Aus der Chirurgischen Klinik

am Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer

Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum

Tierexperimentelle Untersuchung zum Einfluss von Sirolimus

auf die Wundheilung

INAUGURAL-DISSERTATION

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Robert Schier

2007

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Tag der Mündlichen Prüfung:

06. Mai 2008

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Abstract

Problem:

Klinisch führt das bei der Transplantation solider Organe eingesetzte immunsuppressive

Medikament Sirolimus zu vermehrten Wundheilungsstörungen. Die hierbei zugrunde

liegenden Mechanismen sind jedoch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss

von Sirolimus auf standardisierte Parameter der akuten Wundheilung und auf die Ex-

pression der Wundmediatoren Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Transforming

Growth Factor (TGF-ß) und induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) zu prüfen.

Methode:

Als Versuchstiere wurden 44 männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet, die in

Vollnarkose eine dorsale Hautinzision erhielten. Bei dem Eingriff wurden zudem 10

Polyvinylalkohol-Schwämmchen subkutan unter die Rückenhaut implantiert. Die Tiere

wurden in vier Gruppen unterteilt und Sirolimus wurde über 10 Tage in verschiedenen

Dosierungen oral appliziert (Gruppe SIR0.5: 0,5 mg/kg KG, Gruppe SIR2: 2 mg/kg KG,

Gruppe SIR5: 5 mg/kg KG und eine Kontrollgruppe). Am 10. postoperativen Tag wurden

die Tiere eingeschläfert, die Schwämmchen explantiert und die dermale Wunde

entnommen. Die Wunden und die Schwämmchen wurden sowohl histologisch als auch

immunhistochemisch untersucht. Zudem wurde die Reißfestigkeit der Wunden geprüft und

der Hydroxyprolingehalt des Granulationsgewebes bestimmt.

Ergebnis:

Die Behandlung mit Sirolimus wurde von den Tieren gut vertragen. Der postoperative

Gewichtsverlauf der Tiere der Kontrollgruppe unterschied sich nicht signifikant vom

Gewichtsverlauf der Tiere der Behandlungsgruppen. Bei den Tieren der Gruppen SIR2 und

SIR5 zeigte sich am 10. postoperativen Tag eine Beeinträchtigung der Wundheilung in

Form eines verminderten Hydroxyprolingehaltes im Granulationsgewebe und einer

verminderten Wundreißfestigkeit. Zudem deutete die immunhistochemische Untersuchung

des Wundgewebes auf einen verminderten Gehalt an VEGF, TGF-ß und iNOS hin.

Diskussion:

Unsere Untersuchung hat erstmals tierexperimentell eine Hemmung der Wundheilung

durch Sirolimus gezeigt. Dies spiegelte sich in einer verminderten Expression von

Wundmediatoren wider. Ob diese Beeinträchtigung des Wundheilungsprozesses reversibel

ist oder in Abhängigkeit von der Dauer der Therapie steht, bleibt zu untersuchen.

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Für meine lieben Eltern,

für

meine

Geschwister,

für unsere Ömi.

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Inhaltsverzeichnis

1

Einleitung 9

2

Stand der Forschung 11

2.1 Wundheilung 11

2.2 Einfluss

der

immunsuppressiven

Therapie auf die Wundheilung 14

2.3

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) 17

2.4

Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß) 18

2.5

Induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) 20

3

Fragestellung 22

4

Material und Methoden 23

4.1 Material 23

4.1.1 Versuchstiere 23

4.2 Methoden 24

4.2.1 Sirolimus-Applikation 24

4.2.2 Operation 24

4.2.3

Materialgewinnung und Materialverarbeitung 25

4.2.4

Sirolimus-Bestimmung im Serum 28

4.2.5

Messung der mechanischen Reißfestigkeit der Wunde 28

4.2.6 Hydroxyprolinbestimmung 29

4.2.7

Bestimmung von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in der

Wundflüssigkeit 32

4.2.8

Bestimmung von Transforming Growth Factor (TGF-ß) in der

Wundflüssigkeit 33

4.2.9

Bestimmung der Gesamtproteinmenge in der Wundflüssigkeit 34

4.2.10 Histologische

Übersichtsfärbung

(Hämatoxylin-Eosin Färbung) 35

4.2.11 Immunhistochemische

Färbung 36

4.3 Datenverarbeitung 41

4.3.1 Software 41

4.3.2 Statistische

Auswertung 41

5

Ergebnisse 42

5.1

Einfluss von Sirolimus und Operation auf das Körpergewicht 42

5

---

5.2

Einfluss von Sirolimus auf die Wundheilungsparameter 44

5.2.1

Wundreißfestigkeit der formalinfixierten Hautproben 44

5.2.2

Hydroxyprolingehalt des Granulationsgewebes 45

5.2.3

Einfluss von Sirolimus auf die Konzentration von VEGF und TGF-ß 47

5.2.4

Gesamtproteinkonzentration in der Wundflüssigkeit 49

5.2.5 Histologische

Übersichtsfärbung

(Hämatoxylin-Eosin Färbung) 50

5.2.6 Immunhistochemische

Färbung 55

6

Diskussion 76

6.1 Wundmodell 77

6.2 Gewicht

im

Versuchsverlauf 78

6.3

Einfluss von Sirolimus auf die Wundheilung 79

6.4

Einfluss von Sirolimus auf die Expression von VEGF, TGF-ß und iNOS

in Wunden 83

6.4.1 Vascular

endothelial

growth factor (VEGF) 83

6.4.2

Transforming growth factor (TGF-ß) 85

6.4.3

Induzierbare NO-Synthase (iNOS) 87

6.5

Schlussfolgerung und Ausblick 90

7

Zusammenfassung 91

8

Literaturverzeichnis 93

6

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Abkürzungsverzeichnis

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

ACTH Adrenocortikotropes

Hormon

AEC-Farbstoff 3-Amino-9-ethylcarbazol

AP Alkalische

Phosphatase

Aqua bidest.

destilliertes Wasser

bFGF

basic fibroblast growth factor

(basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor)

BSA

bovine serum albumine

(Rinderserumalbumin)

bzw. beziehungsweise

ca. circa

cm Zentimeter

d

dies

(Tag)

DNA

desoxyribonucleic acid

(Desoxyribonukleinsäure)

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (Komplexbildner)

EGF

epidermal growth factor

(epidermaler Wachstumsfaktor)

ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

(enzymgebundener Immunoassay)

eNOS

endotheliale nitric oxide synthase

(endotheliale Stickstoffmonoxid-

synthase)

FGF

fibroblast growth factor

(Fibroblasten Wachstumsfaktor)

FKBP12

FK506 binding protein-12

(FK506-Bindungsprotein-12)

g Gramm

ggf. gegebenenfalls

HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin

Färbung

HRP

horseradish peroxidase

(Meerrettichperoxidase)

ICAM-1

intercellular adhesion molecule-1

(interzelluläres Adhäsionsmolekül-1)

IFN- Interferon

IL-1 Interleukin-1

iNOS

inducible nitric oxide synthase

(induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase)

IGF-1

insulin-like growth factor-1

(Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor-1)

7

---

kg Kilogramm

KG Körpergewicht

KGF

keratinocyte growth factor

(Keratinozyten Wachstumsfaktor)

M Mol/l

ml Milliliter

MEIA Mikropartikel-Enzym-Immunoassays

mg Milligramm

min Minute

MITU S-Methyl

Isothiouronimum

mm Millimeter

MMF Mykophenolat

Mofetil

mTOR

mammalian target of rapamycin

(Ziel des Rapamycins im Säugetier)

n Anzahl

N Newton

ng Nanogramm

nm Nanometer

nNOS

neuronale nitric oxide synthase

(neuronale Stickstoffmonoxidsynthase)

p-DABA p-Dimethylaminobenzaldehyd

PDGF

platelet-derived growth factor

(von Thrombozyten abgeleiteter

Wachstumsfaktor)

SPARC

secreted protein acidic and rich in cystene

(saures, cysteinreiches

Sekretionsprotein)

TBS

tris buffer saline

(dreifach Puffer-Salzlösung)

TMB Tetramethylbenzidin

TGF-

transforming growth factor-

(transformierender Wachstumsfaktor-)

TGF-ß

transforming growth factor-ß

(transformierender Wachstumsfaktor-ß)

TNF-

tumor necrosis factor-

(Tumor Nekrose Faktor-)

u.a. unter

anderem

VEGF

vascular endothelial growth factor

(vaskulärer, endothelialer Wachs-

tumsfaktor)

z.B. zum

Beispiel

8

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Kapitel 1

Einleitung

1 Einleitung

Die Wundheilung hat eine zentrale Beutung nach chirurgischen Eingriffen. Sie ist zudem

Voraussetzung für das Abheilen chronischer Wunden bei immunkompromittierten

Patienten mit Tumorleiden, Sepsis oder Diabetes mellitus, sowie nach Polytrauma oder

einer Organtransplantation. Für den Ablauf einer komplikationslosen Wundheilung sind

eine Reihe von komplexen zellulären und molekularen Mechanismen notwendig, die unter

normalen Bedingungen dazu führen, dass sich die Wundränder verschließen und sich

Narbengewebe ausbildet [112]. Um verschiedene Einflussfaktoren auf die Wundheilung zu

untersuchen, wie z.B. medikamentöse Therapie oder ischämische Prozesse, ist es

notwendig, sich zunächst mit dem physiologischen Ablauf der Wundheilung vertraut zu

machen. Clark beschreibt die Wundheilung der Haut als eine Integration dynamischer

interaktiver Prozesse zwischen löslichen Mediatoren, festen Blutbestandteilen,

extrazellulärer Matrix und Parenchymzellen [28,30]. Die einzelnen Phasen der

Wundheilung werden dabei von komplexen Kontrollmechanismen geführt, die eine

Initiation des Heilungsprozesses und eine Regeneration des Hautgewebes gewährleisten

[94]. Zu den einzelnen Wundheilungsprozessen zählen vor allem Blutgerinnung,

Entzündungsreaktion, Zellreplikation, Epithelialisierung, Angiogenese, Einlagerung von

Matrix, Wundmodulation und Narbenbildung [80]. Zur Untersuchung dieser Phasen der

Wundheilung hat sich seit Jahren ein Wundmodell im Tierversuch mit Ratten etabliert.

Schon 1968 untersuchte Aspesos den Wundheilungsprozess unter ischämischen

Bedingungen im Tiermodell [10]. Das in dieser Arbeit verwandte Wundmodell wurde

1957 von Edwards etabliert und gilt als Standardmodell in der Wundheilungsforschung

[5,13,102,103,120,152].

Das Immunsystem besitzt bei der Wundheilung eine zentrale Rolle [48,147]. Die

Regulation der Wundheilung durch lokale Produktion von Wachstumsfaktoren, welche

Entzündungszellen sowohl autokrin als auch parakrin beeinflussen, wird in der Literatur

intensiv belegt [41,74]. Dabei sind Wachstumsfaktoren eng in die Wundheilung

eingebunden und gerade bei der Initiation des Heilungsprozesses ist ihre Freisetzung durch

immunkompetente Zellen von enormer Wichtigkeit [51]. Zu den Hauptaufgaben dieser

Wachstumsfaktoren zählen, neben Chemotaxis und Modulation von Entzündungszellen,

die Stimulation von Fibroblasten und Endothelzellen. Damit gewährleisten sie eine für die

Neoformation von Granulationsgewebe essentielle Kollagensynthese und Neovas-

kularisation [107]. Als wichtige Zytokine für den physiologischen Ablauf der

9

---

Kapitel 1

Einleitung

Wundheilung haben sich u.a. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und

Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß) erwiesen, die eine Schlüsselrolle bei der

Wundmodulation spielen [37,52]. Auch die zentrale Bedeutung des Stickstoffmonoxid-

stoffwechsels und die Expression des Schlüsselenzyms induzierbare Stickstoffmonoxid-

synthase (iNOS) für den Ablauf einer komplikationslosen Wundheilung ist mehrfach

untersucht worden [11].

In dieser Arbeit wurde die Expression der drei Mediatoren VEGF, TGF-ß und iNOS am

10. postoperativen Tag immunhistochemisch untersucht und mit anderen Wundheilungs-

parametern korreliert, um eine mögliche Aussage über den Ablauf der Wundheilung

treffen zu können.

Das Medikament Sirolimus ist ein immunsuppressives Agens, dass in der

Transplantationschirurgie einen festen Stellenwert erlangt hat. Klinisch wird es zur

Prophylaxe einer Abstoßungsreaktion nach Organtransplantation eingesetzt. Sowohl in

klinischen als auch in experimentellen Studien wurde die pharmakologische Wirkung von

Sirolimus auf die Wundheilung untersucht. Dabei wurde ein inhibitorischer Effekt von

Sirolimus auf die Fibroblastenaktivität beschrieben, der mit einer Beeinträchtigung der

Wundheilung einhergeht [88]. Unter anderem durch eine Beeinträchtigung von

Fibroblastenfunktion und Angiogenese kam es in einer aktuellen Studie in 35 - 50 % der

mit Sirolimus therapierten Patienten zu chirurgischen Komplikationen wie Lymphozelen,

Wunddehiszensen, und Abszessen [67]. Auch die Inzidenz von Wundinfektionen im

Rahmen einer Sirolimustherapie wurde untersucht und dabei eine erhöhte Infektionsgefahr

aufgrund unzureichend abgeschlossener Wundheilung vermutet [3]. In einer prospektiv

randomisierten Studie wurde eine höhere Inzidenz an postoperativen Wundkomplikationen

bei einer Therapie mit Sirolimus gegenüber einer Therapie mit dem Immunsuppressivum

Tacrolimus nachgewiesen (47 % vs. 8 %, p <0.0001) [40].

Der genaue Mechanismus dieser möglichen Beeinträchtigung der Wundheilung durch

Sirolimus, unter Berücksichtigung der Wirkung auf die Zytokin vermittelte Wund-

modulation, bleibt jedoch ungeklärt.

In unserer Arbeit untersuchten wir im Tierversuch die dermale Wundheilung unter

immunsuppressiver Therapie mit Sirolimus am 10. postoperativen Tag und testeten eine

mögliche Inhibition der Mediatoren VEGF, TGF-ß und iNOS.

10

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