Analyse des VNTR Locus D1S80

Inhaltsverzeichnis

Abstract

1 Einleitung

2 Material und Methoden
2.1 Material
2.2 Methoden
2.2.1 DNA-Isolierung aus der Mundschleimhaut
2.2.2 Photometrische DNA-Konzentrationsbestimmung
2.2.3 Amplifikation der DNA mittels PCR
2.2.4 Agarosegelelektrophorese

3 Ergebnisse
3.1 Messwerte
3.2 Pipettierschema für die PCR
3.3 Gelbilder
3.4 Tabellen
3.5 Graphen

4 Diskussion

5 Fragen im Skript

Literatur

Abstract

Das menschliche Erbgut enthält sich tandemartig wiederholende Abschnitte, so genannte Variable Number of Tandem Repeats (VNTR), deren Funktion weitgehend unbekannt ist. Aufgrund der varia- blen Wiederholungsanzahl, die nach den Mendel’schen Regeln vererbt werden, eignen sie sich zur eindeutigen Identifizierung eines Menschen (Genetischer Fingerabdruck) und zur Analyse dessen verwandtschaftlicher Beziehungen.

Ziel dieses Versuches ist es, die Repeatzahl des VNTR-Locus D1S80 der eigenen DNA, der des Ver- suchspartners und der Praktikumsbetreuer zu bestimmen, sowie eine unbekannte DNA Probe der Praktikumsbetreuer zu identifizieren.

Dazu wurde mithilfe des „Invisorb Spin Swab Kit“ von Invitek die DNA aus der Mundschleimhaut isoliert und aufgereinigt. Der betreffende Genabschnitt wurde mittels PCR amplifiziert und anschließend durch Gelelektrophorese nach der Repeatzahl aufgetrennt. Durch Auftragen der Laufstrecken gegen den Logarithmus der Basenpaare der Markerfragmente wurde eine Ausgleichgerade erstellt. Mithilfe der Geradengleichung und der Laufstrecken der Probenfragmente wurden die Repeatzahlen aller Proben bestimmt. Die unbekannte Probe wurde durch Vergleich mit den bekannten Proben zugeordnet.

Der Versuch hat nicht optimal funktioniert. Die Banden waren nur schwach und die Marker der Betreuer zum Teil nicht vorhanden. Die Auswertung wurde daher so weit wie möglich vorgenommen, die Zuordnung der unbekannten Probe und die Berechnung der Repeatzahlen der Betreuer wurden anhand eines Mustergels exemplarisch durchgeführt.

1 Einleitung

Die Erbinformationen des Menschen ist in Form von DNA in jeder Zelle enthalten. Jedoch kodiert nur ein kleiner Anteil der DNA für Gene, ein weit größerer Teil der DNA ist nicht-kodierend. Ihre Funktion ist noch weitgehend unklar. Ein Teil der nicht-kodierenden DNA besteht aus repetitiven Sequenzen. Man unterscheidet zwischen Variable Number of Tandem Repeats (VNTR), so genannte Minisatelliten, die in diesem Versuch näher untersucht werden sollen, und Short Tandem Repeats (STR). STR bestehen aus 2-7 Basenpaaren mit 10-1000 Wiederholungen. Sie sind vermutlich durch fehlerhafte DNA-Replikation entstanden und befinden sich häufig innerhalb von Introns kodierender Bereiche, weshalb sie oftmals für Krankheiten wie Huntington verantwortlich sind. VNTRs bestehen aus ca. 10-150 Nukleotiden, welche sich bis zu 50 Mal wiederholen. Diese Wiederholungen sich hoch polymorph und liegen fern ab von kodierender DNA, weshalb sie nicht mit Krankheiten assoziiert sind. Der Locus wird von den Eltern vererbt, ein Individuum kann homo- oder heterozygot sein. Eine eindeutige Verwandtschaftsbeziehung ist jedoch erst durch die Analyse mehrerer Loci, um die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Übereinstimmung zu reduzieren, feststellbar.

Der VNTR-Locus D1S80 liegt auf dem distalen Ende von Chromosom 1 auf der Map Position 80 und enthält, mit Ausnahme eines 14 Basenpaare (bp) langen Repeats, eine 16 Nukleotide lange Sequenz der Form 5’ GAA GAC CAC CGG AAA G 3’, die 14 bis 42 mal wiederholt wird. Die Wiederholungssequenz ist von spezifischen, bei allen Menschen gleichen Sequenzen von 115 bp am 5’ Ende und 32 bp am 3’ Ende flankiert, an die die Primer binden.

Zur Analyse des VNTR-Locus D1S80 stehen im Wesentlichen zwei Methoden zur Verfügung; zum einen restriction fragment length polymorphism (RFLP), ein enzymatischer Restriktionsverdau mit anschließender Auftrennung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Sichtbarmachung durch Southern Blot, und zum anderen amplification fragment length polymorphism (AFLP), eine Amplifikation des zu untersuchenden DNA-Abschnitts mittels PCR und anschließender Agarosegelelektrophorese oder PAGE.

Im folgenden Versuch wurde die genomische DNA der Versuchsdurchführenden isoliert und der VNTR-Locus D1S80 mit Hilfe der AFLP-Methode analysiert. Des Weiteren wurde eine unbekannte DNA-Probe mit drei Makern verglichen, um eine Übereinstimmung zu detektieren.

2 Material und Methoden

2.1 Material

- Agarosegel mit Kammer
- destilliertes Wasser
- DNA-Probenpuffer (DNA-PP)
- dNTPs
- Eis
- 1,5 ml Eppendorfgefäße
- Hyper Ladder IV
- „Invisorb Spin Swab Kit“ von Invitek: Lysispuffer G, Proteinase K, Bindungspuffer T, Säule, zwei

2 ml Sammeltubes, Waschpuffer W, Elutionspuffer D

- Latexhandschuhe
- Marker der Betreuer
- MgCl2
- Netzgerät
- Nitrilhandschuhe
- Phusion Polymerase
- Pinzette
- Pipetten
- Pipettenspitzen
- Photometer
- Primer
- Quarzküvetten
- 1xTBE
- Thermo-Mixer
- Thermocycler
- Tischzentrifuge
- UV-Gelkamera
- Wattestäbchen

2.2 Methoden

2.2.1 DNA-Isolierung aus der Mundschleimhaut

Mit einem Wattestäbchen werden lose Mundschleimhautzellen entnommen. Die DNA-Isolierung beginnt mit einem Zellaufschluss durch 15-minütige Inkubation mit Proteinase und Lysispuffer bei 65 ◦ C im Thermo-Mixer. Anschließend werden die aufgeschlossenen Zellen mit einem Bindungspuffer auf die Anionenaustauschersäule des Kits aufgetragen, welche die DNA bindet. Durch anschließendes Waschen wird die DNA von den anderen Zellbestandteilen befreit. Durch die Kräfte, die bei der Zentrifugation entstehen, wird die Lösung durch die Säulenmembran gepresst. Die gereinigte DNA wird mit einem Elutionspuffer wieder von der Säule eluiert.

2.2.2 Photometrische DNA-Konzentrationsbestimmung

Die DNA-Konzentration einer Probe kann durch Messung ihrer Absorption bei 260 nm über das Lambert-Beer’sche Gesetz berechnet werden. Da das Gesetz nur im linearen Bereich zwischen 0,1 und 1 gilt, muss die Probe entsprechend verdünnt (1:10, 1:5) werden. Die Reinheit der Probe bestimmt sich über den Ratio-Wert, das Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu 280 nm, und sollte zwischen 1,7 und 1,9 liegen. Die Messwerte unserer Photometrischen Bestimmung finden sich in Tabelle ??.

Lambert-Beer’sches Gesetz:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.3 Amplifikation der DNA mittels PCR

Mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine schnelle Amplifikation von DNA möglich. Zu- nächst wird die Template-DNA bei 98 ◦ C denaturiert. Bei Abkühlung auf die sog. Annealingtemperatur von 69 ◦ C kommt es zur Anlagerung der Primer und der Taq-Polymerase, welche bei 72 ◦ C die Elonga- tion des neuen Strangs durch den Anbau von Desoxynukleotidphosphaten an die Primer ermöglicht.

Diese Reaktionsfolge kann mehrfach wiederholt werden, wodurch der gewünschte DNA-Abschnitt exponentiell amplifiziert wird. Die Amplifikation wird beendet, wenn die Zahl der Nebenprodukte zu groß wird oder die Primer oder dNTPs limitierend wirken.

Für jeden PCR-Ansatz wurden 50 ng DNA eingesetzt. Ein Pipettierschema befindet sich in Tabelle ??. Primersequenzen:

Tabelle 1: Thermocycler-Programm:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.4 Agarosegelelektrophorese

Mithilfe der Gelelektrophorese können Nukleinsäuren abhängig von ihrer Fragmentlänge und Gestalt aufgetrennt werden. Die Auftrennung wird durch die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten durch das Gel bedingt, welche von der Porengröße des Gels, von der Höhe der angelegten Spannung, vom pH-Wert und von der Ionenstärke des Puffers beeinflusst werden. Die DNA-Proben werden mit DNA-PP angefärbt und beschwert, sodass sie leichter in die Geltaschen pipettiert werden können. Das angelegte elektrische Feld bewirkt die Wanderung der durch das Zucker-Phosphat-Rückgrat negativ geladenen DNA zum Pluspol. Das Gel wird bei ausreichender Auftrennung unter UV-Licht fotographiert. Die DNA-Banden leuchten, da das Ethidiumbromid aus dem Gel, welches mit der DNA interkaliert, unter UV-Licht fluoresziert.

Tabelle 2: Beladung der Geltaschen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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