die Halbwertsbreiten reziprok verhalten. Eine schmalbandige Emission (z. B. eines Lasers) führt zu einer großen Breite in der Kohärenzfunktion. Vice versa gilt, dass eine breitbandige Lichtquelle (z. B. eine Superlumineszenzdiode) eine schmalbandige Kohärenzfunktion zur Folge hat.

7

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

Für eine gaußförmige Spektralverteilung S(ν) mit einem Emissionsmaximum ν ^c und einer spektralen Halbwertsbreite ∆ν ν − ν c 2

2 ln 2 exp −4 ln 2 . (2.11) S(ν) =

∆ν π∆ν

folgt gemäß Gl. (2.9) für die komplexe Selbstkohärenz −π ² τ ² ∆ν 2

Γ S (τ) = exp exp {−i2πν c τ} . (2.12)

4 ln 2

In Gl. (2.12) entspricht nach Realteilbildung gemäß Gl. (2.5) der erste Exponential-

term der Kohärenzfunktion γ c (τ), der zweite Term gibt die Kosinusmodulation des Interferogrammes wieder. Für die Kohärenzfunktion in Zeit- und Weglängendiffe- renzabhängigkeit gilt somit: −π ² τ ² ∆ν 2

γ c (τ) = exp (2.13)

4 ln 2

−π ² ∆z ² ∆ν 2

γ c (∆z) = exp (2.14)

4 ln 2c 2

Mit der Verhältnisgleichung von Zentralwert und Halbwertsbreite von Wellenlängen (λ c , ∆λ) und Frequenzen (ν c , ∆ν)

und λ c ν c = c

folgt hieraus die ¹ /e-Breite der Kohärenzfunktion, welche der Kohärenzlänge l c aus Gl. (2.8) entspricht:

² 4 ln 2 1 λ ^c . (2.17) l c =

n π ∆λ κ

Für die Berücksichtigung der jeweiligen Form der Spektralverteilung wird in Gl. (2.17) ein spektraler Formfaktor κ eingefügt. Für den hier disktutierten Fall ei- ^{4ln 2} ner gaußförmigen Verteilung ist κ Gauß = ≈ 0, 88, für eine Lorentzverteilung gilt

π

κ Lorentz ≈ 0, 44 und für eine Rechteckform beträgt κ Rechteck ≈ 1, 20 [48, 49].

Die gezielte Beeinflussung der Kohärenzlänge wird über den Zusammenhang zwischen spektraler Emissionsbreite ∆λ der genutzten Lichtquelle und der Kohärenzlänge l c gemäß Gl. (2.17) ermöglicht [50]. Aufgrund der Reziprozität führt eine spektrale Bandpassfilterung zu einer Erhöhung der Kohärenzlänge. Die hierbei gleichzeitig erfolgende Veränderung des spektralen Formfaktors κ führt dazu, dass die aus spektraler Bandpassfilterung resultierende Kohärenzlänge im Allgemeinen analytisch nur abgeschätzt werden kann; eine exakte Bestimmung der Kohärenzlänge muss in diesem Fall experimentell erfolgen.

8

2.2 Digitale Holographie

2.2 Digitale Holographie

Die digitale Holographie ermöglicht eine quantitative Phasenkontrastbestimmung mit interferometrischer Phasenauflösung, welche insbesondere zur zerstörungsfreien Prüfung reflektiver technischer Oberflächen und zur markerfreien Analyse zellbiologischer Proben anwendbar ist [22, 24, 25, 51].

In diesem Abschnitt werden die theoretischen Grundlagen der klassischen optischen Holographie sowie der skalaren Beugungstheorie, welche die Ausbreitung einer elektromagnetischen Lichtwelle beschreibt, vorgestellt. Hierdurch wird die Voraussetzung für die diffraktive Rekonstruktion und Propagation einer digitalholographisch gespeicherten Objektwelle geschaffen [17]. Alternativ zur diffraktiven Objektwellenrekonstruktion erlaubt die Anwendung von Methoden der phasenschiebenden Interferometrie die Rekonstruktion der Objektwelle in der Hologrammebene. Abschließend werden die durch Anwendung kurzkohärenter Lichtquellen entstehenden experimentellen und anwendungsspezifischen Besonderheiten diskutiert.

2.2.1 Grundlagen der Holographie

Das holographische Prinzip nach Dénes Gábor beruht auf der interferometrischen Aufnahme und anschließenden Rekonstruktion einer von einem Objekt gestreuten bzw. gebeugten komplexen Objektwelle durch kohärente Überlagerung mit einer Referenzwelle [9]. Im entstehenden Interferogramm sind sowohl die Amplitudenals auch die Phaseninformationen der überlagerten Wellen als Intensitätsverteilung kodiert, welche durch den Einsatz von intensitätssensitiven Aufzeichnungsmedien wie photographischen Platten oder digitalen Rasterbildsensoren aufgezeichnet werden kann.

Wird ein Objekt mit kohärentem Licht be- oder durchleuchtet, so lässt sich die hiervon ausgehende gestreute bzw. gebeugte komplexe Lichtwelle O(r, t) mit der Amplituden- A O (r, t) und Phasenverteilung φ O (r, t) unter Vernachlässigung des Vektorcharakters allgemein beschreiben als:

.

O(r, t) = A O (r, t) · exp (2.18) −iφ O (r, t)

Hierbei kennzeichnet r den Ortsvektor und t die Zeitabhängigkeit. Bei Überlagerung mit einer hierzu kohärenten Referenzwelle R(r, t)

9

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

ergibt sich für die zu beobachtende Intensitätsverteilung I H des entstehenden holographischen Interferogramms:

R .

² + |O| ² + γ c (τ) O + RO = |R|

Zur Vereinfachung der Notation wird hier auf die Angabe der räumlichen und zeitlichen Abhängigkeit r, t verzichtet. Des Weiteren wird zunächst der kohärente Grenzfall (siehe Gl. (2.7)) betrachtet und daher γ c (τ) = 1∀τ = 0 gesetzt.

Um ein solches Amplitudenhologramm optisch zu rekonstruieren, wird es mit der Rekonstruktionswelle R , die mit der Referenzwelle R übereinstimmen soll, be- ′

leuchtet. Für die transmittierte Lichtwelle ergibt sich:

² + R ² + R ² + R ² + |R| ^′ |R| ^′ |O| ^∗ |R| = R O +

O In Gl. (2.23) breiten sich die ersten beiden Summanden in Richtung der Rekon- ² struktionswelle R aus und werden als Nullte Beugungsordnung R bzw. ver- ^{′ ′} |R| ² breiterte Nullte Beugungsordnung R bezeichnet. Der dritte Summand ent- ^′ |O| ² spricht bis auf einen Skalierungsfaktor |R| der Objektwelle O. Der vierte Term enthält die komplex konjugierte Objektwelle O , welche ein inverses Vorzeichen in ∗

der Phase enthält. Die dem dritten Term entsprechende rekonstruierte Objektwel- ² lenfront |R| O breitet sich entlang der optischen Achse der ursprünglichen Objektwelle O aus, die Ausbreitungsrichtung der hierzu komplex konjugierten Objektwelle O entspricht der Spiegelung der optischen Achsen von O an R. ∗

Eine bedeutende Erweiterung des holographischen Prinzips nach Gábor stellt die Aufnahme- und Rekonstruktionsgeometrie nach Leith und Upatnieks [10] dar. Im Gegensatz zum Konzept von Gábor, bei dem Referenz- und Objektwelle in einer optischen Achse liegen („inline“-Anordnung), schlugen Leith und Upatnieks eine relative Verkippung der beiden optischen Achses gegeneinander vor („off-axis“-Anordnung), um bei der optischen Rekonstruktion die in Gl. (2.23) auftretenden Terme zu separieren. Die entsprechende Rekonstruktionsgeometrie ist in Abb. 2.1 dargestellt.

2.2.2 Aufnahme digitaler Hologramme

Das räumliche Interferogramm I H (r, t) zweier kohärenter Lichtwellen wird durch die Interferogrammgleichung (2.21) beschrieben. Im Folgenden wird vom stationären Fall ausgegangen (Vernachlässigung von t) und r = (x, y) genutzt. Bei Substitution der Untergrundintensität

² + |O(x, y)| ² I 0 (x, y) = |R(x, y)| (2.24)

10

Abbildung 2.1: Holographische Aufnahme- und Rekonstruktionsgeometrie nach

Leith-Upatnieks (vgl. Gl. (2.23))

und dem interferometrischen Modulationsgrad

= 2

lässt sich Gl. (2.21) umschreiben zu:

^∗ I H (x, y) = I 0 (x, y) + 2ℜ(R (x, y)O(x, y)) (2.27)

.

= I 0 (x, y) + γ 0 (x, y) cos φ 0 (x, y) − φ R (x, y) (2.28)

Bei der Aufnahme eines Interferogramms mit einem digitalen Rasterbildsensor muss berücksichtigt werden, dass die detektierten Intensitätsverteilungen in eine diskrete Abtastung überführt werden, wobei die Intensitätswerte jeweils der Integration über die Pixelgröße entsprechen. Im Fall der off-axis-Anordnung nach Leith-Upatniecks ergibt sich bei einem räumlich näherungsweise konstanten zweidimensionalen Phasengradienten β mit ∂(φ O ^−φ R )

∂l

die Interferogrammgleichung Gl. (2.28) für die Pixelindizes k, l in diskreter Form [20]:

β

I H (k, l) = I 0 (k, l) + γ 0 (k, l) sinc cos φ 0 (k, l) − φ R (k, l) . (2.30)

2

Der Sinc-Term beschreibt die Integration über die einzelnen Pixel und lässt sich mit mit der Modulation γ 0 (k, l) zur effektiven Modulation γ eff (k, l) zusammenfassen: β

11

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

Hiermit folgt schließlich für die Interferogrammgleichung [20]:

I H (k, l) = I 0 (k, l) + γ eff (k, l) cos φ 0 (k, l) − φ R (k, l) . (2.32)

2.2.3 Skalare Beugungstheorie

Die optische Rekonstruktion einer holographisch gespeicherten Objektwelle erfolgt gemäß Gl. (2.23) durch die Beugung einer Rekonstruktionswelle an den Hologrammstrukturen [52]. Für die numerische Hologrammauswertung ist die skalare Beugungstheorie von zentraler Bedeutung, da hierdurch ein mathematisches Modell der Lichtausbreitung aufgestellt wird, welches die digitalholographische Rekonstruktion und Propagation von Wellenfeldern beschreibt. Schnars et al. demonstrierten die Objektwellenrekonstruktion durch Beugung einer simulierten Referenzwelle an den Hologrammstrukturen in Analogie zur optischen Holographie [17]. Alternativ bietet die Anwendung von Methoden der phasenschiebenden Interferometrie (siehe Abschn. 2.2.4) die Möglichkeit zur Objektwellenrekonstruktion in der Hologrammebene. Durch die Kombination mit der skalaren Beugungstheorie wird hierbei eine digitalholographische Rekonstruktion und Propagation ermöglicht, bei der die Nullte Beugungsordnung sowie das Zwillingsbild (siehe Gl. (2.23)) nicht auftreten [53].

2.2.3.1 Fresnel-Kirchhosches Beugungsintegral

Die Grundlage zur Beschreibung von Beugungseffekten ist durch das Huygens-Fresnelsche-Prinzip gegeben, welches besagt, dass jeder Punkt einer Wellenfront als Ausgangspunkt einer Elementarwelle angesehen werden kann. Die Ausbreitung der Wellenfront ergibt sich durch die Superposition dieser Elementarwellen. Die mathematische Formulierung des Huygens-Fresnelschen-Prinzips gemäß der ersten Rayleigh-Sommerfeld-Lösung in kartesischen Koordinaten (siehe Abb. 2.2) ist in Gl. (2.33) dargestellt. Hierdurch wird die Ausbreitung eines komplexen Wellenfeldes Ψ 0 (x, y) aus einer (x, y)-Ebene um die Propagationsdistanz z in eine Ebene (ξ, η) mittels der Superposition der Elementarwellen mit der Wellenlänge λ beschrieben [54]:

i ∞ ^2π exp r(x, y, z, ξ, η) 1

dx dy λ Ψ z (ξ, η) = Ψ 0 (x, y) cos (2.33) θ(x, y, z, ξ, η)

iλ r(x, y, z, ξ, η) −∞

mit dem kartesischen Abstand r(x, y, z, ξ, η)

² + z 2

² + (2.34) (ξ − x) r(x, y, z, ξ, η) = η − y

12

Abbildung 2.2: Geometrie des Huygens-Fresnelschen-Prinzips in kartesischen

Koordinaten

und dem Raumwinkel θ(x, y, z, ξ, η)

z

θ(x, y, z, ξ, η) = arccos . (2.35)

r(x, y, z, ξ, η)

Die zugehörige Geometrie ist in Abb. 2.2 veranschaulicht. Der Kosinus-Term in Gl. (2.33) lässt sich gemäß Gl. (2.35) durch cos θ = ^z /r ersetzen und es folgt:

i ∞ ^2π exp r(x, y, z, ξ, η)

z λ Ψ z (ξ, η) = Ψ 0 (x, y) dx dy. (2.36)

r ² (x, y, z, ξ, η) iλ −∞

Die Formulierung des Huygens-Fresnelschen-Prinzips gemäß Gl. (2.36) enthält zwei Approximationen: gemäß der skalaren Beugungstheorie wird der vektorielle Charakter der elektromagnetischen Welle vernachlässigt, des Weiteren wird vorausgesetzt, dass die Ausbreitungsdistanz r deutlich größer als die Wellenlänge λ sei (r ≫ λ) [54].

2.2.3.2 Fresnel-Approximation

Bei der Fresnel-Approximation zur numerischen Auswertung des Hugens-Fresnel-Integrals in Gl. (2.36) wird der im Exponentialterm in Gl. (2.34) definierte kartesische Abstand r zwischen zwei Punkten P 0 und P z des ursprünglichen und des propagierten Wellenfeldes (siehe Abb. 2.2) mit Hilfe einer Taylorreihe erster Ordnung genähert:

2 η − y

² 1 + (2.37) r = z +

z z ξ − x 2 η − y ² 1 1

1 + . (2.38) ≈ z +

2 2 z z

13

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

Zur weiteren Vereinfachung wird r im Nenner von Gl. (2.36) durch eine Taylor-Reihe nullter Ordnung zu r ≈ z genähert (paraxiale Approximation). Bezüglich des Gültigkeitsbereichs der beiden Näherungen, welche als Fresnel-Approximation bezeichnet werden, wird auf [18, 54] verwiesen.

Hiermit ergibt sich für Gl. (2.36):

i iπ ^2π exp z

² + (η − y) 2 λ Ψ z (ξ, η) = Ψ 0 (x, y) exp (ξ − x) dx dy. (2.39)

iλz zλ −∞

Die Relation 2.39 wird als Fresnelsches Beugungsintegral bezeichnet und kann als Faltung interpretiert werden. Es folgt:

^∞ Ψ z (ξ, η) = Ψ 0 (x, y) · K(ξ − x, η − y) dx dy (2.40)

−∞

mit einem Faltungskern K(ξ, η, z):

i iπ ^2π exp z

² + η) 2 λ exp (ξ . (2.41) K(ξ, η, z) =

iλz zλ

Alternativ hierzu wäre es möglich, des Beugungsintegral (Gl. (2.39)) durch eine diskrete Fresnel-Transformation auszuwerten. Da hieraus jedoch eine Abhängigkeit des Abbildungsmaßstabs von der Propagationsweite z resultiert, wird hier die Interpretation als Faltung verwendet [18].

Da die digitale Holographie keine absolute, sondern eine relative quantitative Bestimmung der Phasenverteilung ermöglicht, wird im Folgenden der lateral konstan- i ^{2π exp} λ z

te Phasenfaktor aus Gl. (2.41) für eine übersichtliche Notation vernachläs- iλz

sigt. Hiermit ergibt sich gemäß dem Faltungssatz: iπ

² + y ² exp (2.42) F {Ψ z (x, y)} =F {Ψ 0 (x, y)} F

zλ

.

² + η ² =F {Ψ 0 (x, y)} exp (2.43) ξ −iπλz

In Gl. (2.43) kennzeichnet F die Fourier-Transformation. Zur numerischen Auswertung von diskretisierten Daten werden die Ortskoordinaten im Folgenden in Abhängigkeit von der lateralen Sensorelementgröße ∆x bzw. ∆y, deren Laufindizes k, l, m, n und Pixelanzahl in x- bzw. y-Richtung N k und N l formuliert. Für die propagierte Lichtwelle Ψ z im Abstand z von der ursprünglichen Lichtwelle Ψ ⁰ folgt [55]:

^{2 2} m n

⁻¹ . (2.44) Ψ z (k, l) = FFT FFT {Ψ 0 (k, l)} exp −iπλz +

^{2 2} ∆x ² N ∆y ² N

k l

14

Mit FFT wird hier die schnelle Fourier-Transformation abgekürzt (engl. „Fast Fourier Transformation“). Die in Gl. (2.43) und Gl. (2.44) aufgeführte Transformation wird als sogenannte Faltungsmethode bezeichnet und mit CVM abgekürzt (engl. „convolution method“).

Die CVM beschreibt die Ausbreitung eines komplexen Wellenfeldes und kann daher in Analogie zur optischen Rekonstruktion (Abschn. 2.2.1) für die numerische Simulation der diffraktiven Objektwellenrekonstruktion genutzt werden. Hierzu erfolgt zunächst gemäß Gl. (2.23) die Multiplikation der Intensitätsverteilung des Hologramms mit einem geeigneten mathematischen Modell für die Referenzwelle, z. B. einer ebenen oder sphärischen Welle [55]. Die Anwendung der CVM-Propagation resultiert in Analogie zu Gl. (2.23) in der gleichzeitigen Rekonstruktion von Nullter Beugungsordnung, reellem und virtuellem Bild (vgl. Abb. 2.1). Bei Anwendung der von Leith und Upatnieks vorgeschlagenen Off-Axis Aufnahmegeometrie erfolgt auch im Fall der numerischen Auswertung die räumliche Trennung der in Gl. (2.23) auftretenden Terme, wobei jedoch aufgrund der Termseparation nur ein Teilbereich des Bildfeldes für die Objektwellenrekonstruktion genutzt wird [55].

Eine Methode zur Vermeidung der Rekonstruktion der Nullten Beugungsordnung und des Zwillingsbildes ergibt sich durch die Anwendung von Verfahren der phasenschiebenden Interferometrie zur Objektwellenrekonstruktion in der Hologrammebene, auf die im nachfolgenden Abschnitt eingegangen wird.

2.2.4 Phasenschiebende Verfahren zur

Objektwellenrekonstruktion

Eine alternative Methode zur Rekonstruktion der komplexen Objektwelle ist durch die Lösung der Interferogrammgleichung (2.32) gegeben. Die Anwendung von Verfahren der phasenschiebenden Interferometrie [56] ermöglicht die Bestimmung der Objektwelle φ O (k, l) in der Hologrammebene, wodurch die Justage des Abbildungssystems vereinfacht wird. Im Folgenden wird zunächst das Prinzip der phasenschiebenden Interferometrie erläutert, anschließend erfolgt die Herleitung des im Rahmen dieser Arbeit genutzten Rekonstruktionsalgorithmus.

Sofern die Phasenverteilung der Referenzwelle φ R (k, l) bekannt ist, enthält die Interferogrammgleichung (2.32) drei Variablen: die Untergrundintensität I 0 , die effektive Modulation γ eff und die Objektphase φ O . Um eine eindeutige Lösbarkeit der Interferogrammgleichung zu gewährleisten, muss daher ein linear unabhängiges System aus mindestens drei Gleichungen aufgestellt werden. Hierzu erfolgt zunächst die mathematische Modellierung der Referenzwellenphase entsprechend

15

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

einer verkippten ebenen Welle mit einem zeitlich variablen Phasenschub β t . Es gilt:

φ R,i (k, l) = kβ k + lβ l + iβ t + C. (2.45)

In Gl. (2.45) entspricht (β k , β l ) dem Vektor des Phasengradienten und der Laufindex i der Anzahl der Phasenschübe. Für den globalen Phasenoffset kann aufgrund !

der relativen Phasenmessung C = 0 gesetzt werden. Zur Entkopplung des Gleichungssystems erfolgt die definierte Variation der Referenzwellenphase φ R,i (k, l), wobei sich zwei Möglichkeiten bieten. Wird die Phase zeitlich variiert, so wird eine Sequenz aus mindestens drei Interferogrammen aufgenommen, wobei jeweils zwischen den Aufnahmen der Phasenschub β t der Referenzwelle durchgeführt wird. In diesem Fall spricht man von zeitlichem Phasenschieben (TPS, engl. „temporal phase shifting“). Beim räumlichen Phasenschieben (SPS, engl. „spatial phase shifting“) wird innerhalb eines einzelnen Interferogramms durch Auswertung nebeneinanderliegender Intensitätswerte das zu lösende Gleichungssystem aufgestellt. Für eine ausführliche Beschreibung der hieraus resultierenden Phasenschiebeverfahren wird auf die Literatur verwiesen, z. B. [57-61].

Da für die zeitlich phasenschiebende Rekonstruktion die Aufnahme einer Interferogrammsequenz erforderlich ist, werden in diesem Fall besondere Stabilitätsanforderungen an den Experimentalaufbau sowie das zu untersuchende Objekt gestellt. Da während der Bilddatenerfassung keine Objektbewegungen oder -instabilitäten auftreten dürfen, damit die Messergebnisse nicht durch (Phasen-) Fluktuationen verfälscht werden, findet das TPS-Verfahren schwerpunktmäßig Anwendung bei Untersuchungen an zeitlich stabilen technischen Objekten. Des Weiteren wird bei digitalholographischen Untersuchungen mit Lichtquellen mit geringer Kohärenzlänge wie z. B. superhellen LEDs, deren Kohärenzlänge den maximalen Phasengradienten begrenzt (vgl. Gl. (2.87)), durch den Einsatz von zeitlichen Phasenschiebeverfahren die Anwendbarkeit sichergestellt [62-64].

In [22, 65, 66] wurde gezeigt, dass räumlich phasenschiebende Verfahren besonders für Untersuchungen an dynamischen Proben wie z. B. biologischen Zellen und Gewebe geeignet sind, da die zeitliche Stabilität nur innerhalb der Einzelbelichtungszeit eines Hologramms (überlicherweise einige Millisekunden) gegeben sein muss. Hierbei ergibt sich jedoch aufgrund der Auswertung von benachbarten Pixelwerten eine verminderte laterale Auflösung im Vergleich zum TPS. Da in der Mikroskopie bei Einsatz eines hochauflösenden Kamerasensors unter geeigneten Bedingungen die Punktbildfunktion überabgetastet wird, kann dieser Effekt vernachlässigt werden [18].

Das in dieser Arbeit genutzte Verfahren zur digitalholographischen Rekonstruktion der komplexen Objektwelle beruht auf einer erweiterten räumlichen Phasenschiebemethode, welche in der Literatur auch als non-diffractive reconstruction

16

Abbildung 2.3: Auswertung eines digitalen Hologramms (links): für jeden Intensi- I H,m=1 -I H,m=25 innerhalb eines 5 × 5 Pixel großen Berei-

method (NDRM) überbestimmten Gleichungssystems, wobei die Hologrammintensitäten innerhalb einer quadratischen Umgebung um einen auszuwertenden Bildpunkt berücksichtigt werden. Des Weiteren wird durch eine Variablentransformation ermöglicht, das ursprünglich nichtlineare Gleichungssystem durch einen linearen Lösungsansatz zu bestimmen. Im Folgenden wird in Anlehnung an [19] der zur Objektwellenrekonstruktion verwendete Algorithmus hergeleitet.

Entsprechend dem zuvor beschriebenen Prinzip des räumlichen Phasenschiebens wird davon ausgegangen, dass das Modell der Referenzwellenphase φ R (k, l) und somit die Intensitätsverteilung des digitalen Hologramms I H (k, l) deutlich stärker räumlich variiert als die Referenzwellenamplitude A R (k, l) und die komplexe Objektwelle O(k, l). Innerhalb der Umgebung eines jeden Interferogrammpunktes (k, l) können daher sowohl A R als auch O als räumlich konstant angenommen wer-

den.

Ausgehend von der diskreten Schreibweise der Interferogrammgleichung (2.28) ergibt sich hiermit für einen Intensitätswert I H,m eines Punktes m innerhalb des zur Auswertung betrachteten Bereichs (hier 5 × 5 Pixel) um eine Position (k, l) (vgl. Abb. 2.3): ² + A 2 ^∗ R + 2ℜ(R (2.46) I H,m = |O| m O).

Zur Bestimmung der komplexen Objektwelle wird die Methode der kleinsten quadratischen Abweichung verwendet. Es folgt:

17

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

Mit der Untergrundintensität ² + A ² R , (2.48) I 0 = |O|

der Variablentransformation Z = O · A R , (2.49)

sowie der Einführung einer normierte Referenzwelle

^∗ R

A R

lässt sich Gl. (2.47) umschreiben in:

I H,m − I 0 − 2ℜ(

Es sei angemerkt, dass Z ∈ C und I 0 ∈ R + sind. Wird Gl. (2.50) nach den substituierten Variablen I 0 , Z und Z differenziert, so ergibt sich ∗

I H,m − I 0 − 2ℜ(

Nach Ausmultiplizieren und Umstellen folgt hieraus:

Mit der Vereinfachung

resultiert aus Gl. (2.54-2.56):      

m I H,m 1 α α ^∗ I 0

      = α β 1  . (2.57) Z R m I H,m ^∗  m

1 β ^{∗ ∗ ∗} Z R m I H,m α m

18

Das in Gl. (2.57) aufgeführte lineare Gleichungssystem lässt sich für jedes Koordinatenpaar (k, l) aufstellen und lösen. Die hieraus resultierenden Lösungen für die Variablen I 0 , Z und Z müssen abschließend noch zurücksubstituiert werden, ∗

wodurch sich die Rekonstruktion der komplexen Objektwelle O(k, l) ergibt:

2 0 − 4|Z| ² I 0 ± I (2.58) A R± = +

2 Z

. (2.59) O =

A R

Sofern die Objektwelle nicht in die Hologrammebene abgebildet wurde, kann die rekonstruierte komplexe Objektwelle O(k, l) unter Einsatz des faltungsbasierten Propagationsalgorithmus CVM (Gl. 2.43/2.44) in die Bildebene propagiert werden.

2.2.5 Separation der komplexen Objektwelle

Aus der gemäß Gl. (2.59) resubstituierten komplexen Objektwelle O(k, l) = A O (k, l)·

lässt sich die räumliche Amplitudenverteilung A O (k, l) folgender- −iφ O (k, l) maßen bestimmen:

ℜ{O(k, l)} ² + ℑ{O(k, l)} ² . A O (k, l) = (2.60)

Die räumliche Phasenverteilung φ O (k, l) von O(k, l) wird bestimmt zu:

ℑ{O(k, l)} φ(k, l) = arctan 2 . (2.61)

ℜ{O(k, l)}

Hierbei kennzeichnet arctan 2 eine getrennte Vorzeichenbetrachtung von Zähler und Nenner des Arkustangens-Quotienten, wodurch der auf [−π/2; +π/2] begrenzte Wertebereich der Arkustangensfunktion auf [−π; +π] erweitert wird. Es gilt [69, 70]:

ℑ{O(k, l)}

φ(k, l) = arctan 2

2 falls ℑ{O(k, l)} ≥ 0 ∧ ℜ{O(k, l)} < 0 +

^ℜ{O(k,l)} (2.62) =

^ℑ{O(k,l)}        π − arctan 2 falls ℑ{O(k, l)} ≤ 0 ∧ ℜ{O(k, l)} < 0 −

ℜ{O(k,l)}

^ℑ{O(k,l)} + arctan falls ℑ{O(k, l)} ≤ 0 ∧ ℜ{O(k, l)} > 0

ℜ{O(k,l)}

19

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

2.2.6 Kompensation von Phasenabberationen

Die in der separierten Phasenverteilung φ(k, l) (Gl. (2.61)) enthaltenen Phasenabberationen, welche durch das Abbildungssystem sowie die relative Verkippung von Objekt- und Referenzwelle hervorgerufen werden, können in guter Nährung durch ein zweidimensionales Polynommodell 2. Ordnung φ Modell (k, l) wiedergegeben werden [19, 22]: ² + P 2 l ² + P 3 k + P 4 l + P 5 . φ Modell (k, l) = P 1 k (2.63)

In Gl. (2.63) bezeichnen P 1 , P 2 , P 3 , P 4 und P 5 reellwertige Anpassungsparameter. Für die abberationskorrigierte Phasenverteilung folgt:

φ korr (k, l) = φ(k, l) − φ Modell (k, l). (2.64)

Die Phasenverteilung φ korr (k, l) wird anschließend zur digitalholographischen Propagation bzw. Autofokussierung als Objektwellenphase φ O (k, l) übernommen.

2.2.7 Interpretation der rekonstruierten Phasenverteilung

Die Objektphasenverteilung φ O (k, l) wird in der digitalen Holographie zur Bestimmung der Morphologie bzw. der Brechungsindizes des abgebildeten Objektes genutzt. Der dem Messprinzip zugrundeliegende Zusammenhang wird in diesem Abschnitt kurz aufgeführt.

Für die der Objektphasenverteilung φ O (k, l) entsprechenden optische Weglängenänderung OPL (engl. „optical path length“) gilt [71]:

λ c

OPL(k, l) = · φ O (k, l). (2.65)

2π

Aus der Verteilung der optischen Weglänge OPL(k, l) können nachfolgend sowohl Morphologie und integraler Brechungsindex eines Objektes ermittelt werden [30]. Es gilt [52]:

2h(k, l)n M für Auflicht

OPL(k, l) = (2.66)

d(k, l)(n M − n O ) für Durchlicht

In Gl. (2.66) bezeichnet h(k, l) die Morphologie eines reflektiven bzw. d(k, l) die Dicke eines transparenten Abbildungsobjektes mit integralem Brechungsindex n O . n M ist der Brechungsindex des umgebenden Mediums.

Der bei konstanter optischer Weglänge OPL durch Gl. (2.65) beschriebene Skalierungseffekt der Objektwellenphase φ O (k, l) mit der Zentralwellenlänge λ c wird in Abschn. 4.2.2.3 anhand von Untersuchungen an lebenden Fibrosarkomzellen in Durchlicht diskutiert.

20

Für eine detaillierte Beschreibung der Auswertung der Phasenverteilung zur quantitativen Bestimmung von Morphologie, Dicke und integralem Brechungsindex wird auf die Darstellung in [18, 22-32] verwiesen.

2.2.8 Laterales Auösungsvermögen und Schärfentiefe

Das laterale optische Auflösungsvermögen eines abberationsfreien, fokussierten kohärenten Abbildungssystems wird durch die Beugung begrenzt. Die Beugung einer Lichtwelle mit der Wellenlänge λ an einer Kreisblende mit der Radius w wird durch die Intensität I CTF der kohärenten Punktbildfunktion CSF (engl. „Coherent Point Spread Function“) beschrieben (vgl. Abschn. 2.3.1) [72, 73]:

2π ^w x ² + y ² ) 2J 1

( f λ I CSF (x, y) = (2.67)

x ² + y ² πw

x ² + y ² dem radialen Abstand zur geometrischen beschrieben. Hierbei entspricht

Projektion und f der Brennweite des optischen Systems; J 1 ist eine Besselfunktion erster Art. Gemäß dem Rayleigh-Kriterium wird die Auflösung definiert durch den Abstand zweier Punkte, bei denen die Punktbildfunktion des einen mit dem 1. Minimum der anderen zusammenfällt. Somit folgt aus der Lage der ersten Nullstelle der Besselfunktion (J 1 (3, 83) ≈ 0) [74]:

2π w

x ² + y ² ≈ 3, 83 (2.68)

f λ min

x ² + y ² Mit dem radialen Abstand ρ min = und dem Durchmesser des opti- min

schen Systems D = 2w folgt hieraus:

3, 83 f λ f λ

≈ 1, 22 (2.69) ρ min =

D D π

In der Mikroskopie wird anstelle des Quotienten aus Brennweite f und Aperturdurchmesser D die numerische Apertur NA zu Bestimmung des Auflösungsvermögens ρ min verwendet [47]: D

NA = n sin α = (2.70)

2 f

In Gl. (2.70) entspricht n dem Brechungsindex des Mediums im Objektraum und α dem halben Öffnungswinkel des Objektives. Es folgt für das laterale Auflösungsvermögen eines Mikroskops:

21

2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen

Abbildung 2.4: Skizze zur Bestimmung der Schärfentiefe: g und b: Gegenstands-und Bildweite; ∆b v , ∆b h : Abstand der vorderen bzw. hinteren Bild-

∆z DOF (DOF, objektseitigen Ebenen, in dem sich die Schärfe der abgebildeten Objektstrukturen nicht signifikant verändert. Für die in Abb. 2.2.8 gezeigte Abbildungsgeometrie wird ∆z DOF nachfolgend bestimmt [47]. Mit dem 2. Strahlensatz gilt:

u

(b − ∆b v ). ∆b v =

D

In der Mikroskopie folgt mit 2b ≫ ∆b h − ∆b v :

u

(2b + ∆b h − ∆b v ) (2.74) ∆b ges = ∆b h + ∆b v =

D ≈2b

Somit ergibt sich für u: D ∆b ges

. (2.75) u =

2 b

Mit den für die mikroskopische Abbildungsgeometrie gültigen Approximationen ^{∆b ges/b} ≈ ^{∆g ges/g} und g ≈ n · f folgt hieraus

⇔ ∆g ges =

NA

22

Tabelle 2.1: Laterales Auflösungsvermögen ρ min und Schärfentiefe z DOF der ver-

λ = 532 ∆x = 4,

Gemäß Gl. (2.77) wird die tolerierte Gegenstandsweitenänderung ∆g ges , welche der Schärfentiefe ∆z DOF entspricht, durch u begrenzt. Der Durchmesser u ist in Analogie zur lateralen Auflösung wellenoptisch durch die CSF limitiert [75]. Einsetzen von u = 2ρ min (Gl. (2.71)) ergibt:

nλ

∆z DOF,1 = 1, 22 (2.78)

² NA

Die Schärfentiefe wird außerdem durch das laterale Auflösungsvermögen ∆x des Rasterbildsensors begrenzt, da hierdurch der minimal messbare Wert für u vorgegeben wird. Aus Gl. (2.75) folgt mit b ≈ f und der Gesamtvergrößerung V = ^∆b /∆g des optischen Systems

⇔ ∆z DOF,2 =

V · NA

Die resultierende Schärfentiefe ∆z DOF ist durch das Maximum von ∆z DOF,1 und ∆z DOF,2 gegeben. In der Praxis hat es sich bewährt, ∆z DOF als Summe aus ∆z ^DOF,1 und ∆z DOF,2 abzuschätzen [76, 77]:

nλ n

∆z DOF = 1, 22 (2.81) ∆x. +

² V · NA NA

Die gemäß Gl. (2.81) und Gl. (2.71) bestimmte Schärfentiefe und das laterale Auflösungsvermögen der im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Mikroskopobjektive sind in Tab. 2.1 aufgeführt.

Zur Bestimmung der bildseitigen Schärfentiefe z DOF,b , welche der in den Bildraum transformierten Schärfentiefe z DOF entspricht, ist der Zusammenhang zwischen Objekt- und Gegenstandsweitenänderungen ∆b bzw. ∆g erforderlich. Sofern das

23