Aus dem Fachbereich Medizin der Johann Wolfgann Goethe-Universität
Frankfurt am Main

Medizinische Klink III
Abteilung für Hämatologie und Onkologie

"IN VITRO–STUDIEN ZUR APOPTOSE VON LYMPHOMZELLEN
VON PATIENTEN MIT NIEDRIG–MALIGNEN NON–HODGKIN–
LYMPHOMEN UNTER DEM EINFLUSS VON RITUXIMAB
UND VERSCHIEDENEN ZYTOSTATIKA"

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
des Fachbereichs Medizin
der Johann Wolfgann Goethe-Universität
Frankfurt am Main

vorgelegt von

Wolf Daniel Sommerlad

Frankfurt am Main, 2002

Inhalt

Erstes Kapitel.
Einführung und Fragestellung ... 2–11
1.1. Geschichte der Chemotherapie. ... 2
1.2. Fragestellung. ... 4
1.3. Herstellung monoklonaler Antikörper. ... 6
1.4. Herstellung chimärer Antikörper (am Beispiel von Rituximab). ... 7
1.5. Eigenschaften des CD20-Antigens. ... 8
1.6. Apoptose. ... 8

Zweites Kapitel.
Material und Methoden. ... 12–31
2.1. Reagenzien. ... 12
2.2. Zytostatika. ... 12
2.3. Antikörper. ... 13
2.4. Caspase–Inhibitoren. ... 13
2.5. Zelllinien. ... 13
2.6. Arbeitsmaterialien. ... 13
2.7. Software. ... 14
2.8. Rezepte der Gebrauchlösungen. ... 14
2.9. Zellkultur. ... 15
2.10. Zellseparation mit Ficoll-Hypaque. ... 16
2.11. Zellzählung. ... 16
2.12. Das Durchflusszytometer (FACS). ... 17
2.13. Apoptosemessung mit 7–AAD, JC–1 und Annexin. ... 20
2.14. Auswertung der Apoptosemessungen. ... 23
2.15. Messung der CD20–Bindungskapazität. ... 24
2.16. Western Blotting. ... 26

Drittes Kapitel.
Ergebnisse. ... 32–53
3.1. Dosisfindung von Rituximab und Untersuchung der Apoptose. ... 32
3.2. Untersuchung der komplementabhängigen Zytotoxizität (CDC). ... 35
3.3. Kombinationen von Rituximab mit Zytostatika. ... 40
3.4. Untersuchung der Caspasen mittels Western Blots (DOHH2). ... 47

Viertes Kapitel.
Diskussion. ... 54–59
Zusammenfassung / Summary. ... 60–61

Literaturnachweis. ... 62–68

Schriftliche Erklärung. ... 69
Danksagung. ... 71

Erstes Kapitel.
Einführung und Fragestellung.
Geschichte der Chemotherapie. Fragestellung. Herstellung monoklonaler Antikörper. Eigenschaften des CD20–Antigens. Herstellung chimärer Antikörper (Rituximab). Apoptose. Intrazelluläre Signalwege der Apoptose.

1.1. Geschichte der Chemotherapie.
Obwohl es bereits seit dem Altertum gewisse Kenntnisse über die tumorreduzierende Wirkung von Pflanzen und Mineralien gab, konnte erstmals der Breslauer Neurologe Heinrich Lissauer im Jahr 1865 in einer wissenschaftlichen Arbeit über positive Effekte einer Chemotherapie bei chronischer myeloischer Leukämie (CML) berichten.¹ Zwei Patienten mit CML zeigten Zeichen einer Teilremission, nachdem sie mit Kaliumarsenit (Fowler′sche Lösung) behandelt worden waren, ein Effekt, der 1931 durch C. E. Forkner wiederentdeckt wurde.² 1892 berichtete William B. Coley über antineoplastische Effekte von Bakteriengiften (ein Bakterientoxin–Cocktail namens "Coley′s Toxin") auf verschiedene Tumoren, entdeckt als eine Nebenwirkung von postoperativen Wundinfekten bei Sarkompatienten.

Mit der Entwicklung von Salvarsan (1909) gilt Paul Ehrlich als Begründer der modernen Chemotherapie, obgleich diese Substanz weniger antineoplastische als vielmehr antibakterielle Wirkung hatte.^3,4 Einen mehr biologischen Weg wählte sein Freund und zugleich Konkurrent Emil von Behring, der bereits zwanzig Jahre zuvor mit der Serumtherapie den Grundstein der heutigen Immuntherapie gelegt hatte.⁵

Die Entwicklung von Senfgas (Lost) durch Alfred Gilman im 1. Weltkrieg richtete das Augenmerk auf eine Substanz, die neben der Wirkung als Reiz– und Kampfgas auch starke myelosuppressive Effekte aufwies (u.a. reduzierte Lymphozytenzahl). Um die Giftigkeit zu reduzieren, wurden Schwefel– und später Stickstofflostverbindungen hergestellt, die allerdings immer noch sehr toxisch waren. Die ersten klinischen Arbeiten über die Anwendung von Stickstofflost bei Lymphomen und soliden Tumoren wurden erst nach dem 2. Weltkrieg veröffentlicht.⁶ Moderne Abkömmlinge des Stickstofflost sind das Cyclophosphamid (1958) und die Nitrosoharnstofe (1967).

In den folgenden Jahren begann eine rasante Entwicklung neuer Zytostatika. Zunächst wurde 1947 durch S. Farber mit den Folsäureantagonisten die neue Wirkstoffgruppe der Antimetabolite etabliert.7 1952 folgte mit dem Purinanalogon 6–Mercaptopurin das erste vollsynthetische Zytostatikum,8 ein Jahr später wurde mit Busulfan das erste Alkylans in die Klinik eingeführt. Daraufhin wurden weitere Wirkprinzipien und zahlreiche neue Wirkstoffe entdeckt. Teilweise handelte es sich um synthetische Substanzen (etwa Hydroxyharnstoff, Cyclophosphamid, Cytosin–Arabinosid oder Nitrosoharnstoffe), teils um zytostatisch wirksame Antibiotika (z.B. Actinomycin D, Daunorubicin, Bleomycin). Auch Hormone erwiesen sich als antineoplastisch wirksam. So setzte Charles B. Huggins bereits 1941 Östrogen gegen das Prostatakarzinom ein. Das Antiöstrogen Tamoxifen wurde 1962 als Kontrazeptivum entworfen, blieb für diese Indikation jedoch erfolglos. Im Jahr 1973 erfolgte erstmals eine Zulassung zur Therapie des Mammakarzinoms.

Nachdem 1971 die beiden Podophyllotoxine Etoposid (VP–16) und Teniposid (VM– 26) entwickelt wurden, gab es über einen Zeitraum von zwei Jahrzehnten keine wesentlichen  Neuerungen in der Entwicklung von Zytostatika. Erst 1994 wurden die zytostatisch wirksamen Inhaltsstoffe der pazifischen Eibe (Paclitaxel, Docetaxel) isoliert und seither halbsynthetisch hergestellt.

Erst in den 90er Jahren des 20. Jahrhunderts begann das "immunologische Zeitalter" in der klinischen Therapie und führte die Wege von Behring und Paul Ehrlich zusammen. Einerseits wurden Zytokine zur Immunmodulation synthetisiert und klinisch eingesetzt (etwa GM–CSF zur Stimulation der Granulopoese), andererseits fanden erstmals 1986 monoklonale Antikörper den Weg zur Anwendung am Patienten (OKT3 zur Immunsuppression nach Organtransplantation).

1995 wurde unter dem Namen Panorex® der erste monoklonale Antikörper zur Behandlung eines Tumorleidens zugelassen, gerichtet gegen das Oberflächenprotein 17–1A von Colonkarzinomzellen. Rituximab ist seit 1997 der erste Antikörper, der zur Lymphomtherapie eingesetzt wird.

1.2. Fragestellung.
Rituximab ist als wirksame Einzelsubstanz zur Behandlung von Patienten mit niedrig– und hochmalignen Non–Hodgkinlymphomen etabliert worden. Die erreichten Ansprechraten der Studie von McLaughlin entsprachen mit 48% in etwa einer Monotherapie mit herkömmlichen Zytostatika.

[...]

1. Lissauer H. Zwei Fälle von Leucaemie. Berl Klin Wochenschr. 1865;2:403-405

2. Forkner C, Scott, TF. Arsenic as a therapeutic agent in chronic myeloid leukemia. JAMA. 1931;97:3

3. Die Behandlung der Syphilis mit dem Ehrlichschen Präparat 606. 82. Versammlung Deutscher Naturforscher und Aerzte. Königsberg; 1910:1889-1924

4. Ehrlich P, Hata, S. Die experimentelle Chemotherapie der Spirillosen. Berlin: Julius Springer; 1910

5. Behring E. Über das Zustandekommen der Diphtherie-Immunität und der Tetanus-Immunität bei Thieren. DMW. 1890;16:1113-1114

6. Goodman L, Wintrobe, MM, Dameshek, W, Goodman, MJ, Gilman, A, and McLennan, MT. Nitrogen Mustard Therapy. Journal of the American Medical Association. 1946:126-132