Aus der Universitätsklinik für Anästhesiologie Heidelberg
( Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. E. Martin )

Der Einfluß des Radikal-Scavengers U74006F auf Mikrozirkulation,
Leukozytenadhärenz und Plasmaextravasation im Mesenterium der Ratte
-Eine intravitalmikroskopische Studie-

Inauguraldissertation
zur Erlangung des medizinischen Doktorgrades
der
Medizinischen Fakultät Heidelberg
der
Ruprecht-Karls-Universität

vorgelegt von
Thomas Müller

aus
Wolgograd

1999

Dekan: Prof. Dr.med. Dr. h.c. H.G. Sonntag
Referent: Priv.-Doz. Dr.med. H. Schmidt

INHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung ... 1
    1.1 Denotation und klinische Bedeutung: Sepsis, SIRS, MODS ... 1
    1.2 Intestinale Mikrozirkulation bei Endotoxinämie ... 2
    1.3 Sauerstoffradikale in der Pathogenese der Sepsis ... 6
    1.4 U74006F - ein experimenteller Ansatz zur Sepsistherapie ... 7
    1.5 Fragestellung der Arbeit ... 8

2 Material und Methodik ... 10
    2.1 Versuchstiere ... 10
    2.2 Chirurgische Eingriffe und Anästhesie ... 10
        2.2.1 Implantation der intravasalen Katheter und Tracheotomie ... 10
        2.2.2 Präparation des Mesenteriums ... 11
        2.2.3 Induktion der Endotoxinämie ... 12
    2.3 Technischer Versuchsaufbau ... 13
        2.3.1 Experimentelles Monitoring ... 13
        2.3.2 Intravitale Fluoreszenzmikroskopie und Videotechnik ... 13
        2.3.3 Auswerteeinheit ... 14
    2.4 Meßverfahren für die Mikrozirkulation ... 15
        2.4.1 Messung der Erythrozytengeschwindigkeit ... 15
        2.4.2 Leukozyten-Endothel-Interaktionen ... 18
        2.4.3 Quantifizierung der Plasmaextravasation und der Gefäßdurchmesser ... 19
        2.4.4 Hämatologische Parameter und Säure-Basen-Haushalt ... 20
    2.5 Versuchsdesign ... 20
    2.6 Statistische Analyse ... 21

3 Ergebnisse ... 22
    3.1 Hämodynamische Parameter/ Vitalwerte ... 22
        3.1.1 Arterieller Mitteldruck ... 22
        3.1.2 Herzfrequenz ... 23
        3.1.3 Atemfrequenz ... 24
        3.1.4 Erythrozytengeschwindigkeit ... 25
        3.1.5 Gefäßdurchmesser ... 26
        3.1.6 Volumetrischer Blutstrom ... 27
        3.1.7 Wandscherraten ("shear forces") ... 28
    3.2 Leukozyten-Endothel-Interaktionen ... 29
        3.2.1 Leukozytenadhärenz ... 29
        3.2.2 Leukozytenemigration ... 30
        3.2.3 Extravasation von FITC-markiertem Albumin ... 31
    3.3 Hämatologische Analysen ... 32
        3.3.1 Systemische Leukozytenzählung ... 32
        3.3.2 Systemische Thrombozytenzahl ... 33
        3.3.3 Hämoglobin, Hämatokrit, Erythrozytenzahl ... 34
    3.4 Blutgasanalyse und Säure-Base-Status ... 34
        3.4.1 pH-Werte ... 34
        3.4.2 Arterieller Sauerstoffpartialdruck ... 35
        3.4.3 Arterieller Kohlendioxid-Partialdruck ... 36

4 Diskussion ... 37
    4.1 Kritik von Methodik und Materialien ... 37
    4.2 Diskussion der Ergebnisse ... 39
        4.2.1 Hämodynamik/ Vitalwerte ... 39
        4.2.2 Leukozyten-Endothel-Interaktion ... 40
        4.2.3 Plasmaextravasation (capillary leak) ... 44
        4.2.4 Hämatologische Veränderungen ... 46
        4.2.5 Blutgasanalyse und Säure-Basen-Haushalt ... 47

5 Zusammenfassung ... 48

6 Literaturverzeichnis ... 49

7 Lebenslauf ... 79

8 Danksagung ... 81

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

[...]

1 EINLEITUNG
1.1 Denotation und klinische Bedeutung: Sepsis, SIRS, MODS
Entzündungsreaktionen sind komplexe Antworten des Organismus auf verschiedenste endo- und exogene Noxen und Traumata. In Abhängigkeit von Dauer und Stärke der Noxe oder des Traumas sowie der Immunlage des Patienten kann sich dieser Zustand in systemischem Ausmaß manifestieren. Dieser Status der "Ganzkörperentzündung" ist ein kongruentes klinisches Syndrom verschiedenster Ätiologien. So können ausgedehnte Ischämien, hämorrhagischer Schock, Pankreatitis, Polytrauma und Verbrennung ebenso wie verschiedene Infektionen (bakteriell, viral, parasitär) ab einem bestimmten Ausmaß zu einem ähnlichen oder sogar identischen klinischen Bild führen. Dieser stereotype Symptomenkomplex geht von einer exzessiven und inadäquaten Produktion von Entzündungsmediatoren durch aktivierte Leukozyten aus und wird nach neuester, international gültiger Definition, unabhängig von der Ursache, als SIRS (systemic inflammatory response syndrome) bezeichnet [Bone et al. 1992]. Die bisherige Uneinigkeit über das Krankheitsbild "Sepsis" und seine Einschlußkriterien drückt sich unter anderem in international äußerst divergierenden Angaben zu Inzidenz und Mortalität aus. Daher wurde eine neue und differenzierte Begriffsbestimmung notwendig. Die Sepsis versteht sich nach dieser Definition der American Thoracic Society und der Society of Critical Care Medicine als Systemantwort auf eine Infektion und ist Teilbereich des SIRS. Einschlußkriterien sind Hypo- oder Hyperthermie, Tachykardie, Hyperventilation und Leukozytose/Leukopenie, wobei zwei oder mehr Merkmale zutreffen müssen. Die Sepsis dient exemplarisch vielen experimentellen Modellen zur Erforschung der wahrscheinlich gemeinsamen Pathogenese und Pathophysiologie des SIRS. Es bestehen hierbei keine klinischen, morphologischen oder biochemischen Unterschiede zwischen Patienten mit Sepsis (septischer Fokus und Bakteriämie) und SIRS (kein Fokus, keine Bakteriämie) [Nast-Kolb et al. 1991; Goris et al. 1985].
Infektionen und die daraus resultierenden systemischen Reaktionen des Körpers stellen immer noch eine der wichtigsten Ursachen nosokomialer Morbidität und Mortalität vor allem chirurgischer Patienten dar [Madoff et al. 1985]. In Industriestaaten entwickeln 5 bis 8 von 1000 hospitalisierten Patienten eine Sepsis [Martin 1991; Lode et al. 1989; Lode et al. 1983]. Die Prävalenz bei Intensivpatienten liegt angesichts der meist schwerwiegenden Grundkrankheit und der bekannten Infektgefährdung kritisch Kranker höher und wird in der Literatur zwischen 3 % und 24 % [Brun-Buisson et al. 1995; Rangel-Frausto et al. 1995; Dragsted und Quvist 1989; Hennemann 1985], in einem Fall sogar mit 49 % [Pittet et al. 1995] angegeben . Trotz neu entwickelter Antibiotika-Produkte und progressiver Technik auf den Intensivstationen konnte die Mortalität der Sepsis in den letzten 30 Jahren nicht wesentlich gesenkt werden und liegt unverändert bei 10 bis 20 %, im Fall des septischen Schocks bei über 60 % [Gomez et al. 1995; McLauchlan et al. 1995; Ziegler et al. 1991; Centers for Disease Control 1990; Lode et al. 1989]. Die hohe Mortalität steht dabei nur mittelbar in Zusammenhang mit dem auslösenden Ereignis, da dieses mittlerweile durch intensive Therapie oft rasch beherrscht wird. Ebenso gibt es keine Korrelation mit dem Vorhandensein einer Bakteriämie - Patienten im SIRS mit positiven, respektive negativen Blutkulturen haben gleiche Mortalitätsraten - sondern es ist hauptsächlich bedingt durch das Ausmaß der konsekutiven Organschäden [Brun-Buisson et al. 1995; Lode et al. 1989; Ponting et al. 1987; Goris et al. 1985]. Mit einer gewissen Latenz können sich Aktivierungs- und Kaskadensysteme verselbständigen und zur Insuffizienz einzelner Organe wie Lunge (ARDS), Niere und Leber sowie konsekutiv zum Versagen ganzer Organsysteme führen (Multiple organ failure - MOF, neuerdings MODS - Multiple organ dysfunction syndrome) [Bone et al. 1992]. Diese gefürchtete Komplikation ist mit einer Letalität von 30 bis 100 % die Haupttodesursache allgemeinchirurgischer und traumatologischer Patienten unter Intensivtherapie [Deitch 1992b; Ruokonen et al. 1991b; Goris et al. 1985b].
Gegenwärtig ist das Verhältnis von grampositiven zu gramnegativen Keimen etwa ausgeglichen, während noch vor 30 Jahren grampositive Erreger eindeutig dominant waren. Gleichzeitig nehmen nosokomiale Infektionen durch Erreger wie koagulasenegative Staphylokokken, methicillinresistenter Staph. aureus (MRSA) und Enterokokken weltweit zu [Wildmer 1994].

1.2 Intestinale Mikrozirkulation bei Endotoxinämie
Man geht heute davon aus, daß für die Entwicklung des MODS primär Alterationen im Bereich der Mikrozirkulation pathogenetisch sind [Vollmar et al. 1993]. Diese können klinisch über die Normalisierung makrohämodynamischer Parameter hinaus andauern und durch direkte Effekte auf die zelluläre Ebene das Parenchym schädigen [Mebmer und Kreimeier 1989].
Eine besondere Rolle in der Entstehung dieses Organschadens kommt dabei den Leukozyten zu. Durch R. J. H. Dutrochet (1824) und W. Addison (1843) wurde erstmals beschrieben, daß einige zirkulierende weiße Blutzellen die Tendenz zeigen, an Wänden von Blutgefäßen zu haften, und daß sich die Zahl dieser adhärenten Zellen bei entzündlichen Prozessen stark erhöht [Grant 1973]. Die enorme pathologische Bedeutung, die den Leukozyten neben ihrer Rolle in der Infektabwehr für die Entwicklung einer systemischen Entzündungsreaktion (SIRS) zukommt, ist jedoch erst seit einiger Zeit in den Mittelpunkt der Sepsisforschung gerückt. Deutlich wird ihre Rolle für die Entwicklung eines MODS in Studien, welche aufzeigen, daß durch blockierte Leukozytenadhärenz, entweder durch genetischen Adhäsionsmolekülmangel [Xu et al. 1994] oder durch experimentelle Leukopenie [Heath et al. 1986; Shasby et al. 1982; Flick et al. 1981; Heflin und Brigham 1981] ein Organschaden verhindert werden kann. Weiterhin belegen Studien mit der endotoxinresistenten C3H/HeJ-Maus, daß ein Endotoxinschock ohne Zellen der hämatopoetischen Stammreihe nicht enstehen kann [Michalek et al. 1980]. Diese genmutierten Tiere mit einer LPS-Insensitivität überleben die Applikation immenser Endotoxindosen, erlangen jedoch wieder normale LPS-Sensitivität, wenn ihnen Knochenmark "gesunder", endotoxinempfindlicher Mäuse transplantiert wird [Ross et al. 1985; Watson et al. 1977].
Um ihre Aufgaben in der Infektabwehr zu erfüllen, sind Leukozyten mit einer Anzahl von bakteriziden Mechanismen ausgestattet, die es ihnen ermöglichen, eine große Anzahl inflammatorischer Mediatoren wie vasoaktive Substanzen, Peptide, Proteasen und reaktive Sauerstoffspezies zu generieren und freizusetzen [Fujishima und Aikawa 1995; Weiss 1989]. Den Leukozyten ist es möglich, die Gefäße zu verlassen [Harlan 1985] und auch im angrenzenden Gewebe ihrer Phagozytose-Tätigkeit nachzukommen. Dafür bedarf es zunächst jedoch einer Aktivierung von Endothelzellen und Leukozyten (PMN) zur Exprimierung von Adhäsionsmolekülen. Neben Zytokinen, vor allem TNF-a [Djeu et al. 1990], Komplementkomponenten, insbesondere C5a [Thijs und Hack 1992], und Platelet Activating Factor (PAF) können auch mikrobakterielle Toxine (z.B. Peptoglykan von grampositiven Bakterien) diese Reaktion auslösen. Letztlich ist das Lipopolysaccharid (LPS) aus der Membran gramnegativer Bakterien (Endotoxin) jedoch einer der potentesten Trigger für diese Stimulation [Guthrie et al. 1984; Dahinden et al. 1983].
Endotoxin (ETX) ist ein thermostabiler Lipoprotein-Carbohydrat-Komplex und bewirkt neben direkten Schäden am Endothel [Meyrick et al. 1986] eine Anregung von Monozyten und Makrophagen zur Freisetzung von Mediatoren [Michie et al. 1988]. Es wird entweder spontan durch Bakterien abgegeben [Andersen und Solberg 1984] oder infolge der Zellysis (z.B. durch Antibiotika) freigesetzt [Cohen und McConnell 1985]. Der Mechanismus der Erkennung von LPS weicht dabei vom üblichen "Ligand-Rezeptor"-Modell ab, da ein Plasmaprotein und ein Plasma/Membranglykoprotein involviert sind. Die Bindung von Endotoxin erfolgt dabei durch LPS-bindende Proteine (LBP), mit denen es Komplexe formt, an das membrangebundene Antigen (m)CD14 auf der Zelloberfläche von Makrophagen, Monozyten und stimulierten segmentkernigen Leukozyten [Schuman et al. 1990; Wright et al. 1990] sowie an den löslichen CD14-Rezeptor (sCD14) im Plasma [Wright 1995; Schütt und Schumann 1993; Schuman et al. 1990]. LBP in seiner Funktion wirkt dabei eher katalytisch für den Transport: LPS bindet an sCD14 auch in Abwesenheit von LBP [Sundan et al. 1994], jedoch mit viel geringerer Affinität. LPS-bindende Proteine fungieren auch als Opsonine - sie binden an die Oberfläche von Bakterien oder an LPS-beschichtete Erythrozyten und steuern so die Adhäsion dieser Partikel an Makrophagen [Wright et al. 1989]. Ob ohne Transportproteine oder beschleunigt durch LBP - die Komplexbildung von CD14 und LPS führt in jedem Fall zu einer Aktivierung der monocytären Zelle und veranlaßt diese zur weiteren Produktion proinflammatorischer Mediatoren wie Zytokine (TNF-a, Il-1, Il-6), Eicosanoide, Komplementfaktoren, PAF, Phospholipase A2, freien Sauerstoffradikalen [Schütt und Schumann 1993; Wright et al. 1990] und Adhäsionsmolekülen. Endothelzellen exprimieren zwar kein CD14 auf ihrer Oberfläche, reagieren dennoch genauso auf eine LPS-Exposition mit der Bildung von Adhäsionsmolekülen [Dustin und Springer 1988] sowie mit der Sekretion von Mediatoren [Jirik et al. 1989; Libby et al. 1986]. Für diese Immunantwort der Endothelzellen auf Endotoxin scheint das lösliche CD14 (sCD14) essentiell zu sein [Arditi et al. 1993].
Eine normale Leukozytenfunktion erfordert die Membranadhäsion an verschiedene Zellen und Gewebekomponenten. Adhäsion ist notwendig für Migration, Phagozytose, Emigration aus dem hämatopoetischen Pool, Anheftung an postkapilläre Venolen sowie Leukozyt-Leukozyt und Leukozyt-Thrombozyt-Aggregation. Durch Untersuchungen an Patienten mit einem bestimmten genetischen Proteindefekt wurden eine Anzahl heterodimerer Glykoproteine entdeckt, die für eine Adhärenz essentiell sind [Harlan 1985; Ross et al. 1985].
Adhäsionsmoleküle können sowohl auf aktivierten Leukozyten als auch auf Endothelzellen exprimiert werden. Dabei sind drei Klassen von Adhäsionsmolekülen für Leukozyten-Endothel-Interaktionen bedeutend:
Selektine findet man sowohl auf Leukozyten, als auch auf Endothelzellen. Es können drei Unterklassen differenziert werden: E-Selektin (ELAM-1, CD62E), ein endotheliales Selektin, wird durch Stimuli wie TNF-a, IL-1 und Endotoxin exprimiert und ist von einer de novo-Proteinsynthese abhängig. P-Selektin (CD62P,PADGEM,GMP-140) findet man auf Thrombozyten [Stenberg et al. 1985; Hsu-Lin et al. 1984] sowie in den Weibel-Palade-Körperchen von Endothelzellen [Bonfanti et al. 1989; McEver et al. 1989]. Von dort kann es nach entsprechender Stimulation (Histamin, TNF-a) schnell an die Zelloberfläche freigesetzt werden und zur Adhäsion von PMN beitragen [Patel et al. 1991; Geng et al. 1990]. L-Selektin (CD62L, LECAM-1) ist auf den meisten Lymphozyten, Neutrophilen und Monozyten präsent und hat besondere Bedeutung für frühe Stadien der PMN-Adhäsion. Da L-Selektin nach initialer Aktivierung wieder durch Proteolyse abgestoßen werden kann, ist nach erfolgter Adhäsion eine erneute Ablösung der PMN vom Endothel möglich [Talbott et al. 1994; Berg und James 1990].
Unter dem Einfluß lokal freigesetzter inflammatorischer Mediatoren kommt es zu multiplen Interaktionen der Selektine mit Carbohydrate-Gegenstrukturen und somit zur Verlangsamung vorbeifließender PMN. Zwar sind die Bindungskräfte nur von geringer Affinität, allerdings ist das "rolling" der Leukozyten Voraussetzung für eine feste Adhärenz am Endothel, für die die Gruppe der Integrine bedeutsam ist [Ley et al. 1997; Talbott et al. 1994; Andrian von et al. 1991]. Die Integrine sind eine Gruppe von Transmembran-Proteinen und befinden sich auf der Oberfläche von allen Leukozyten. Sie besitzen eine gemeinsame b-Einheit und variable a-Einheiten. Momentan sind 8 b- und 15 a-Subeinheiten bekannt [Talbott et al. 1994]. Die wichtigsten Integrine für die Adhärenz von PMN am Endothel sind die b2-Integrine, die aus der gemeinsamen b-Untereinheit (CD18) und einer der drei a-Untereinheiten (CD11a, CD11b, CD11c) bestehen und somit ab-Heterodimere bilden. Dabei spielt der CD11b/CD18-Komplex die zentrale Rolle für die Leukozyten-Endothel-Interaktion, da aktivierte Leukozyten von diesem im Vergleich zu den beiden anderen Antigenen um Zehnerpotenzen mehr exprimieren. Er findet sich vor allem auf PMN, Monozyten und natural killer cells [Arnaout 1990]. Die Liganden für die leukozytären Integrine auf den Endothelzellen und damit dritte Gruppe von Adhäsionsmolekülen sind die Proteine der Immunoglobulin-Gruppe und zwar ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) und PECAM-1 (plateletendothelial cell adhesion molecule, CD31). Die Exprimierungsrate dieser Proteine steigt unter dem Einfluß inflammatorischer Stimuli (Endotoxin, TNF, IL-1, IF) stark an. ICAM-1 ist Ligand für CD11a/CD18 und CD11b/CD18, während ICAM-2 nur mit CD11a/CD18 bindet. ICAM-1 und ICAM-2 sind bedeutsam für Adhäsion und Emigration von Neutrophilen [Smith et al. 1988], während PECAM-1 die transendotheliale Migration von adhärenten PMN in vitro und in vivo erleichtern soll [Müller et al. 1993; Vaporciyan et al. 1993].
Neben hämodynamischen Veränderungen, die zur Abnahme der Wandscherraten insbesondere in postkapillären Venolen führen, ist es vor allem die Exprimierung von Adhäsionsmolekülen auf PMN und Endothelzellen, welche eine Margination von zumeist polymorphnukleären Neutrophilen (PMN) verursacht [Tangelder et al. 1995]. Physiologischerweise kommt es durch die verlangsamte Fließgeschwindigkeit in Venolen gelegentlich zur lockeren Adhärenz ("rolling"), aber nur selten zum manifesten Anheften ("sticking") dieser Leukozyten an das Endothel der Gefäße. Diese Adhärenz ist jedoch zufällig und eine normale Leukozytenfunktion erfordert diese Membranadhäsion an andere Zellen (Leukozyt-Leukozyt, Leukozyt-Thrombozyt) sowie an Gewebebestandteile. Sie ist Bedingung für Phagozytose und Emigration und somit essentiell für die immunologische und antimikrobielle Tätigkeit der Granulozyten. Im Rahmen des SIRS versagt jedoch diese Regulation und es kommt zur massiven Adhärenz von PMN am Endothel. Diese überschießende, inadäqate Aktivierung resultiert in einer enormen Steigerung des O2-Verbrauchs ("respiratory burst") und der Produktion von reaktiven Sauerstoffverbindungen [Kurose et al. 1993; Redl et al. 1993; Clark 1990] sowie Mediatoren und zytotoxischen Substanzen, die als hauptverantwortlich für den sepsisbedingten Endothelschaden gelten. Sie werden aus den granulozytären Lysosomen durch Exozytose in das extrazelluläre Milieu [Fujishima und Aikawa 1995; Weiss 1989] und durch die Haftung an der Gefäßwand unmittelbar an den Endothelzellen freigesetzt. Für den resultierenden Zellschaden sind dabei primär zwei Klassen von leukozytären Inhaltsstoffen relevant: proteolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffverbindungen [Weiss 1989]. Die freigesetzten Produkte des Arachidonsäurewegs führen zur Adhärenz -"sticking"- von weiteren Zellen [Gurtner und Burke-Wolin 1991], so daß letztlich ein circulus vitiosus entsteht.
Daß bei diesem komplexen klinischen Bild Antibiotika nur in einzelnen Fällen (nachgewiesene Infektion als Ursache des SIRS) und auch dann nur bedingt (Freisetzung von Endotoxin in großen Mengen durch Antibiotikainduzierte Bakteriolyse) nützlich sind, gilt als erwiesen [Dofferhoff und Buys 1995].
Seit einiger Zeit konzentriert sich die Sepsisforschung daher auf Therapieansätze in der Immun- und Mediatormodulation.

1.3 Sauerstoffradikale in der Pathogenese der Sepsis
Zu den prinzipiellen Mechanismen, mit denen Granulozyten im Rahmen akuter inflammatorischer Reaktionen zum Gewebeschaden beitragen, zählt neben der extrazellulären Sekretion lysosomaler Enzyme [Harlan 1985] auch die Produktion reaktiver Sauerstoffradikale. Diese werden im Verlauf entzündlicher Prozesse aus aktivierten neutrophilen Granulozyten freigesetzt und ihre Quantität ist so z.B. bei septischen Patienten stark erhöht [Machiedo et al. 1989; Takeda et al. 1984]. Die mehrfach ungesättigten W-6- und W-3-Fettsäuren (PUFA) von Biomembranen sind sensitive Angriffspunkte für die hochreaktiven Sauerstoffradikale und können durch diese in einer Kettenreaktion degeneriert werden (Lipidperoxidation). Die Integrität der Endothelmembranen wird dadurch derart verändert, daß ein lokales kapilläres Leck mit Austritt von Granulozyten (Migration), Flüssigkeit und Makromolekülen in das Interstitium entsteht [Weiss 1989; Shasby et al. 1983]. Die Folge ist ein Zellschaden in primär nicht infiziertem Gewebe und später das Versagen von multiplen Organen [Lehr und Arfors 1994; Hernandez et al. 1987]. Der Zytotoxizität von Sauerstoffradikalen steht in vivo eine Anzahl von körpereigenen protektiven Mechanismen und Substanzen wie Glutathion, a-Tocopherol, Ascorbinsäure und anderen intrazellulären antioxidativen Substanzen [Hoover et al. 1988] oder der Scavenging-Effekt von Erythrozyten [Forslid et al. 1989] gegenüber, so daß Gewebeschäden durch Radikale letztlich das Ergebnis einer Imbalance zwischen prooxidativen und antioxidativen Substanzen sind.
Vorläufer dieser hochreaktiven Oxidantien ist das Superoxid-Radikal (O2-), welches vor allem während der Reaktion von Hypoxanthin zu Xanthin durch die Xanthin-Oxidase entsteht und physiologischerweise auch von Endothelzellen in geringem Ausmaß produziert wird [Ratych et al. 1987].

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