Bachelor-Thesis

Die funktionelle Untersuchung von

Arzneistoffen auf die Aktivität von

kardialen Ionenkanälen

Karin Sandmaier

Naturwissenschaftliches und Medizinisches

Institut an der Universität Tübingen

Reutlingen, den 30.03.2007

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Danksagung

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit vom 01. September 2006 bis 31. März

2007 in der Abteilung Elektrophysiologie des Naturwissenschaftlichen und

Medizinischen Instituts an der Universität Tübingen unter der Leitung von Prof. Dr.

Elke Guenther in Reutlingen.

An erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Dr. Elke Guenther bedanken, für die

Aufnahme in ihr Team und für die Übertragung des sehr interessanten Themas.

Bedanken möchte ich mich besonders für ihr Vertrauen und die stetige Unterstützung,

die es mir ermöglichte, einen breiten Einblick in die Elektrophysiologie zu erlangen.

Mein besonderer Dank gilt Dr. Timm Danker, der die Betreuung dieser Arbeit

übernommen hat. Timm hat sich besonders beim Erlernen der Patch-Clamp-Methode

intensiv mit mir befasst und stand mir jederzeit mit fachlichem Rat zur Seite. Ohne ihn

wäre ein erfolgreicher Abschluss dieser Thesis nicht möglich gewesen.

Ein herzliches Dankeschön für die sehr gute Betreuung seitens der Fachhochschule

geht an Herrn Prof. Dr.-Ing. Franz Bigge. Er hat sich trotz des für ihn unbekannten

Fachgebiets dazu bereit erklärt, mich während meiner Thesis zu begleiten und gab mir

exzellenten und zuverlässigen Rückhalt seitens der Fachhochschule.

Dr. Udo Kraushaar, der mir mit Korrekturmaßnahmen und Verbesserungsvorschlägen

für die Thesis tatkräftig zur Seite stand und sich sehr bemüht hat. Vielen Dank!

Bei Doris Gasse möchte ich mich herzlich für die Vermittlung der Grundlagen in der

Zellkultur bedanken. Sie hat mich hervorragend in die Kultivierung von CHO-Zellen

eingelernt und hatte stets ein offenes Ohr für Fragen und Probleme.

Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Instituts, für die immer

freundliche und hilfsbereite Unterstützung und die nette Arbeitsatmosphäre.

Thoralf Hermann möchte ich für jegliche Unterstützung am Computer und die

Installation diverser Software danken.

Zum Schluss möchte ich mich natürlich noch besonders bei meiner Familie und

meinen Freunden bedanken, die mir tatkräftig zur Seite standen und uneingeschränkt

an mich geglaubt haben. Meine Eltern haben mir durch ihre Unterstützung mein

Studium erst ermöglicht und während dieser Zeit viel Halt gegeben! Herzlichen Dank!

II

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Thema der Bachelor-Thesis:

Die funktionelle Untersuchung von Arzneimitteln auf die Aktivität von

kardialen Ionenströmen

Verfasser:

Karin Sandmaier

Semester:

BT 7

Kurzfassung:

Das lange QT-Syndrom ist eine lebensgefährliche Krankheit, die bei sonst

völlig herzgesunden Patienten zum plötzlichen Herztod führen kann. Diese

Krankheit wird u. a. durch unerwünschte Arzneimittelwirkung ausgelöst. Der

hERG-Kaliumkanal, welcher für die schnelle Repolarisation im ventrikulären

Aktionspotenzial verantwortlich ist, ist bekannt dafür, dass viele Wirkstoffe

unspezifisch an ihn binden und damit seine Funktion stören. Es gibt

Auflagen von den internationalen Zulassungsbehörden, Wirkstoffe

grundsätzlich auf ihren Einfluss am hERG-Kanal zu testen.

Solche Wirkstofftests werden bevorzugt mit der so genannten Patch-Clamp-

Technik durchgeführt. Sie ermöglicht elektrophysiologische Untersuchungen

an Ionenkanälen in Zellmembranen. Ein effizientes, schnelles und

kostengünstigeres Verfahren ist jedoch das automatisierte Patch-Clamping.

Ziel dieser Arbeit war, ein geeignetes Dissoziationsmedium zu finden, um

CHOhERG-Zellen für den Patch-Automaten möglichst schonend in Suspension
zu bringen.

Schlüsselwörter: langes QT-Syndrom, hERG-Kaliumkanal, Pharmaka, Patch-

Clamp-Technik, automatisiertes Patch-Clamping, suspendierte CHOhERG-Zellen

III

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Title of Bachelor-Thesis:

Functional analysis of pharmaceuticals on the activity of cardiac ion channels

Author:

Karin Sandmaier

Semester: BT 7

Abstract:

The long-QT syndrome is a lifethreatening disease that can lead to sudden

cardiac death. In otherwise healthy patients one of the reasons for this

disease are negative side effects of medications. The hERG potassium

channel is responsible for the rapid repolarisation of the ventricular action

potential, and many active substances bind to it in a non-specific manner,

thus interfering with its function. International approval authorities require

active substances to be tested regarding their effects on the hERG channel.

Preferably such tests are performed using the so called patch clamp

technique which makes electrophysiological examination of ion channels in

the cell membranes. However, automated patch clamping provides an

efficient, rapid and cost-effective procedure.

The goal of this study was to find an appropriate dissociation medium for

bringing CHO cells into suspension as gently as possible for patch-

automation.

Keywords: long-QT syndrome, hERG potassium channel, pharmaceuticals,

patch clamp technique, automated Patch-Clamping, suspended CHOhERG cells

IV

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1

Einleitung 1

1.1

Aufbau und Funktion des Herzens 2

1.2

Das ventrikuläre Aktionspotenzial 4

1.3

Angeborenes und erworbenes langes QT-Sydrom 5

1.3.1 Das kongenitale (angeborene) QT-Syndrom 7

1.3.2 Das erworbene QT-Syndrom 7

1.4

Der hERG-Kanal (human

Ether-a-go-go

-Related Gene) 8

1.5

Pharmakologie 10

1.5.1 Drug-Development-Pipeline 10

1.5.2 Sicherheitspharmakologie in Verbindung mit dem LQTS 12

1.5.3 Cisaprid 13

1.6

Effiziente Testsysteme 14

1.6.1 Konventionelle Patch-Clamp-Technik 14

1.6.2 Patch-Automat 16

1.7

Ziel der Arbeit 17

2

Material und Methoden 18

2.1

Zellkultur 18

2.1.1 Zellkultivierung 18

2.1.2 Auftauen der Zellen 19

2.1.3 Passagieren der Zellen 20

2.1.4 Zellpräparation 21

2.1.5 Viability-Test 22

2.2

Elektrophysiologie 23

2.2.1 Chemikalien und Geräte 23

2.2.2 Patch-Clamp-Messstand (

Setup

) 24

2.2.3 Durchführung der Patch-Clamp-Untersuchungen 27

2.2.4 Auswertung für die Untersuchungen für den Patch-Clamp-Automaten 32

V

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2.2.5 Substanzapplikation 33

2.2.6 Statistische Auswertung hERG-Ströme 34

2.2.7 Statistische Auswertung der Messergebnisse des Wirkstofftests 35

3

Ergebnisse 36

3.1

Ergebnisse der Zellkultur 36

3.1.1 Zellwachstum 36

3.1.2 Viability-Test 37

3.2

Ergebnisse aus der Elektrophysiologie 38

3.2.1 Auswertung für adhärente Zellen 39

3.2.2 Auswertung accutasebehandelte Zellen 43

3.2.3 Auswertung versenebehandelte Zellen 48

3.2.4 Gegenüberstellung der Ausbeute für die drei Behandlungsmethoden 52

3.2.5 hERG-Ströme 53

3.2.6 Elektrophysiologische Eigenschaften von hERG-Strömen 58

3.2.7 Substanzapplikation (Cisaprid) 61

4

Diskussion 64

4.1

Diskussion der Ergebnisse aus der Zellkultur 64

4.2

Diskussion der Ergebnisse aus der Elektrophysiologie 65

4.2.1 Ausbeute und passive Membraneigenschaften der drei 66

Behandlungsmethoden 66

4.2.2 hERG-Kaliumströme 68

4.2.3 Wirkstofftest 70

5

Zusammenfassung 72

VI

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Aufbau des menschlichen Herzens 2

Abbildung 2 Erregungsbildungs- und -leitungssystem des Herzens 3

Abbildung 3 ventrikuläres Aktionspotenzial 4

Abbildung 4 Arrhythmien der Herzfunktion 6

Abbildung 5 Schematische Darstellung der -Untereinheit des hERG-Kanals 8

Abbildung 6 Die Konformation eines hERG-Kanals 9

Abbildung 7 Drug-Development-Pipeline. 10

Abbildung 8 Erwin Neher und Bert Sakmann 14

Abbildung 9 Patch-Clamp-Konfigurationen 15

Abbildung 10 automatisiertes Patch-Clamping. 16

Abbildung 11 Anordnung über dem Präparat 24

Abbildung 12 Funktionsprinzip eines Vorverstärkers. 25

Abbildung 13 Apparaturaufbau der Patch-Clamp-Technik 26

Abbildung 14 Zelle in der

whole cell-

Konfiguration 28

Abbildung 15 Einzelpuls 30

Abbildung 16 Pulsprotokoll zur zuverlässigen Bestimmung des Leckstroms 30

Abbildung 17 IV-Protokoll 31

Abbildung 18 Voll-aktivierte tail-currents. 31

Abbildung 19 Beispiel für eine hERG-Stromaufzeichnung 32

Abbildung 20 Zellwachstum der CHOhERG-K1 Linie. 36

Abbildung 21 CHOhERG-Zellen nach einem Kultivierungszeitraum von 2 ½ Monaten 37

Abbildung 22 Vitalitätsrate für versene- bzw. accutasebehandelte CHOhERG- Zellen 37

Abbildung 23 Ausbeute erfolgreich abgeleiteter, adhärenter Zellen 39

Abbildung 24 Sealwiderstände adhärenter Zellen für alle Präparationen 40

Abbildung 25 Serienwiderstände adhärenter Zellen für alle Präparationen 41

Abbildung 26 Membranwiderstände adhärenter Zellen für alle Präparationen 42

Abbildung 27 Ausbeute erfolgreich abgeleiteter, mit Accutase suspendierten Zellen 43

Abbildung 28 Sealwiderstände von mit Accutase suspendierten Zellen 44

Abbildung 29 Serienwiderstände von mit Accutase suspendierten Zellen 45

Abbildung 30 Membranwiderstände von mit Accutase suspendierten Zellen 46

Abbildung 31 Ausbeute erfolgreich abgeleiteter, mit Versene suspendierten Zellen 48

Abbildung 32 Sealwiderstände von mit Versene suspendierten Zellen 49

Abbildung 33 Serienwiderstände von mit Versene suspendierten Zellen 50

Abbildung 34 Membranwiderstände von mit Versene suspendierten Zellen 51

Abbildung 35 Ausbeute adhärent gepatchter Zellen 52

VII

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Abbildung

36

Ausbeute mit Accutase dissoziierte Zellen 52

Abbildung 37 Ausbeute mit Versene dissoziierte Zellen 52

Abbildung 38 Original hERG-Ströme in CHOhERG-Zellen 55

Abbildung 39 Mittleren hERG- Stromamplituden für die drei Behandlungsmethoden 55

Abbildung 40 Rundown, -up in % für die drei Behandlungsmethoden 57

Abbildung 41 Elektrophysiologische Eigenschaften für hERG-Ströme 59

Abbildung 42 Voll-aktiviertes Strom-Spannungs-Verhältnis bei adhärenten Zellen 60

Abbildung 43 Dosis-Wirkungskurve für adhärent abgeleitete Zellen. 62

Abbildung 44 Dosis-Wirkungskurve für accutasebehandelte Zellen 63

Abbildung 45 Dosis-Wirkungskurve für versenebehandelte Zellen. 63

VIII

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Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 verwendete Medien und Lösungen 19

Tabelle 2 verwendete Chemikalien und Lösungen 21

Tabelle 3 Extra- und Intrazellulärlösung 23

Tabelle 4 Geräte und Materialien 23

Tabelle 5 Auswahlkriterien für die Bewertung der gepatchten Zellen 31

Tabelle 6 Verdünnungsreihe für Cisaprid 33

Tabelle 7 Messergebnisse nach einer Gesamtmesszeit von 3 Stunden 47

Tabelle 8 Mittelwerte der Inhibition 61

IX

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