Cytogenetik

von: Antje van de Loo

Inhaltsverzeichnis

Einleitung 3

Protokoll 1: Mikroskopie 4

Protokoll 2: Identifizierung des Geschlechtschromatins 12

Protokoll 3: Blutkulturansatz 15

Protokoll 4: Zwiebelchromosomenpräparation 27

Protokoll 5: Präparation von Mitose-Chromosomen aus Neuroblasten 30

Protokoll 6: Polytänchromosomen 34

Protokoll 7: Hodenpräparation von Drosophila hydei 38

Protokoll 8: Artemia und Moospolster 42

Literaturliste 46

Einleitung

Die Cytogenetik hat die Erfassung von Vererbungsabläufen auf der Ebene der Zelle zur Aufgabe. Sie stellt eine direkte Berührung von Genetik und Cytologie dar.
Die Schwerpunkte liegen in der Erforschung von Struktur, Funktion, Plastizität und Evolution des Erbgutes und den molekular-cytogenetischen und epigenetischen Grundlagen der Vererbung. Essentielle Regionen von Chromosomen (Centromer, Telomer, Nukleolusorganisatoren, Eu- und Heterochromatinbereiche) werden molekular und cytogenetisch charakterisiert.

Das Praktikum soll einen Einblick in die lichtmikroskopischen Strukturen des Zellkerns verschaffen. Es werden von einer Reihe von Objekten mikroskopische Präparate hergestellt und untersucht. Verschiedene Präparations-, Färbe- und Mikroskopiertechniken werden dabei angewandt. Schwerpunkte sind der Gestaltwandel des Zellkerns während der Meiose, Chromosomenstruktur und Morphologie, Riesenchromosomen und Spermatogenese von Drosophila, und Geschlechtschromosomen. Das Praktikum will den Teilnehmern auch die Fertigkeit zur selbständigen Herstellung einfacher mikroskopischer Präparate von Zellen und Chromosomen vermitteln. Die Zeichnung der zytologischen Objekte soll helfen, die Beobachtung zu schärfen.

Protokoll 1: Mikroskopie

Theoretische Einführung:

geometrische Optik
Wer an einem Gegenstand feine Einzelheiten sehen will, muss bekanntlich nahe an ihn herangehen. Eng nebeneinander liegende Details sind eben nur aus der Nähe voneinander zu unterscheiden, während sie aus größerer Entfernung scheinbar miteinander verschmelzen und einheitliche Flächen bilden. Wenn der Gegenstand zu nahe vor dem Auge liegt, kann er wegen der begrenzten Akkomodationsfähigkeit nicht mehr scharf abgebildet werden. Deshalb muss eine Mindestentfernung zwischen Gegenstand und Auge eingehalten werden. Das beste Auflösungsvermögen erzielt man, wenn Objekte durchschnittlich bis auf 25 cm an das Auge herangebracht werden und 0,15 – 0,3 mm auseinander liegen. Die Vergrößerung des Sehwinkels führt zu einer besseren Auflösung. Hilfsmittel zu dessen Vergrößerung sind Sammellinsen. Sie sammeln Lichtstrahlen, die parallel zur optischen Achse einfallen in einem Brennpunkt (Abb.1). Lichtstrahlen (verlaufen in der Luft), die beim Eindringen in ein anderes Medium ihre Verlaufrichtung ändern heißen gebrochen.

F = Brennpunkt f = Brennweite
Abb.1: Sammellinse (http://www.mikroskopie.de/kurse/strahlen.htm ) [Abbildung in der Downloaddatei vorhanden]

Diese Lichtbrechung kann mit der Formel: n = sin α/ sin α´ berechnet werden. Das Ausmaß von n hängt von der Art des Stoffes ab, in dem das Licht aus der Luft übertritt und wird von der Lichtfarbe beeinflusst. Chromatische Aberrationen sind Abbildungsfehler (Fehler wie Unschärfen, Farbsäume und geometrische Verzerrungen) von Objektiven, bsw. bei Mikroskopen. Die Lichtfarben bündeln sich nicht im Brennpunkt eines Objektivs. Die chromatische Abberation wirkt sich katastrophal auf die Bildschärfe und den Kontrast aus, denn die verschiedenfarbigen Lichtstrahlen besitzen unterschiedliche Brennpunkte. Blaue Strahlen werden stärker gebrochen als Rote (Dispersion). Eine Korrektur kann durch so genannte Achromaten erfolgen.
Wirkt eine Sammellinse als Lupe, soll sie immer so benutzt werden, dass das Bild nicht in konventioneller Sehweite, sondern im Unendlichen entsteht. Dazu muss der Gegenstand in die vordere Brennebene der Linse gebracht werden.
Das Bild wird vergrößert und seitenrichtig dargestellt.
Es lässt sich aber nicht auf einer Projektionswand auffangen sondern erscheint virtuell.
Um nun die Vergrößerung einer Lupe zahlenmäßig auszudrücken, sind gewisse Normbedingungen international festgelegt worden. Die Sehweite ohne Lupe ist mit 250 mm normiert, weil sie etwa der Leseentfernung entspricht und weil der normalsichtige Mensch durchschnittlich bis zu 45 Jahren noch bis zu dieser Sehweite ohne Lesebrille akkomodieren kann. Als Lupenvergrößerung ergibt sich ein Sehwinkelverhältnis "mit Lupe" zu "ohne Lupe", das gleich dem Verhältnis von 250 mm zur Brennweite der Lupe ist: V = 250/ f.

Das Mikroskop

Das Mikroskop ist ein System aus einem Projektionsapparat (Sammellinse) und einer Lupe. Sein Auflösungsvermögen wird durch die Wellenlänge des benutzten Lichtes und die numerische Apertur des Objektivs bestimmt. Die numerische Apertur ist das Produkt aus dem Brechungsindex (für Luft n = 1) des Mediums zwischen Objekt und Objektiv und dem Sinus des halben Öffnungswinkels des Objektivs (Winkel zwischen optischer Achse des Gerätes und dem äußersten Lichtstrahl).

nach E. Abbe:

A = n x sin α

Sie wird allen Objektiven aufgraviert. Die höchste numerische Apertur mit Trockenobjektiven beträgt 0,95.
Die Frontlinsen der Immersionsobjektive und die Präparatoberfläche werden mit einem Medium verbunden, das einen höheren Brechungsindex hat als Luft (Ölimmersion). Zum Beispiel Immersionsöl mit einem Brechungsindex von n = 1,515 oder Anisol mit n = 1,5168. Dadurch gelangen auch stärker geneigte Lichtstrahlen noch in das Objektiv (Abb.2). Die numerische Apertur sowie das Auflösungsvermögen des Objektivs nehmen zu.

Abb.2: Der Einfluss der Immersion auf das Auflösungsvermögen (http://hoersaal.physik.uni-halle.de/Optik_Dias.html ) [Abbildung in der Downloaddatei vorhanden]
Je kürzer die Wellenlänge des benutzten Lichtes und je höher die numerische Apertur, umso größer ist das Auflösungsvermögen. Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops beträgt ca.0,15 μm, das eines Elektronenmikroskops sogar 0,15 nm.
Der Kondensor ist ein Linsensystem mit einer integrierten Irisblende, der Aperturblende. Der Kondensor befindet sich unterhalb des Objekttisches. Er dient der optimalen Aufbereitung des von der Glühlampe erzeugten Lichts. Bei Labor- und Forschungsmikroskopen wird der Kondensor in einem höhenverstellbaren und zentrierbaren Kondensorträger befestigt. Ein Schließen der Aperturblende bewirkt eine Abnahme der Bildhelligkeit und der Auflösung sowie eine Zunahme des Kontrastes. Die Aperturblende wird folglich benutzt um einen möglichst günstigen Kompromiss zwischen der Auflösung und dem Kontrast im mikroskopischen Bild einzustellen.
Im Stativfuß befindet sich bei allen leistungsfähigeren Mikroskopen eine weitere Irisblende, die Leuchtfeldblende. Die Leuchtfeldblende lässt sich in ihrem Durchmesser exakt an die Größe des Gesichtsfeldes anpassen. Folglich bewirkt ein Schließen dieser Blende keine Abnahme der Bildhelligkeit, sondern eine Reduzierung des ausgeleuchteten Bereichs im mikroskopischen Endbild. Durch die Leuchtfeldblende lassen sich somit folgende Einstellungen vornehmen: Im Präparat kann gerade der beobachtete Ausschnitt beleuchtet werden. Dadurch wird das Präparat außerhalb des beobachteten Bereichs vor der starken Beleuchtungsstrahlung geschützt. Die Entstehung von kontrastminderndem Falschlicht wird reduziert.
Das Objektiv sorgt für die erste Vergrößerungsstufe, in der ein vergrößertes, seitenverkehrtes, reelles Zwischenbild entsteht. Dieses wird mit dem Okular (welches die Lupe darstellt) nochmals vergrößert und führt nun zu einem virtuellen Endbild.
Die Maßstabszahl des Objektivs gibt an, wie stark die Vergrößerung im Zwischenbild ausfällt (z.B. 40). Das Zwischenbild wird dann durch das Okular nachvergrößert (z.B. 10). Für die Gesamtvergrößerung ergibt sich nach folgender Formel:

VM = VOb x VOk
VM = 40 x 10 = 400

Wellenoptik

Licht besitzt den Charakter von Wellenzügen. Die Helligkeit des Lichts wird dabei durch die Amplitude der Welle bestimmt. Betrachtet man einen Punkt auf einer Lichtwelle, so befindet sich dieser auf einer bestimmten Phase des Wellenzuges. Wellenbewegung wird beim Aufeinandertreffen zweier Wellenberge am Treffpunkt maximal verstärkt und beim Zusammenkommen eines Wellentals mit einem Wellenberg scheinbar gelöscht. Bei Wellenbewegungen tritt unter bestimmten Voraussetzungen Beugung auf.
Eine Wellenfront trifft auf einen schmalen Spalt (Objekt) und wird gebeugt. Aus dem Spalt tritt eine Kugelwelle aus, welche aus untereinander parallelen Strahlen besteht. Diese nehmen einen bestimmten Winkel (β) zum direkten Mikroskopierlicht ein. Nach dem Huygensschen Prinzip ist jeder Punkt einer bestehenden Wellenfront Ausgangspunkt einer neuen kugelförmigen Elementarwelle, die die gleiche Ausbreitungsgeschwindigkeit und Frequenz wie die ursprüngliche Welle hat. Treten diese Strahlen in ein Mikroskopobjektiv ein, so werden sie in der Brennebene vereinigt und es kommt zur Interferenz zwischen den Wellenzügen. Da die Strahlen alle phasengleich sind, kommt es zu einem Maximum 0.Ordnung (max. Verstärkung, max. Helligkeit). Lichtwellen die bei einer Phasendifferenz von einer halben Wellenlänge interferieren löschen sich gegenseitig aus. Im Bereich der Objektivbrennebene entsteht ein Minimum (Dunkelheit). Wenn der Winkel β weiter zunimmt, so nimmt auch der Gangunterschied zwischen den Strahlen zu. Durch Interferenz entsteht bei einer Phasendifferenz von 1,5 Wellenlängen ein weiteres, aber weniger helles Maximum (Nebenmaximum). Durch die Verteilung von hellen und dunklen Zonen in der Brennebene des Objektivs entsteht eine Beugungsfigur. Sie ist für jedes Präparat charakteristisch und wird nach der Theorie der sekundären Abbildung von Ernst Abbe als primäres Zwischenbild bezeichnet.

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