Experimente im Gentechnikunterricht der Sekundarstufe II - Selbsteinschätzung und reeller Lernzuwachs der Schülerinnen und Schüler eines Biologie-Leistungskurses der Jahrgangsstufe 12

INHALTSVERZEICHNIS 2

  Inhaltsverzeichnis  

1.  Einleitung Seite  4

2.  Sachanalyse  

2.1.  Definition und Möglichkeiten von Gentechnik Seite  7

2.2.  Theorie zu Versuch  1

2.2.1.  Aufbau der DNA Seite  11

2.2.2.  Replikation von DNA Seite  14

2.2.3.  Isolation von DNA aus eukaryontischen Zellen Seite  16

2.3.  Theorie zu Versuch  2

2.3.1.  Das Bakterium Escherichia coli Seite  17

2.3.2.  Proteinbiosynthese Seite  17

2.3.3.  Das Operon-Modell Seite  21

2.3.4.  Regulation des Lactoseabbaus bei Escherichia coli Seite  23

2.4.  Theorie zu Versuch  3

2.4.1.  Enzymatik Seite  24

2.4.2.  Restriktionsendonucleasen Seite  25

2.4.3.  Gelelektrophoretische Auftrennung der DNA Seite  26

2.4.4.  Der Bakteriophage Lambda Seite  27

2.4.5.  Restriktion und Gelelektrophorese von Phagen-DNA Seite  27

3.  Didaktische Analyse  

3.1.  Funktion und Lehrziele von (gentechnischen)  

  Experimenten im Biologieunterricht Seite  29

3.2.  Die Begriffe „Interesse“ und „Motivation“ Seite  35

3.3.  Charakterisierung der Lerngruppe Seite  37

3.4.  Bezug zum hessischen Lehrplan Seite  38

3.5.  Einordnung in die aktuelle Unterrichtsreihe Seite  39

3.6.  Referenzkriterien Seite  40

3.7.  Tabellarische Übersicht des geplanten Unterrichtsverlaufes Seite  43

4.  Methodische Analyse  

4.1.  Ziel der Evaluation Seite  46

4.2.  Verfahren der Datenerhebung Seite  47

4.2.1.  Testgütekriterien Seite  49

INHALTSVERZEICHNIS 3

4.2.2.  Fragebogen und Stichprobe Seite  50

4.3.  Auswertungsmethoden Seite  64

4.3.1.  Quantitative Auswertung der geschlossenen Items Seite  64

4.3.2.  Qualitative Auswertung der offenen Items Seite  65

4.3.3.  Auswertung der vor- und fachwissenbezogenen Items Seite  65

5.  Ergebnisse  

5.1.  Ergebnisse der quantitativen Items Seite  67

5.2.  Ergebnisse der qualitativen Items Seite  79

5.3.  Ergebnisse der vor- und fachwissenbezogenen Items Seite  87

6.  Diskussion und Reflexion  

6.1.  Interpretation und Diskussion der Ergebnisse der Untersuchung Seite  91

6.2.  Reflexion der Experimente Seite  102

7.  Zusammenfassung Seite  106

8.  Literaturverzeichnis Seite  107

9.  Abbildungsverzeichnis Seite  112

  Anhang  

EINLEITUNG 4

___________________________________________________________________________

1. Einleitung

In den folgenden Absätzen werden zunächst der Gegenstand der Arbeit sowie der Hintergrund der Fragestellung erläutert. Anschließend wird die Fragestellung selbst geklärt. Außerdem werden die Inhalte der einzelnen Kapitel kurz zusammengefasst.

Das Experiment ist zweifelsohne die Methode des naturwissenschaftlichen Unterrichts. In den Fächern Physik und Chemie ist der Stellenwert des Experiments verhältnismäßig hoch, wohingegen es im Fach Biologie im täglichen Unterrichtsgeschehen immer noch zu wenig Beachtung findet. Die Oberstufe und insbesondere der Leistungskurs sollen auf das spätere Hochschulstudium vorbereiten, daher ist es unumgänglich, die Schüler ¹ von Anfang an mit den Methoden der Wissenschaft vertraut zu machen. Die Oberstufe soll jedoch nicht ausschließlich in fachwissenschaftlicher Hinsicht auf das Universitätsstudium vorbereiten, sondern die Schüler zu selbstständigem Denken und Handeln erziehen.

Durch die Einführung von Bildungsstandards und einheitlichen Prüfungsanforderungen in der Abiturprüfung in Hessen nimmt die Forderung nach Methodenkompetenz und Selbstständigkeit der Schüler stetig zu. Im Gegensatz zum Grundkurs sollen die Schüler eines Leistungskurses die biologischen Sachverhalte verstärkt anhand von Experimenten oder anderen praktischen Übungen erlernen und die Aufgaben möglichst selbstständig bearbeiten. 2

Kaum ein anderes Themengebiet eignet sich besser, die Schüler zu selbstständig denkenden Persönlichkeiten zu erziehen als die Genetik. Dank der extremen Medienpräsenz und der intensiven politischen Diskussion über molekulargenetische Arbeitsmethoden werden die Schüler immer wieder mit dem Thema Gentechnik konfrontiert. Eine Stellungnahme zu Themen wie die Entschlüsselung des menschlichen Genoms oder DNA-Fingerprinting in der Kriminalistik ist jedoch kaum möglich ohne ein fundiertes Basiswissen, zu welchem zweifelsohne auch Kenntnisse über die entscheidenden Methoden der Molekulargenetik zählen. Viele der gentechnischen Methoden lassen sich nur unter hohem finanziellen, zeitlichen und technischen Aufwand durchführen, so dass in der Schule nur sehr selten entsprechende Experimente durchgeführt werden. Es existieren dennoch einige einfache Modellversuche, welche den Schülern in relativ wenigen Schulstunden die Methoden und Grundlagen der Gentechnik vermitteln können.

¹ In der gesamten Arbeit schließt die männliche Form „Schüler“ auch die weibliche Form mit ein, sofern dies nicht anders gekennzeichnet ist.

² vgl. Beschluss der Kultusministerkonferenz. EPA, S. 9.

EINLEITUNG 5

___________________________________________________________________________ Ziel dieser Arbeit ist es, drei verschiedene Experimente zur Gentechnik auf ihre Effektivität bezüglich des Lernzuwachses ³ zu prüfen. Diese drei Experimente sind:

N Isolation von DNA aus Zwiebeln / Tomaten / Bananen

N Regulation des Lactoseabbaus bei Escherichia coli

N Restriktion und Gelelektrophorese von Lambda-Phagen-DNA

Die zugrunde liegende Frage ist, ob die entsprechenden biologischen Sachinhalte und Methoden der Gentechnik durch Experimente von den Schülern besser verstanden werden als dies durch den rein theoretischen Unterricht möglich wäre. Die Experimente wurden zuvor an einem Wiesbadener Gymnasium in einem Biologie-Leistungskurs der Jahrgangsstufe 12 durchgeführt. Unmittelbar vor und nach den Experimenten wurde der Wissensstand der Schüler durch eine Befragung ermittelt. Als Methode der Befragung wurde ein selbst erstellter Fragebogen verwendet. Anhand der Befragung sollte festgestellt werden, ob der Wissensstand durch die Experimente erweitert werden konnte. Weiterhin sollten die Schüler in der Befragung ihre eigenen Lernfortschritte und ihren Lernzuwachs einschätzen, da die Selbsteinschätzung ein wichtiger Bestandteil des selbstständigen Denkens ist. Anhand dieser Arbeit soll er-forscht werden, inwieweit diese Fertigkeit bei den Schülern vorhanden ist. Die Ergebnisse bezüglich des Lernfortschrittes und der Selbsteinschätzung wurden zusätzlich auf geschlechtsspezifische Unterschiede untersucht. Letztlich wurden durch die Befragung auch Vorschläge zur Verbesserung der Experimente ermittelt. Anhand der Verbesserungsvorschläge der Schüler kann der Biologieunterricht für die Schüler attraktiver und erfolgreicher gestaltet werden.

Im folgenden Kapitel, die Sachanalyse, werden zunächst die theoretischen Sachinhalte beschrieben, die für die Durchführung und für das Verständnis der Versuche notwendig sind. Anschließend werden alle drei Versuche genauer sowie deren erwartetes Ergebnis dargestellt. Im darauf folgenden Kapitel, die didaktische Analyse, wird zunächst der Stellenwert von gentechnischen Experimenten im Biologieunterricht erörtert und anschließend folgt die methodische Ausarbeitung der Unterrichtseinheit. Diese beinhaltet die Charakterisierung der Lerngruppe, den Lehrplanbezug sowie die Einordnung in die aktuelle Unterrichtsreihe. Anschließend werden die Experimente in Bezug auf die Fach-, Schüler- und Gesellschaftsrelevanz erläutert und die Lehrziele definiert. Weiterhin werden in Kapitel drei die Inhalte der einzelnen Stunden strukturiert und eine tabellarische Übersicht über den geplanten Verlauf der Stunden aufgestellt.

³ Die Begriffe „Lernzuwachs“ und „Wissenszuwachs“ werden in der Arbeit synonym verwendet.

EINLEITUNG 6

___________________________________________________________________________ Kapitel vier behandelt die methodische Analyse, wobei zunächst das Ziel der Evaluation geklärt wird. Anschließend wird die Verfahrensweise der Untersuchung beschrieben. In diesem Abschnitt folgen außerdem die Konstruktion des Fragebogens sowie die Auswahl der Items. Der nächste Abschnitt des vierten Kapitels führt die Auswertungsmethoden der Befragung aus, wobei zwischen quantitativer Auswertung der geschlossenen Items, qualitativer Auswertung der offenen Items sowie der Auswertung der vor- und fachwissenbezogenen Items unterschieden wird.

Im fünften Kapitel werden die Ergebnisse der Untersuchung offen gelegt, wobei auch hier zwischen qualitativen, quantitativen und vor- und fachwissenbezogenen Items differenziert wird. In Kapitel sechs werden die Ergebnisse interpretiert. Hier werden auch die Versuchsergebnisse vorgestellt, wobei auch darauf eingegangen wird, welche Schwierigkeiten sich bei der Planung und Durchführung der Experimente ergeben haben und ob diese für die Schule empfehlenswert sind oder nicht.. In Kapitel sieben findet die Zusammenfassung der Untersu- chungsergebnisse statt.

SACHANALYSE 7

___________________________________________________________________________

2. Sachanalyse

Im folgenden Teil werden die Gentechnik an sich sowie die gängigen Methoden und Analyseverfahren beschrieben. Zusätzlich werden die theoretischen Sachinhalte dargestellt, auf welchen die drei Schulversuche basieren. Nach der Darstellung der Sachinhalte folgt die Beschreibung der Experimente mit Durchführung und erwarteten Ergebnissen.

2.1. Definition und Möglichkeiten von Gentechnik

Erst seit einer Entdeckung im Jahr 1974 wurde die Gentechnik überhaupt erst möglich. In diesem Jahr gelang es einer amerikanischen Forschergruppe um S. Cohen und A. Chang ein kleines DNA-Fragment eines Frosches in ein Plasmid des Bakterium Escherichia coli einzuschleusen, so dass sich die DNA des Frosches bei jeder Zellteilung des Bakteriums mitvermehrte. Plasmide sind ringförmige DNA-Fragmente, welche neben dem einzelnen Chromosom im Bakterium vorkommen. Die Forschergruppe entdeckte außerdem im Bakterium Restriktionsenzyme, welche die DNA an definierten Stellen zerschneiden können ⁴ .

Die Gentechnik ist aber nur aufgrund von zwei essentiellen Tatsachen möglich:

N „Der genetische Code ist bei allen Lebewesen gleichartig: Die Erbinformation ist als Abfolge von Nukleotiden, also von Bausteinen der Nucleinsäuren, gespeichert.

N Der Aufbau von Eiweißstoffen wird von Nukleinsäuren (DNA, RNA) gesteuert: Die Reihenfolge der Aminosäuren in einem Eiweißmolekül entspricht der Nukleotidsequenz eines bestimmten Nukleinsäureabschnittes.“ 5

Unter dem Begriff „Gentechnik“ versteht man die „gezielte Übertragung fremder Gene in den Genbestand einer Zelle bzw. eines Organismus“ ⁶ . Diese Genübertragung macht man sich vor allen Dingen in der Produktion von Medikamenten zu Nutze, allerdings auch in der Nutzpflanzenzüchtung. Mittels der Gentechnik lassen sich aber auch eine ganze Reihe genetisch bedingter Krankheiten genau untersuchen und frühzeitig erkennen. Nach wie vor ist das Human Genom Project eines der umfangreichsten Ziele der Gentechnik, wobei das gesamte menschliche Erbgut entschlüsselt werden soll.

Doch nicht nur in der Medizin spielt die Gentechnik mittlerweile eine große Rolle, auch in die Verbrechensbekämpfung und der Analyse von Vaterschaften hat die Gentechnik Einzug

⁴ vgl. Bayrhuber und Lucius: Handbuch Mikrobiologie. Band 2, 1997, S. 36.

⁵ Bayrhuber und Lucius: Handbuch Mikrobiologie, Band 2, 1997, S. 36.

⁶ Scharf und Scharf: Modellversuche, 2000, S. 36.

SACHANALYSE 8

___________________________________________________________________________ gehalten. Im Folgenden werden daher einige Möglichkeiten der Gentechnik genauer beschrieben.

Herstellung von Medikamenten

Das Bauchspeicheldrüsenhormon Insulin war eine der ersten Substanzen, die in großem Stil mit den gentechnischen Methoden hergestellt wurden. Insulin wird mittels gentechnisch umprogrammierten Bakterien gewonnen, welche auf die Herstellung des Proteins spezialisiert sind. Vor der gentechnischen Herstellung wurde Insulin aus der Pankreas von Schweinen oder Rindern gewonnen, jedoch kann das Insulin zum einen durch Keime verunreinigt sein und zum anderen unterscheidet sich das tierische Insulin leicht vom menschlichen Insulin, so dass es zu Abstoßungsreaktionen kommen kann ⁷ .

Das menschliche Insulingen wird mittels Restriktionsenzymen in das Plasmid von E.coli eingebaut. Das Insulinmolekül besteht aus zwei Polypeptidketten, die miteinander über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die Gene für beide Polypeptidketten werden in zwei unterschiedliche Bakterien eingebaut. Die Restriktionsenzyme der Bakterien müssen hierfür zuvor das Plasmid direkt nach dem -Galactosidase-Gen aufgeschnitten haben. Das Insulingen wird also mitten in das lac-Operon von E.coli inseriert. Das letzte Codon des - Galactosidase-Genscodiert für Methionin. Das Plasmid wird anschließend wieder in E.coli überführt, so dass E.coli neben den eigenen Genen auch das Insulingen abliest. Jedoch findet die Synthese von Insulin erst in Anwesenheit von Lactose statt, da nur dieses Substrat den bakteriellen Promotor aktivieren kann. Durch Zugabe von Bromcyan nach der Synthese können die beiden Polypeptidketten von der -Galactosidase getrennt werden, da Bromcyan Proteine nach Methionin spalten kann. Die beiden Ketten werden anschließend wieder verknüpft, indem Cystein-Reste miteinander reagieren. In einem Bioreaktor kann das Insulin in großer Menge hergestellt werden ⁸ .

Polymerasekettenreaktion

1983 wurde die PCR (polymerase chain reaction) von Karry Banks Mullis entwickelt und dient der in vitro Vervielfältigung winzigster, definierter DNA-Abschnitte. Nach Abschluss der PCR ist eine DNA-Analyse möglich.

Der Prozess gliedert sich in drei sich mehrfach wiederholende Zyklen: Denaturierung, Anlagerung der Primer (Annealing) und Polymerisierung. Für die Vervielfältigung wird eine

⁷ vgl. Baron et al.: Grüne Reihe, 2004, S. 114.

⁸ vgl. Gassen: Gentechnik, 1996, S. 233.

SACHANALYSE 9

___________________________________________________________________________ DNA-Polymerase benötigt, welche wiederum einen Primer benötigt, um einen Tochterstrang synthetisieren zu können. Bei der PCR werden beide Einzelstränge der DNA vervielfältigt, so dass für jeden Strang ein Primer benötigt wird. Die Anlagerungspunkte der Primer sind bekannt und werden so gewählt, dass „die Synthese der beiden Stränge gegenläufig erfolgt und somit der DNA-Bereich vervielfältigt wird, der zwischen den beiden Primern liegt“ ⁹ . Zusätzlich zu der DNA-Polymerase und den Primern müssen in die Vervielfältigungslösung noch die vier Desoxynukleotide hinzugegeben werden.

Im ersten Schritt, die Denaturierung, werden die beiden DNA-Stränge voneinander getrennt, indem der Reaktionsansatz auf ca. 90°C erhitzt wird. Im zweiten Schritt, das Annealing, lagern die Primer an die voneinander getrennten DNA-Stränge. Im dritten Schritt, die Synthese, findet die Polymerase-Reaktion statt, wobei die DNA-Polymerase die Desoxynukleotide komplementär zu den Matrizensträngen synthetisiert. Folgendes Schema zeigt die Zyklen der PCR:

Für alle drei Schritte werden unterschiedliche Temperaturen benötigt, so dass die PCR in einem Thermocycler stattfindet. In jedem Durchgang wird die Menge der DNA verdoppelt, so dass nach etwa 25 Zyklen die DNA-Menge um den Faktor 10 ⁶ oder 10 ⁷ vermehrt wurde. Da allerdings die Temperatur im Thermocycler stark schwankt und zum anderen zeitweise sehr hoch ist, um die DNA-Matrize zu denaturieren, wird eine thermostabile DNA-Polymerase be-

⁹ Munk: Genetik, 2001, S. 11-20.

SACHANALYSE 10

___________________________________________________________________________ nötigt. Man gewinnt sie aus dem Bakterium Thermus aquaticus, welches auch bei 95°C noch leben kann. Die aus dem Bakterium gewonnene Taq-Polymerase denaturiert folglich im ersten Schritt des Zyklus nicht.

Mittels der PCR lassen sich kleinste Mengen an DNA soweit vervielfältigen, dass eine Analyse möglich ist. Daher nutzt man die PCR für die Analyse von Erbkrankheiten oder für kriminalistische Untersuchungen ¹⁰ .

DNA-Fingerprinting / Vaterschaftstest

Durch das DNA-Fingerprinting lassen sich Personen eindeutig bestimmen. Im menschlichen Genom existieren bestimmte DNA-Bereiche, welche sich immer wieder wiederholen. Die Basensequenzen sind meist recht kurz, jedoch liegen sie in Tandem-Form aneinandergereiht vor. Man bezeichnet diese Bereiche als Mini-Satelliten-DNA, wobei sie sich in der Anzahl der Wiederholungen der Sequenzen von Person zu Person unterscheidet (variable number of tandem repeats, VNTR). Diese VNTRs werden für den DNA-Fingerprint verwendet ¹¹ .

Um eine Person eindeutig zu identifizieren, wird die DNA dieser Testperson mittels Restriktionsenzymen an beiden Seiten der VNTRs geschnitten und anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die VNTR-Fragmente können sichtbar gemacht werden, so dass sich für jede Person ein eindeutiges Bandenmuster im Elektrophoresegel ergibt.

Für den Vaterschaftstest werden die VNTR-Regionen von Mutter, Vater und Kind untersucht. Da das Kind je die Hälfte der eigenen VNTR-Regionen von Vater und Mutter erbt, müssen die Banden im Gel entweder der Mutter oder dem Vater zuzuordnen sein. Wenn die Banden des Kindes nicht der Mutter zugeordnet werden können, müssen sie vom Vater stammen und auf seinem Bandenmuster zu erkennen sein.

Gentherapie

Zwei Formen der Gentherapie werden heutzutage unterschieden: Die somatische Gentherapie und die Keimbahntherapie. In der Gentherapie wird therapeutisch wirksames genetisches Material in den Organismus eingeschleust, um dort gezielt Krankheiten heilen zu können.

Bei der somatischen Gentherapie werden Erbdefekte in Körperzellen behoben, ohne dass jedoch die genetisch übertragenen Gene mittels der Geschlechtszellen in die nächste Generation übertragen werden können. Bei dieser Form der Gentherapie werden gentechnisch veränderte Viren in den Körper eingeschleust. Diese Viren tragen das entsprechende Gen in ihrem Ge- ¹⁰ vgl.Munk: Genetik, 2001, S. 11-22.

¹¹ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 11-27.

SACHANALYSE 11

___________________________________________________________________________ nom, welches im Genom des Patienten defekt ist. Die Viren sollen ihr Genom in das Genom des Patienten einbauen und somit den Gendefekt ausgleichen. Jedoch ist dies Methode äußerst riskant, da noch nicht sichergestellt werden kann, dass die Viren ihr Genom an der richtigen Stelle des Genoms des Patienten einbauen und nicht ein intaktes Gen beim Einbau zerstören. Nicht zuletzt sind an einer genetisch bedingten Krankheit auch unkontrollierbare Umweltfak-toren beteiligt, sowie meist mehrere defekte Gene ¹² .

Bei der Keimbahntherapie können alle Nachkommen von erbkranken Menschen von den Gendefekten befreit werden ¹³ . Diese Form der Therapie ermöglicht es, rekombinierte DNA in einen Embryo einzuschleusen und diesen Embryo anschließend der Mutter einzusetzen. Es ist damit sichergestellt, dass der Embryo keinesfalls an einem Gendefekt leidet. Die Keimbahntherapie kommt daher in der Präimplantationsdiagnostik zum Tragen, wobei der Embryo in vitro auf mögliche Gendefekte untersucht wird und im Zweifelsfall entsprechend behandelt bzw. „verworfen“ wird ¹⁴ .

Die Keimbahntherapie ist in Deutschland allerdings verboten. Seit 1991 existiert das Embryonenschutzgesetz, welches die missbräuchliche Erzeugung und Anwendung von Embryonen verbietet. Das Gesetz soll verhindern, dass sich mehr Embryonen in vitro entwickeln können, als für eine Schwangerschaft von derjenigen Frau gewünscht werden, von welcher die Eizelle stammt. Sämtliche Fortpflanzungstechniken dürfen nur dann angewendet werden, wenn diese eine Schwangerschaft der Eizellenspenderin herbeiführen sollen ¹⁵ .

2.2. Theorie zu Versuch 1

2.2.1. Aufbau von DNA und RNA

Die DNA - Desoxyribonucleinsäure - ist „diejenige Substanz, in der in den meisten Organismen die Erbinformationen codiert sind, die bei jeder Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben werden. Sie ist damit für die Struktur und alle physiologischen und biochemischen Charakteristika fast aller lebenden Organismen verantwortlich.“ ¹⁶ .

Die Grundbausteine der DNA und RNA sind Nucleotide, welche gemeinsam ein hochmolekulares Polymer bilden ¹⁷ . Die Nucleotide bestehen aus einem Zucker (eine fünfgliedrige, ringförmige Pentose), einem Phosphatrest und einer Base. Die Verbindung aus Pentose und Phos-

¹² vgl.Kattmann: Schöne neue Welt, 2004, S. 7.

¹³ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 11-36.

¹⁴ vgl. Hößle: Präimplantationsdiagnostik, 2003, S. 6.

¹⁵ vgl. Hößle, Präimplantationsdiagnostik, 2003, S. 6.

¹⁶ Ibelgaufts: Gentechnologie von A bis Z, 1990, S. 137.

¹⁷ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 1-4.

SACHANALYSE 12

___________________________________________________________________________ phatrest bezeichnet man als Nucleosid, die Verbindung von Nucleosid mit einer Base bezeichnet man als Nucleotid.

Die Pentose der DNA ist Ribose, welche an Kohlenstoffatom Position 2’ anstatt einer Hydroxylgruppe ein Wasserstoffatom trägt, daher der Name Desoxyribose. Die Basen sind über eine N-glykosidische Bindung kovalent mit der Desoxyribose an Position 1’ verbunden. An Position 5’ ist die Desoxyribose mit der Phosphatgruppe mittels Phosphodiesterbrücken ¹⁸ verestert. Man unterscheidet die Basen in zwei verschiedene Gruppen: Die Pyrimidinbasen Cytosin und Thymin bestehen aus einem 6-gliedrigen Ringsystem. Die Purinbasen Adenin und Guanin bestehen aus zwei sich überlappenden Ringsystemen mit fünf, bzw. sechs Gliedern.

Die Desoxyribose und die Phosphatreste bilden das Rückgrat der DNA, wobei sich der Zucker und der Phosphatrest jeweils abwechseln. Durch diese Abwechslung unterscheiden sich die Enden des Rückgrates. Am einen Ende liegt das freie 3’-Kohlenstoffatom des Zuckers, am anderen Ende das freie 5’-Kohlenstoffatom des Zuckers, daher spricht man auch von 3’- oder 5’-Ende der DNA.

In der DNA paaren jeweils eine Pyrimidin- und eine Purinbase miteinander, so dass ein komplementärer Doppelstrang gebildet wird. Dieser komplementäre Strang ist in der entgegen gesetzten, oder antiparallelen Richtung orientiert. Die Basenpaarung kommt durch Wasserstoffbrückenbindungen zustande, wobei Adenin mit Thymin paart und Cytosin mit Guanin. Zwischen Adenin und Thymin bestehen zwei Wasserstoffbrückenbindungen, zwischen Cytosin und Guanin drei, siehe auch Abbildung 2.

¹⁸ vgl. Löffler: Basiswissen Biochemie, 2001, S. 327.

SACHANALYSE 13

___________________________________________________________________________

Durch die Basensequenz eines Stranges ist folglich die Basensequenz des anderen Stranges festgelegt. Die Menge an Adenin im einen Strang stimmt mit der Menge an Thymin im anderen Strang überein. Genauso verhält es sich mit Cytosin und Guanin. Diese Beziehung wird als Chargaff-Regel bezeichnet. Anhand von Adenin-Thymin, bzw. Guanin-Cytosin-Gehalt lassen sich Organismen und Viren klassifizieren, da dieser Gehalt innerhalb der verschiedenen Gruppen variiert.

Zwischen den Basen eines Stranges herrschen stacking forces oder stacking interactions und somit formt sich die DNA zu einer Helix. Diese stacking forces oder stacking interactions bezeichnen Kräfte, welche die hydrophoben Basen eng beieinander liegen lassen, da dies der energetisch günstigste Zustand für die Basen ist ¹⁹ . Die DNA ist eine rechtsgängige Doppelhe-

lix von etwa 2 nm Durchmesser. In der DNA-Doppelhelix sind weiterhin eine große und eine kleine Furche zu erkennen, in welche sich mit der DNA interagierende Substanzen setzen können, beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe. Unter natürlichen Bedingungen und unter physiologischen Ionenkonzentrationen nimmt die DNA in der Zelle eine Konformation ein, welche als B-DNA bezeichnet wird ²⁰ . In jeder Windung der Doppelhelix befinden sich 10,5 Ba-

senpaare, wobei eine Windung etwa 3,4 nm lang ist. Auch die Zahl der Basenpaare ist ein

¹⁹ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 1-9.

²⁰ vgl. Ibelgaufts: Gentechnologie von A bis Z, 1990, S. 141.

SACHANALYSE 14

___________________________________________________________________________ Klassifizierungsmerkmal für die Organismengruppen. Die Anzahl der Basenpaare gibt gleichzeitig die Genomgröße eines Organismus an.

Die Pentose der RNA ist auch Ribose, jedoch trägt sie an Position 2’ des Zuckers eine Hydroxylgruppe. Bei der RNA wird statt Thymin Uracil als Base verwendet, es unterscheidet sich von Thymin durch das Fehlen einer Methylgruppe in Position 5’. Im Gegensatz zur DNA ist RNA einzelstränging und bildet keine Basenpaarungen aus.

2.2.2. Replikation von DNA

Die Replikation ist die identische Selbstverdopplung der DNA und findet semikonservativ, semidiskontinuierlich und simultan statt ²¹ . An der Replikation ist ein Multienzymkomplex beteiligt, welcher in eine bestimmte Richtung arbeitet. Dieser Komplex kann einen bereits vor-handenen DNA-Strang verlängern, ihn aber nicht neu starten. Da die beiden DNA-Stränge antiparallel zueinander liegen, findet die Synthese der Tochterstränge nicht in gleicher Weise statt.

Die für die Replikation benötigten Enzyme in dem Multienzymkomplex sind die DNA-Helicase, die DNA-Topoisomerase, die Primase, die DNA-Ligase und die DNA-Polymerase. Die DNA-Helicase ist verantwortlich für die Entwindung der DNA-Doppelhelix. Unter ATP-Verbrauch kann sie die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen spalten, so dass zwei DNA-Einzelstränge entstehen. Die DNA-Topoisomerase kann die Windung der Doppelhelix verändern. Die Primase kann ohne ein freies 3’OH-Ende auf der DNA-Matrize Primer synthetisieren, so dass an den Enden der Primer freie 3’OH-Enden entstehen, an welchen die DNA-Polymerase anknüpfen kann. Die DNA-Polymerase ist für die Synthese des Tochterstranges zuständig. Sie hängt dabei Einzelnucleotide an das freie 3’OH-Ende des Primers an. Die DNA-Ligase verknüpft anschließend die neu synthetisierten DNA-Abschnitte zu langen Ketten.

Die Replikation lässt sich in drei Phasen einteilen. In der Initiationsphase wird der Replikationsursprung (Origin-Region) von einem Initiatorprotein erkannt. Die Origin-Region besteht meist aus einer Adenin-/Thymin-reichen Basensequenz, welche leicht von dem Initiatorprotein erkannt werden kann, da zwischen Adenin und Thymin nur zwei Wasserstoffbrückenbindungen bestehen und sich diese Region somit leicht öffnen lässt. An der Origin-Region beginnt die DNA-Helicase den Doppelstrang aufzutrennen und die Primase stellt eine kurze RNA-Sequenz als Primer her. Der Primer wird im Anschluss an die Replikation abgebaut und

²¹ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 3-1

SACHANALYSE 15

___________________________________________________________________________ durch DNA-Sequenzen ersetzt. An den Primer kann die DNA-Polymerase ansetzen, jedoch nur in 3’-5’-Richtung der DNA-Matrize verlängern. In der Elongationsphase polymerisiert die DNA-Polymerase Stück für Stück den Tochterstrang der DNA-Matrize. Da die Polymerase jedoch nur in 3’-5’-Richtung arbeiten kann, müssen für den antiparallelen DNA-Strang von der Primase mehrere Primer hergestellt werden. Der erste Primer lagert am ersten Okazaki-Fragment (siehe Abbildung 3) des Folgestranges an, die DNA-Polymerase kann nun den Tochterstrang soweit synthetisieren, bis sie am Primer des zuvor synthetisierten Okazaki-Fragments angelangt. Die Primase synthetisiert nun einen neuen Primer, welcher sich auf der Höhe des neu synthetisierten Stranges vom Leitstrang befindet. Die DNA-Polymerase kann wieder an diesen Primer anknüpfen und den Tochterstrang bis zu dem Primer des zuvor synthetisierten Okazaki-Fragmentes verlängern. Die einzelnen Okazaki-Fragmente werden anschließend von der DNA-Ligase miteinander verbunden ²² . Das folgende Schema zeigt die Elongationsphase der DNA-Replikation:

Die Replikation endet am Terminator in der Terminationsphase. Der Terminator ist die Bindungsstelle eines Terminationsproteins, welches die Helicase stoppen kann. Somit wird ein weiteres Öffnen der DNA-Doppelhelix verhindert ²³ .

Durch die relativ hohe Replikationsgeschwindigkeit der DNA-Polymerase von mehreren hundert Nucleotiden pro Sekunde können von Zeit zu Zeit falsche Nucleotide eingebaut werden. Im Anschluss an die Replikation findet daher das Proofreading statt, wobei eine Exonuclease falsche Basenpaarungen erkennt, die falsche Base entfernt und sie durch die richtige Base er-

²² vgl.Munk: Genetik, 2001; S. 3-8.

²³ vgl. Munk: Genetik, 2001: S. 3-9.

SACHANALYSE 16

___________________________________________________________________________ setzt. Diese Exonuclease arbeitet in 3’ - 5’-Richtung. Durch das Proofreading kann die Fehlerrate der Replikation von 10 ^-4 auf 10 ^-9 verringert werden. Diese restlichen Replikationsfehler können zu Mutationen führen. 24

2.2.3. Isolation von DNA aus eukaryontischen Zellen

DNA lässt sich aus eukaryontischen Zellen mit nahezu gleicher Methode isolieren wie aus prokaryontischen Zellen ²⁵ . Für den Versuch werden Zwiebeln Tomaten und Bananen verwendet.

Die Isolation selbst verläuft in zwei Teilschritten: Zunächst muss die Zelle „aufgeschlossen“ werden, im nächsten Schritt wird die DNA von Proteinen und anderen Makromolekülen getrennt. Die Zwiebeln, die Tomaten oder die Bananen werden zunächst grob zerkleinert. Anschließend müssen die Cytoplasmamembranen zerstört werden. Da Membranen aufgrund der Lipidstruktur nicht wasserlöslich sind, muss ein Detergens diese Löslichkeit herstellen. Ein Detergens hat ähnliche Eigenschaften wie die Lipide in der Zellmembran. Es besteht gleichermaßen aus einem polaren, hydrophilen Kopfteil und einem unpolaren, lipophilen Schwanzteil. Das Detergens lagert sich um die Lipide der Zellwand herum an, so dass Micellen entstehen und somit die Zellmembran zerstört wird. Als Detergens kann entweder Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet werden, oder wesentlich billigeres Spülmittel.

Bayrhuber und Lucius schlagen vor, direkt nach Aufschluss durch das Detergens die Lösung mit Ethanol zu überschütten, jedoch kann die DNA noch weiter von Zellresten gereinigt werden. Zu dem Spülmittel wird noch Salz hinzugegeben, um die Löslichkeit der DNA zu erhöhen. Das Salz ermöglicht die Präzipitation hochmolekularer DNA ²⁶ . Durch die Behandlung mit dem Salz tritt der Effekt der Plasmolyse ein. Das Wasser tritt aus der Zelle aus und somit können die Zellen leichter zerstört werden, da der dämpfende Schutz durch das Wasser entfällt. Anschließend wird die zerkleinerte Zwiebel oder Tomate in einem Becherglas für 15 Minuten in ein 60°C heißes Wasserbad gestellt, wobei sämtliche DNAsen und die Reste der Zellmembranen zerstört werden. Da das Enzym DNAse ein Protein ist, denaturiert dieses irreversibel durch Einwirkung von Hitze. Nach dem Wasserbad muss das Becherglas gekühlt werden, damit die DNA nicht auch zerstört wird.

Nach dem Abkühlen wird die Mischung im Mörser zerkleinert, gefiltert und Feinwaschmittel hinzugegeben. Das Feinwaschmittel enthält Proteasen und Amylasen, welche die übrigen

²⁴ vgl. Munk: Genetik, 2001: S. 3-8.

²⁵ vgl. Bayrhuber und Lucius: Handbuch Mikrobiologie, Band 3, 1997, S. 102.

²⁶ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 11-1.

SACHANALYSE 17

___________________________________________________________________________ Zellreste zerstören. Die DNA sollte nun soweit isoliert sein, dass die Lösung mit kaltem Ethanol überschüttet werden kann. Das Ethanol trennt die DNA von den übrig gebliebenen Zellresten und setzt sich als klare Phase über der Zellreste-enthaltenen-Phase ab. Der Alkohol entzieht der DNA Wasser und macht sie somit unlöslich. Daher fällt die DNA in der Alkoholphase aus. Nach kurzer Zeit ist in der oberen Phase die DNA als weißliche Schlieren zu erkennen, die mit einem Holzstab aufgenommen werden können.

In einschlägiger Literatur sowie im Internet finden sich zahlreiche Anleitungen zur Isolation von DNA aus eukaryontischen Zellen. Das Extrakt muss nicht notwendigerweise erhitzt und wieder abgekühlt werden, auch die Zugabe von Waschmittel ist fakultativ. In der vorliegenden Untersuchung führen die Schüler beide Varianten durch. Eine Gruppe erhitzt das Extrakt und reinigt es mit Waschmittel, die andere Gruppe verzichtet auf Erhitzen und Reinigen. Die Anleitungen für beide Versuchsvarianten finden sich im Anhang.

2.3. Theorie zu Versuch 2

2.3.1. Das Bakterium Escherichia coli

Obwohl das Darmbakterium Escherichia coli schon 1885 entdeckt wurde, ist es eines der wichtigsten Vertreter der Bakterien für die Genetik. Das Bakterium teilt sich sehr schnell, die Generationszeit beträgt lediglich 20-30 min, so dass bei einer Inkubation über Nacht eine Bakteriendichte von 10 ¹⁰ Bakterien pro ml Kulturmedium erreicht werden kann.

E.coli ist ein gram-negatives Eubakterium mit einer dünnen Zellwand aus Murein, dem Mureinsacculus. Die Zellwand besteht aus einer Lipiddoppelschicht, das Cytoplasma des Bakteriums ist nicht kompartimentiert. An der Innenseite der Lipiddoppelschicht befindet sich die ringförmige, haploide Doppelhelix des Bakteriums. Der Teil des unkompartimentierten Cytoplasmas, in welchem sich das Chromosom des Bakteriums befindet, bezeichnet man als Nucleoid. Hier finden RNA- und Proteinsynthese fast gleichzeitig statt. Zusätzlich zu dem Nucleoid enthält E.coli häufig Bakteriophagen und Plasmide ²⁷ .

2.3.2. Proteinbiosynthese

Der Bauplan für sämtliche Proteine ist in Form von Genen auf der DNA gespeichert. Während der Proteinbiosynthese werden diese Informationen zu Proteinen übersetzt. Die Synthese teilt sich bei Eukaryonten in zwei zeitlich und räumlich voneinander getrennte Schritte: die

²⁷ vgl. Seyffert: Lehrbuch der Genetik, 2003, S. 931.

SACHANALYSE 18

___________________________________________________________________________ Transkription und die Translation ²⁸ . Die Transkription findet im Zellkern statt, die Translation

anschließend im Cytoplasma. Bei Prokaryonten finden Transkription und Translation hingegen gleichzeitig im Cytoplasma statt, da Prokaryonten keinen echten Zellkern besitzen.

In einem Gen auf der DNA sind die Informationen für ein Peptid enthalten ²⁹ . Die Informatio-

nen für ein Peptid sind mittels eines Codes auf der DNA festgelegt. Dieser Code besteht aus den vier Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Jeweils drei aufeinander folgende Basentripletts bilden ein so genanntes „Codon“, so dass für alle 20 Aminosäuren mindestens eine Basensequenz existiert. Anhand folgender Code-Sonne wird deutlich, dass mehr als 20 Codons für die Aminosäuren codieren, so dass für alle Aminosäuren mindestens zwei Codons zur Verfügung stehen. Dieses Phänomen bezeichnet man als degenerierten Code ³⁰ .

Für die Proteinbiosynthese werden zwei verschiedene Sorten an RNA benötigt: Die messenger-RNA (mRNA) sorgt für die Übermittlung der Baupläne der Proteine von Zellkern in das Cytoplasma zu den Ribosomen und die verschiedenen transfer-RNAs (tRNA) liefern die Aminosäuren zu den Ribosomen. Die tRNA hat eine besondere Form: die Kleeblattform ³¹ . Sie

hat mit der Anticodonschleife und dem Aminosäureakzeptorarm zwei charakterisische Domänen. Das 3’-Ende der tRNA trägt immer die Basensequenz ACC und das 3’-Hydroxylende ist frei. An diesem 3’-OH-Ende kann eine Aminosäure angelagert werden. Der Anticodonarm trägt diejenigen Basen, welche zu den Basen der mRNA komplementär sind und für die entsprechende Aminosäure codieren. Die tRNA ist der Mittler zwischen der mRNA und dem Protein und besitzt eine eigene Spezifität: pro Codon existiert nur eine tRNA. Die meisten Aminosäuren werden bereits durch die ersten beiden Basen des Codons eindeutig codiert, so

²⁸ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 5-13.

²⁹ vgl. Löffler: Basiswissen Biochemie, 2001, S. 387.

³⁰ vgl. Löffler: Basiswissen Biochemie, 2001, S. 388.

³¹ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 5-5.

SACHANALYSE 19

___________________________________________________________________________ dass die dritte Base des Codons variabel ist, also. „wobbeln“ kann. ³² Die einzelnen Amino-

säuren werden auf den Aminosäureakzeptorarm der tRNA geladen, indem das Enzym Aminoacyl-tRNA-Synthetase folgende Reaktion katalysiert: Die Carboxylgruppe der Aminosäure reagiert mit ATP, wobei unter Abspaltung von Pyrophosphat Aminoacyl-AMP entsteht. Dieses Aminoacyl-AMP bildet zusammen mit der Carboxylgruppe der Aminosäure ein Säureanhydrid. Die Aminosäure ist nunmehr aktiviert, so dass unter Abspaltung von AMP das Säureanhydrid an der Carboxylgruppe mit der 3’-OH-Gruppe der Ribose der tRNA verestert. 33

In der ersten Phase der Proteinbiosynthese, die Transkription, wird eine bestimmte Sequenz der DNA in eine mRNA-Sequenz umgeschrieben. Mittels RNA-Polymerase wird zu einem Strang der DNA ein codogener mRNA-Strang gebildet. Die Doppelhelix der DNA wird zunächst entwunden und die Wasserstoffbrücken aufgetrennt. Die RNA-Polymerase bindet an eine Promotorregion der DNA und läuft vom 3’-Ende der DNA in Richtung des 5’-Endes. Dieser 3’-5’-Strang wird als Matrizenstrang oder codogener Strang bezeichnet. Der andere 5’-3’-Strang der DNA wird als codierender Strang bezeichnet, da die Basensequenz auf diesem Strang der Basensequenz auf der mRNA entspricht und bei der Angabe von Nucleotidsequenzen angegeben wird. ³⁴ Die Synthese von mRNA verläuft vom 5’-Ende in Richtung des 3’-

Endes. Die RNA-Polymerase liest den DNA-Matrizenstrang ab, und baut für jede Base die komplementäre Base auf der mRNA ein. Der bereits synthetisierte Teil der mRNA löst sich anschließend von der DNA-Matrize und diese geht wieder ihre helikale Struktur ein ³⁵ . Die

Transkription kann in drei Schritte eingeteilt werden: die Initiation (Beginn der Transkription), die Elongation (RNA-Synthesephase) und die Termination (Abschluss der Transkription).

³² vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 5-6.

³³ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 5-8.

³⁴ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 4-2.

³⁵ vgl. Gassen: Gentechnik, 1996, S. 69.

SACHANALYSE 20

___________________________________________________________________________ Im Anschluss an die Transkription findet bei Eukaryonten die so genannte Modifikation oder Processing der mRNA statt, wobei ein Poly(A)-Schwanz an das 3’-Ende der mRNA angefügt wird, das Splicing der mRNA stattfindet und an das 5’-Ende der mRNA eine Kappe angefügt wird (capping). Jedoch finden das Splicing und das Capping nur bei Eukaryonten statt. Der Poly(A)-Schwanz reguliert die Lebensdauer der mRNA. Das Splicing der mRNA findet hauptsächlich bei Eukaryonten statt, wobei nicht-codierende Abschnitte auf der mRNA (Introns) herausgeschnitten werden. Die codierenden Abschnitte (Exons) werden anschließend von Ligasen miteinander verbunden. Die Kappe dient zum einen zum Schutz der mRNA und zum anderen als Exportsignal, da die fertige mRNA aus dem Zellkern in das Cytoplasma transportiert werden muss.

Die zweite Phase der Proteinbiosynthese, die Translation, stellt die eigentliche Synthesephase dar. In dieser Phase werden Aminosäuren zu Polypeptiden miteinander verbunden. Nachdem die prozessierte mRNA im Cytoplasma angekommen ist, heften sich Ribosomen an die mRNA. Ribosomen sind im Cytoplasma dissoziiert und bestehen bei Eukaryonten aus einer 40S und einer 60S-Untereinheit. Zusammen bilden diese Untereinheiten ein 80S-Ribosom. Ein Ribosom hat drei ³⁶ Bindestellen: die Peptidyl-tRNA-Stelle (P-Stelle), die AminoacyltRNA-Stelle (A-Stelle) und die Exit-Stelle (E-Stelle). ³⁷ Diese Bindestellen können jeweils an ein Codon auf der mRNA binden. Zu Beginn der Translation befindet sich das Startcodon AUG der mRNA in der A-Stelle des Ribosoms, in der P-Stelle sitzt das auf das Startcodon folgende Codon der mRNA. Auch die Translation ist in drei Schritte eingeteilt, welche die gleiche Bezeichnung haben wie die Schritte der Transkription. In der Initiationsphase bindet die tRNA an das Startcodon der mRNA (AUG). Diese erste tRNA trägt meist die Aminosäure Methionin oder ein Methionin-Derivat, weiterhin kann die erste tRNA als einzige an die kleine Untereinheit des Ribosoms binden, ohne dass das Ribosom schon in große und kleine Untereinheit assoziiert ist. Der Komplex aus kleiner Untereinheit, tRNA und Initiationsfaktoren bindet an das 5’-Ende der mRNA, welcher aufgrund der Kappe erkannt werden kann. Anschließend wandert der Komplex in 5’-3’-Richtung auf der mRNA entlang, bis das Codon AUG gefunden wird, erst dann tritt die große Untereinheit des Ribosoms hinzu und die drei Bindestellen können besetzt werden. In der Elongationsphase wandert das Ribosom jeweils ein Codon weiter, so dass das Codon, welches sich in der A-Stelle befand, in die P-Stelle wandert und die A-Stelle wieder frei für ein neues Codon wird. Hinter der P-Stelle des Ribosoms befindet sich die E-Stelle, welche von tRNAs besetzt wird, die bereits ihre Aminosäuren

³⁶ Möglicherweise haben Ribosomen noch eine vierte Bindungsstelle, dies ist jedoch noch nicht eindeutig geklärt.

³⁷ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 5-14.

SACHANALYSE 21

___________________________________________________________________________ abgeladen haben. Weitere Aminosäuren werden mittels der entsprechenden tRNA eingebaut und an das bereits synthetisierte Polypeptid angehängt. Das Enzym Peptidyltransferase katalysiert diese Reaktion. Der Peptidylrest, welcher sich an der in der P-Stelle sitzenden tRNA befindet, wird abgespalten und an den Aminoacylrest übertragen, welcher sich an der in der A-Stelle sitzenden tRNA befindet. Als Termination der Translation dient ein Stoppcodon, für welches keine passende tRNA zur Verfügung steht und daher die Verlängerung des Polypeptides abgebrochen wird. In die A-Stelle des Ribosoms setzen sich Release-Faktoren, welche bewirken, dass die Peptidyltransferase ein Wassermolekül statt der Aminoacyl-tRNA aktiviert. Das Wassermolekül spaltet die Bindung zwischen Peptid und tRNA hydrolytisch und gibt somit das fertige Peptid frei. Anschließend dissoziiert die mRNA vom Ribosom und dieses zerfällt in die beiden Untereinheiten. 38

2.3.3. Das Operon-Modell

Erstmals in den 50er Jahren des vergangenen Jahrhunderts für den Abbau von Lactose bei E.coli entdeckt, hat das Operon-Modell bis heute seine Gültigkeit nicht verloren und konnte auf zahlreiche weitere Gene erweitert werden ³⁹ . Ein Operon ist die „Bezeichnung für eine in prokaryontischen Genen vorkommende, genetische Einheit, die für die Synthese mehrerer induzierbarer Enzyme verantwortlich ist.“ ⁴⁰ .

Zu der Funktionseinheit Operon zählen der Operator, die Strukturgene, der Promotor und der Repressor. Der Operator ist derjenige Bestandteil der DNA, welcher von einem Regulatorprotein erkannt und gebunden werden kann. Wenn das Regulatorprotein gebunden ist, kann die Transkription nicht durchgeführt werden. Dieses Regulatorprotein kann ein Repressor sein, welcher spezifisch an einen Operator bindet.

Da es zwei verschiedene Formen des Operons gibt, werden diese anhand von Beispielen im folgenden Abschnitt erläutert.

Substratinduktion

Das typische Beispiel für ein Substrat induziertes Operon ist das Lactose-Operon bei E.coli. Das Lactose-Operon von E.coli ist wie folgt aufgebaut: der Operator steuert die Tätigkeit der Strukturgene, an ihn können Repressormoleküle binden. An den Promotor lagert sich die DNA-Polymerase an, welche anschließend die Strukturgene abliest. Diese Strukturgene sind

³⁸ vgl. Seyffert: Lehrbuch der Genetik, 2003, S. 81.

³⁹ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 10-7.

⁴⁰ Ibelgaufts: Gentechnologie von A bis Z, 1990, S. 360.

SACHANALYSE 22

___________________________________________________________________________ lacY, welches für das Enzym Permease codiert. Die Permease steuert den Transport der Lactose vom Außenmedium durch die Zellwand. Das Gen lacZ codiert für das Enzym - Galactosidase,welches die Lactose in Glucose und Galactose spaltet. Das dritte und letzte Gen lacA codiert für das Enzym Transacetylase, welches der Entgiftung bestimmter Galaktoside dient. Für die Synthese des Repressors wird das Gen lacI benötigt, welches allerdings nicht in unmittelbarer Nähe der drei Strukturgene liegen muss.

In Abwesenheit von Lactose bindet der Repressor an den Operator, so dass die Strukturgene nicht permanent abgelesen werden und somit keine -Galactosidase gebildet wird. Ist Lactose anwesend, so bindet diese an den Repressor, welcher wiederum eine Konformationsänderung durchmacht und sich vom Operator löst. Die Strukturgene können folglich abgelesen werden, -Galactosidase kann gebildet werden und die Lactose kann abgebaut werden.

Die Enzyme des Lactose-Operons sind induzierbare Enzyme, da ihre Synthese durch Lactose gefördert wird ⁴¹ . Da bei dieser Operon-Form das Substrat selbst als Induktor für das Ablesen der Strukturgene gilt, spricht man von Substratinduktion.

Endproduktrepression

Das typische Beispiel für die Endproduktrepression ist das Tryptophan-Operon bei E. coli. Im Gegensatz zu dem lac-Operon besteht das trp-Operon aus einer Promotorregion mit anschließendem Operator und fünf Strukturgenen. In entgegen gesetzter Richtung zum Operator liegt das trpR-Gen, welches für den Repressor codiert. Das trpR-Gen synthetisiert einen inaktiven Repressor oder Aporepressor, welcher durch die Bindung mit Tryptophan aktiviert wird. Aus diesem Grund wird Tryptophan in diesem Zusammenhang als Corepressor bezeichnet, da erst im Zusammenspiel von Aporepressor und Corepressor eine Bindung an den Operator ermöglicht wird.

Die Strukturgene des trp-Operons codieren für Enzyme des Tryptophanstoffwechsels, mit deren Hilfe anschließend aus mehreren Vorstufen Tryptophan synthetisiert werden kann. Tryptophan heftet sich anschließend an den Aporepressor, aktiviert ihn und blockiert somit die Synthese von noch mehr Tryptophan. Die Enzyme, welche im Tryptophan-Operon gebildet werden, werden auch als reprimierbare Enzyme ⁴² bezeichnet, da ihre eigene Synthese durch das Endprodukt der Synthesekette blockiert wird. Aus diesem Grund spricht man von Endproduktrepression.

⁴¹ vgl. Campbell: Biologie, 1998, S. 324.

⁴² vgl. Campbell: Biologie, 1998, S. 324.

SACHANALYSE 23

___________________________________________________________________________ Anhand folgenden Schemas wird das Prinzip von Substratinduktion und Endproduktrepression deutlich. Der obere Teil A zeigt das lac-Operon als Beispiel für Substratinduktion, der untere Teil B zeigt das trp-Operon als Beispiel für Endproduktrepression:

2.3.4. Regulation des Lactoseabbaus bei Escherichia coli

Für den Versuch werden drei verschiedene E.coli-Stämme verwendet ⁴³ . Ein Wildtyp-Stamm, ein Stamm mit einer Mutation im lacZ-Gen, welcher keine -Galactosidase synthetisieren kann und ein Stamm mit einer Mutation im lacI-Gen, welcher einen defekten Repressor des Lactose-Operons bildet. Alle drei Stämme werden auf Nährböden mit und ohne Lactose angezogen. Auf den Nährböden mit Lactose wird die Transkription der Strukturgene des Operons induziert, dessen Aktivität anhand der Anwesenheit von -Galactosidase nachgewiesen wird. Für den Enzymnachweis dient das Substrat o-Nitrophenyl--D-galaktopyranosid (ONPG). ONPG-Lösungen sind farblos, färben sich jedoch intensiv gelb in Anwesenheit von - Galactosidase.Das Enzym spaltet ONPG in Galaktose und gelb gefärbtes Nitrophenolat. Tritt also die gelbe Färbung der Lösung auf, ist -Galactosidase vorhanden und somit wurde auch das Lactose-Operon induziert.

Für diesen Versuch ist daher folgendes Versuchsergebnis zu erwarten: Bei dem Wildtyp-Stamm wird das Lactose-Operon auf dem Nährboden mit Lactose induziert, daher sollte in dieser Lösung eine gelbe Färbung zu erwarten sein. Auf dem Nährboden ohne Lactose entsteht entsprechend keine gelbe Färbung. Bei dem Stamm mit einer Mutation im lacZ-Gen kann keine -Galactosidase gebildet werden, so dass die Lösungen beider Nährböden weißlich bleiben. Bei dem Stammt mit einer Mutation im lacI-Gen kann kein funktionstüchtiger

⁴³ vgl. Bayrhuber und Lucius: Handbuch Mikrobiologie, Band 3, 1997, S. 128.

SACHANALYSE 24

___________________________________________________________________________ Repressor gebildet werden, so dass das Operon nicht gehemmt werden kann. Die Synthese von -Galactosidase findet ständig statt und daher sind die Lösungen von beiden Nährböden gelb gefärbt. Die genaue Anleitung des Versuchs findet sich im Anhang.

2.4. Theorie zu Versuch 3

2.4.1. Enzymatik

Alle Reaktionen, die in einem Organismus ablaufen, werden von Enzymen katalysiert. Enzyme sind somit Katalysatoren des Lebens ⁴⁴ . Sie sind spezifisch wirkende Proteine, die die Aktivierungsenergie herabsetzen und somit die Reaktionen beschleunigen.

Eine exergone Reaktion A : B könnte nur dann unkatalysiert stattfinden, wenn die Umgebungstemperatur erhöht wird, da die Moleküle A in einen aktivierten und reaktionsfähigen Zustand überführt werden müssen ⁴⁵ . Bei einer niedrigen Temperatur befinden sich nur einige wenige Moleküle A auf einem höheren energetischen Niveau und die Umsetzung A : B verläuft nur langsam. Erhöht man allerdings die Temperatur, so werden mehr Moleküle A aktiviert und die Reaktionsgeschwindigkeit nimmt zu. Enzyme vermögen diese Reaktion zu katalysieren, ohne dass die Temperatur erhöht werden muss.

Enzyme wirken substrat- und wirkungsspezifisch, das heißt sie setzen nur eine einzige Verbindung um und katalysieren nur eine einzige Reaktion. Die Umsetzung der Substrate erfolgt am aktiven Zentrum des Enzyms. An dieser Stelle bindet das Substrat, so dass ein Enzym-Substrat-Komplex ⁴⁶ entsteht. Würde allerdings das Substrat an das Enzym genau komplementär bilden, so würde das Substrat gebunden bleiben und nicht reagieren ⁴⁷ . Das Induced-fit-Modell beschreibt die Wirkung des Enzyms genauer: Bei der Annäherung von Substrat und Enzym machen sowohl das Substrat als auch das Enzym eine Konformationsänderung durch, so dass eine komplementäre Bindung möglich ist.

Die Aktivität der Enzyme ist stark abhängig von ihrer Umgebung. So wird die Aktivität beispielsweise beeinflusst von dem pH-Wert der Umgebung. Der pH-Optimumswert liegt bei etwa sieben, bei extremen pH-Werten denaturieren die Enzyme. Auch die Temperatur spielt bei der Aktivität der Enzyme eine entscheidende Rolle. Nach der RGT-Regel (Reaktions-Geschwindigkeits-Temperatur-Regel) verdoppelt sich die Geschwindigkeit der Reaktionen bei einer Temperaturerhöhung um 10°C zwar, jedoch denaturieren die Enzyme auch bei zu

⁴⁴ vgl. Munk: Genetik, 2001, S. 6-1.

⁴⁵ vgl. Löffler: Basiswissen Biochemie, 2001, S. 65.

⁴⁶ vgl. Löffler: Basiswissen Biochemie, 2001, S. 65.

⁴⁷ vgl. Munk: Genetik, 2001; S. 6-11.

SACHANALYSE 25

___________________________________________________________________________ extremen Temperaturen. Auch die Substratkonzentration spielt eine Rolle bei der Geschwindigkeit der Enzymkatalyse. Mit größerer Substratkonzentration steigt auch die Geschwindigkeit der Katalyse, da die Wahrscheinlichkeit größer ist, dass ein Enzym auf ein Substratmolekül trifft. Allerdings ist die Geschwindigkeit nicht unendlich steigerbar, da ab einer bestimmten Substratkonzentration alle Enzyme einen Enzym-Substrat-Komplex eingegangen sind und somit nicht mehr des Substrates umsetzen können.

2.4.2. Restriktionsendonucleasen

Restriktionsendonucleasen werden meist schlicht als Restriktionsenzyme bezeichnet ⁴⁸ und können sequenzspezifisch Phosphodiesterbindungen von doppelsträngigen DNA-Molekülen spalten. Restriktionsenzyme erkennen eine bestimmte Basensequenz der DNA und können sich an diese anlagern. Jedes Enzym hat eine eigene spezifische Basensequenz, welche meist vier bis sechs Basenpaare umfasst. Die Schnittstelle der Enzyme muss nicht gleich sein mit der Erkennungssequenz, jedoch gibt es auch Restriktionsenzyme, deren Schnittstelle gleich der Erkennungssequenz ist. Die Erkennungssequenz ist meist palindromisch angeordnet, das heißt, dass die Basenabfolge vom 5’-Ende zum 3’-Ende gelesen auf beiden Strängen gleich ist. Eine Gruppe der Restriktionsenzyme schneidet blunt ends, eine andere Gruppe schneidet sticky ends. Bei den blunt ends liegen die Schnittstellen auf beiden Strängen der DNA an der gleichen Stelle, bei den sticky ends sind die Schnittstellen um wenige Basen versetzt.

Restriktionsenzyme werden aus Bakterien gewonnen. Die Bakterien nutzen die Enzyme zur Abwehr von Fremd-DNA. Die Fremd-DNA wird bei Eindringen in die Zelle zerschnitten. Da die eigene DNA allerdings frei im Cytoplasma liegt, wird diese vor der Hydrolyse der Enzyme geschützt, indem die Erkennungssequenzen auf der DNA modifiziert sind. Meist wird als Modifikation ein Methylrest an Adenin oder Cytosin gehängt.

Der Name der Restriktionsenzyme stammt von den jeweiligen Bakterienstämmen ab, aus welchen die Enzyme isoliert werden. So steht der Name des Enzyms EcoRI für den Bakterienstamm Escherichia coli RY13. Das jeweils erste entdeckte Enzym erhält außerdem die Bezeichnung „I“.

⁴⁸ vgl. Munk: Genetik, 2001; S. 11-4.

SACHANALYSE 26

___________________________________________________________________________ 2.4.3. Gelelektrophoretische Auftrennung der DNA

Das Prinzip der Gelelektrophorese basiert auf der Wanderung der negativ geladenen DNA-Fragmente durch ein elektrisches Feld ⁴⁹ . In der Regel verwendet man für die gelelektrophoretische Auftrennung Agarose und gepufferte Salzlösung. Agarose ist ein Polysaccharid, welches aus Rotalgen isoliert wird. Die Agarose muss zunächst im Puffer aufgekocht werden und anschließend in der Elektrophoresekammer abkühlen. Bei diesem Prozess geliert die Agarose. Während dem Abkühlen wird ein Kamm in die Agarose gestellt, welcher nach dem Gelieren Auftragstaschen ausbildet. Das Gel wird für die Reaktion unter Spannung gesetzt, wobei sich die Auftragstaschen für die DNA nahe der Kathode befinden. Das Gel wird außerdem mit gepufferter Salzlösung bedeckt, so dass der Stromfluss gewährleistet ist.

Die Agarose bildet ein Gitternetz aus, welches aufgrund der Porengröße für die DNA-Fragmente ein Hindernis bildet. Größere Fragmente bleiben in den Poren hängen, so dass diese Fragmente nicht so weit durch das Gel wandern können. Die Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen DNA-Fragmente ist abhängig von ihrer Größe. Die großen Fragmente wandern langsamer als die kleinen. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Nucleinsäuren ist umgekehrt proportional zur Länge der Nucleinsäure-Fragmente ⁵⁰ . Durch die Phosphatgruppen sind Nucleinsäuren negativ geladen, folglich tragen große Fragmente mehr negative Ladung als kleine Fragmente. Man sollte annehmen, dass die großen Fragmente also weiter durch das Gel wandern. Jedoch funktioniert die Struktur des Gels als eine Art Sieb, in welchem die großen Fragmente früher hängen bleiben als die kleinen Fragmente.

Gleich große DNA-Fragmente wandern gleich weit, und bilden eine Bande an dem Punkt im Gel, an welchem sie hängen bleiben. Will man allerdings die exakte Größe der Fragmente bestimmen, so muss ein Gemisch aus DNA-Fragmenten bekannter Größen als Standard hinzugegeben werden. Dieser Standard dient als Eichgerade, woran die Größenbestimmung der unbekannten Fragmente möglich ist.

Die Elektrophorese darf nicht zu lange laufen, da sonst die kleinsten DNA-Fragmente aus dem Gel herauslaufen würden. Für diesen Zweck wird den Proben ein Markerfarbstoff hinzugegeben, welcher den Fragmenten voran läuft und einen Anhaltspunkt für die Wanderungsgeschwindigkeit liefert. Im Anschluss an die Elektrophorese können die DNA-Fragmente mit einem Fluoreszenz-Farbstoff gefärbt werden, so dass man unter UV-Licht die einzelnen Banden deutlicher erkennen kann. Die genaue Anleitung des Versuchs findet sich im Anhang.

⁴⁹ vgl. Munk: Genetik, 2001; S. 11-3.

⁵⁰ vgl. Campbell: Biologie, 1998, S. 410.

SACHANALYSE 27

___________________________________________________________________________ 2.4.4. Der Bakteriophage Lambda

Bakteriophagen sind Viren, die in Bakterien eindringen und diese praktisch „auffressen“ können. Die Phagen können in die DNA-Replikation der Wirtszelle eingreifen und diese für ihre eigene Vermehrung nutzen ⁵¹ .

Der Bakteriophage Lambda vermehrt sich auf E.coli und besteht aus einem Kopf- und einem Schwanzteil. Die molekulare und genetische Struktur des Phagens ist fast lückenlos bekannt ⁵² , was ihn als Vektor für die molekulare Klonierung unentbehrlich macht. Phagen können weiterhin ihre DNA autonom replizieren (lytischer Zyklus) oder sie zum Bestandteil des befallenen Bakterienchromosoms machen und die DNA im Bakterium vermehren (lysogener Zyklus).

Die DNA des Bakteriophagen Lambda enthält etwa 50 Gene und ist doppelsträngig und linear. Die Enden der DNA sind einzelsträngig und laufen in jeweils 12 Nucleotide aus. Die Enden sind meist komplementär und können daher zu einem Ring geschlossen werden. Die Gene des Phagen codieren hauptsächlich für die eigene Proteinhülle, für die Lyse des Bakteriums sowie für das Einfügen der eigenen DNA in das Bakterienchromosom ⁵³ . An einer bestimmten Stelle in der Phagen-DNA kann außerdem Fremd-DNA eingebaut werden und zur Infektion von E.coli-Zellen verwendet werden. Um Fremd-DNA einzubauen benötigt der Phage Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme. Weiterhin enthält die Phagen-DNA einige Resistenzgene, so dass eine Vermehrung nur unter sehr spezifischen Bedingungen möglich ist.

2.4.5. Restriktion und Gelelektrophorese von Phagen-DNA

In diesem Versuch wird mittels drei verschiedener Restriktionsenzyme die DNA des Bakteriophagen Lambda geschnitten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Diese Restriktionsenzyme sind EcoRI, BamHI und HindIII mit folgenden Erkennungssequenzen, wobei alle drei Enzyme sticky ends schneiden:

N EcoRI: GAATTC

^CTTAAG N BamHI: ^{GGATTC CCTAAG} N HindIII: AAGCTT TTCGAA

⁵¹ vgl. Scharf und Scharf: Modellversuche, 2000, S. 38.

⁵² vgl. Seyffert: Lehrbuch der Genetik, 2003, S. 921.

⁵³ vgl. Scharf und Scharf: Modellversuche, 2000, S. 38.

SACHANALYSE 28

___________________________________________________________________________ Die Enzyme werden in jeweils unterschiedliche Eppendorf-Gefäße mit Phagen-DNA pipettiert und nach Abschluss der Gelelektrophorese anhand einer Genkarte überprüft. Eine Genkarte zeigt die Stellen innerhalb eines DNA-Stranges an, an denen bestimmte Restriktionsenzyme schneiden können. Die Genkarte für die verwendeten Restriktionsenzyme sieht wie folgt aus:

Anhand dieser Karte und den Banden auf dem Elektrophoresegel können die Fragmente der einzelnen Restriktionsenzyme überprüft werden. Das folgende Schema zeigt das erwartete Ergebnis der Gelelektrophorese mit den drei verwendeten Restriktionsenzymen sowie der un-

DIDAKTISCHE ANALYSE 29

___________________________________________________________________________

3. Didaktische Analyse

In diesem Kapitel werden die Funktionen und Ziele von Experimenten im Biologieunterricht im Allgemeinen und gentechnische Experimente im Besonderen erläutert. In diesem Abschnitt werden auch die Lehrziele der Experimente vorgestellt. Da in der Untersuchung sowie in den Fragebögen an verschiedenen Stellen die Begriffe „Interesse“ und „Motivation“ verwendet werden, werden diese Begriffe in diesem Kapitel erläutert. Weiterhin werden sämtliche Schritte einer Unterrichtsplanung vollzogen mit Lerngruppencharakteristik, Lehrplanbezug, Referenzkriterien sowie tabellarischer Übersicht.

3.1. Funktion und Lehrziele von (gentechnischen) Experimenten im Biologieunterricht

Das grundlegende Ziel des Biologieunterrichtes ist die Erweiterung der Kompetenzen der Schüler. „Kompetenz wird definiert als die Fähigkeit zu selbstverantwortlichem und selbstbestimmtem Handeln, das gleichermaßen von der Fachkompetenz, der Individualkompetenz und der Sozialkompetenz bestimmt wird, die jeweils die kognitive, affektive und handlungsbezogene Dimension umfassen.“ ⁵⁴ . Die kognitive Dimension umfasst das Denken, Wissen und

Problemlösen, die affektive Dimension umfasst die Veränderung von Interessenlagen und die Entwicklung dauerhafter Werthaltungen und die handlungsbezogene, bzw. psychomotorische Dimension umfasst die manipulativen und motorischen Fertigkeiten eines Schülers ⁵⁵ . Letzt-

lich soll der Biologieunterricht Fähigkeiten und Fertigkeiten vermitteln, die „notwendig und hilfreich sind, um den Prozeß des Denkens und Lernens zu steuern [...]“ ⁵⁶ . Folgende Grafik

verdeutlicht, inwieweit durch das Schülerexperiment entsprechende Kompetenzen vermittelt werden können:

⁵⁴ Eschenhagen et al.: Fachdidaktik Biologie, 2003, S. 178.

⁵⁵ vgl. Eschenhagen et al.: Fachdidaktik Biologie, 2003, S. 177.

⁵⁶ Eschenhagen et al.: Fachdidaktik Biologie, 2003, S. 178.

DIDAKTISCHE ANALYSE 30

___________________________________________________________________________

Auf der linken Seite der Grafik findet sich der Ablauf des Lernprozesses im Biologieunterricht. In dieser Spalte sind sämtliche Schritte aufgeführt, die vor und nach der Experimentalphase durchgeführt werden müssen und in den meisten Fachdidaktiken aufgeführt werden. Jeder einzelne dieser Schritte kann durch eine bestimmte Methode vermittelt werden. ⁵⁷ Diese

Methoden finden sich in der mittleren Spalte der Grafik. Bei Anwendung einer Methode entwickeln sich gleichsam entsprechende Kompetenzen bei den Schülern. Diese Kompetenzen stehen auf der rechten Seite der Grafik. So entwickelt sich beispielsweise aus der Vermittlungsmethode „Mindmapping“ oder „Clustering“ die methodische Kompetenz der Schüler. Diese Kompetenzen zusammengenommen bilden schließlich die „Handlungskompetenz“, das zentrale Ziel des Biologieunterrichts und in der Grafik in der rechten Spalte grau unterlegt.

Das Experiment als „Frage an die Natur“ ⁵⁸ greift gezielt in die Abläufe der Natur ein, indem

diese verändert werden und einzelne Faktoren somit in ihrer Wirkung für einen bestimmten Vorgang untersucht werden ⁵⁹ . Ein einzelner Faktor wird im Experiment systematisch variiert,

⁵⁷ vgl. Killermann: Biologieunterricht heute, 1986, S. 186. vgl. ebenso Berck: Biologiedidaktik, 1999, S. 120.

⁵⁸ Verfürth: Kompendium Didaktik Biologie, 1987, S. 69.

⁵⁹ vgl. Killermann: Biologieunterricht heute, 1986; S. 22.

DIDAKTISCHE ANALYSE 31

___________________________________________________________________________ wobei die übrigen Faktoren so konstant wie möglich gehalten werden müssen ⁶⁰ . Nach Killermann muss ein Experiment kontrollierbar und wiederholbar sein, so dass die ermittelten Messwerte und Daten immer wieder interpretiert werden können ⁶¹ .

Das experimentelle Arbeiten im Biologieunterricht ist unverzichtbar, wenn die Schüler mit den wissenschaftlichen Arbeitsweisen vertraut gemacht werden sollen. Nur mit dem Experiment lassen sich Probleme aus der Natur erkennen und erklären. Alle Naturwissenschaften stützen sich auf die Erkenntnis aus Experimenten, daher ist das Experiment nicht nur für die Schule relevant sondern in erster Linie für die Wissenschaft als solches. Das Experiment zeigt außerdem „den Weg zu allgemeinen Gesetzmäßigkeiten auf (Induktion).“ ⁶² . Die Schüler sollen vor allem im Leistungskurs so früh wie möglich mit dieser Methode vertraut gemacht werden. Mittels des Experimentierens werden ferner noch zusätzliche Fertigkeiten erlernt, wie beispielsweise beobachten, vergleichen, beschreiben, protokollieren und zeichnen ⁶³ . Experimentieren ermöglicht außerdem:

N entdeckendes Lernen

N selbstständiges und kooperatives Arbeiten N Schulung im Problemlösen 64

Das Schulexperiment unterscheidet sich wesentlich von dem Forschungsexperiment, da die Auswertung eines Schulexperiments zumindest der Lehrperson meist schon bekannt ist. Es können drei verschiedene Typen von Schulexperimenten unterschieden werden. Das einführende Experiment stellt den ersten Schritt für eine Hypothesenbildung zu einem neuen Thema dar, welches die Schüler zum Nachdenken anregen soll. Es wird meist zu Beginn einer Schul-stunde oder einer Unterrichtsreihe durchgeführt und ist oft eine Demonstration des Lehrers. Lehrerexperimente sind dann sinnvoll, wenn sie ein hohes Maß an Arbeits- oder Zeitaufwand erfordern, Schwierigkeiten bei der Material- oder Gerätebeschaffung bestehen, teure Apparaturen eingesetzt werden müssen oder eine große Unfallgefahr besteht ⁶⁵ . Das entdeckende Experiment gleicht dem Forschungsexperiment in der Vorgehensweise, doch der Lehrer muss den Schülern bei einigen Schritten noch Hilfestellung geben. Es wird in der Regel durchgeführt, wenn im aktuellen Unterrichtsgeschehen konkrete Fragen auftreten, die Antwort vor der

⁶⁰ vgl. Eschenhagen et al.: Fachdidaktik Biologie, 2003, S. 241.

⁶¹ vgl. Killermann: Biologieunterricht heute, 1986, S. 22.

⁶² Killermann: Biologieunterricht heute, 1986, S. 183.

⁶³ vgl. Eschenhagen et al.: Fachdidaktik Biologie, 2003, S. 244.

⁶⁴ vgl. Verfürth: Kompendium Didaktik Biologie, 1987, S. 62.

⁶⁵ vgl. Killermann: Biologieunterricht heute, 1986, S. 184.