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ELISA Enzyme Linked Immun Sorbent Assay

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Title: ELISA Enzyme Linked Immun Sorbent Assay ()

ELISA Enzyme Linked Immun Sorbent Assay

Script, 1999, 22 Pages
Authors: Nicole Remesch, Sabine KOLB
Subject: Chemistry

Details

Tags: ELISA, Enzyme, Linked, Immun, Sorbent, Assay

Category: Script
Year: 1999
Pages: 22
Grade: 1
Language: German

Archive No.: V98480
ISBN (E-book): 978-3-638-96931-4

File size: 267 KB

Fulltext (computer-generated)

Nicole REMESCH / Sabine KOLB
4 HB
durchgeführt von 17.02.1999 bis 25.03.1999

E L I S A

Enzyme Linked Immun Sorbent Assay

INHALTSVERZEICHNIS

1. Prinzip und Aufgabenstellung 36

1.1. Prinzip 36
1.2. Aufgabenstellung 36

2. Materialien 37

2.1. Reagentien 37
2.2. Lösungen 37
2.3. Geräte 38

3. Methodik 39

3.1. Inkubieren der Microtiterplatte 39
3.2. Waschen 39
3.3. Blockieren 39
3.4. Waschen 39
3.5. Primärer Antikörper 40
3.6. Waschen 40
3.7. Sekundärer Antikörper 40
3.8. Waschen 40
3.9. Färben 40

4. Durchführung 41

4.1. 1. Versuch 41
4.1.1. Inkubieren der Microtiterplatte
4.1.1.2. Blockieren 41
4.1.3. Primärer Antikörper 41
4.1.4. Färben 42
4.1.5. Anmerkung 42

4.2. 2. Versuch 42
4.2.1. Inkubieren der Microtiterplatte 42
4.2.2. Primärer Antikörper 43
4.2.3. Anmerkung 43

4.3. 3. Versuch 43
4.3.1. Inkubieren der Microtiterplatte 43
4.3.2. Waschen 44
4.3.3. Blockieren 45
4.3.4. Primärer Antikörper 46
4.3.5. Sekundärer Antikörper 47

5. Ergebnisse 48

5.1. 1. Versuch 48
5.2. 2. Versuch 48
5.3. 3. Versuch 48

6. Diskussion 49

6.1. 1. Versuch 49
6.2. 2. Versuch 49
6.3. 3. Versuch 50

7. Literatur 51

Abkürzungen 52

Anhang 53

Abb.: ELISA - Gerät mit Drucker 53

Ausdrucke: 1. Versuch 54 - 56

Ausdrucke: 2. Versuch 57 - 63

Ausdrucke: 3. Versuch: 64 - 75

1. ELISA - Platte 64 - 69

2. ELISA - Platte 70 - 75

1. Prinzip und Aufgabenstellung

1.1. Prinzip

Der ELISA ist ein oft (v.a. in Reihentests) angewandter Immunassay, mit dessen Hilfe die Konzentration eines Antikörpers bzw. Antigens in einer Lösung
(z.B. Serum, Urin, Zellkulturüberstand) bestimmt werden kann.

Einer der miteinander reagierenden Stoffe ist dabei mit einem Enzym markiert, das einen kolorimetrischen Nachweis erlaubt (üblicherweise Alkalische Phosphatase oder Peroxidase).

Beim indirekten ELISA werden die Mikrotiterplatten mit Antigen beschichtet und dann die Probe hinzugefügt. Der gebundene Antikörper wird anschließend durch Zugabe eines enzymmarkierten Antikörpers, der spezifisch für den gebundenen Antikörper ist, nachgewiesen.

Dieser enzymmarkierte Antikörper wird als Detektorantikörper bezeichnet.

1.2. Aufgabenstellung

Es wurde versucht, eine von einem Gaststudenten (Assistenten) erarbeitete ELISA - Vorschrift nachzuarbeiten.

Die Versuche sollen die Spezifität der aus Hühnereiern gewonnenen Antikörper überprüfen, sowie den zukünftigen Einsatz des Testverfahrens zur quantitativen Antigenbestimmung etablieren.

Dazu sollte der Test vorher mit Referenz - Antikörpern (IgY x SSA; IgY x RSA) optimiert werden.

2. Materialien

2.1. Reagentien

Rinderserumalbumin; Boehringer Mannheim GmbH, Nr. 735 078
Tween 20; Merck
Casein nach Hammersten; Merck, Nr. 2242
NaOH 2 M
Antikörper IgY x RSA, Fraktion 9/5
Antikörper IgY x SSA, Fraktion 10/5
Enzymgekoppelter Antikörper Rabbit x Chicken IgG, ALP; Sigma, Nr. 18H4829
SIGMA FAST pNPP Substrat Tabletten Set; Sigma, Nr. N-2770
Deionat

2.2. Lösungen

PBS-Puffer 0,1 M pH 7,5 (vom Assistenten übernommen)

PBS-Puffer 0,05 M pH 7,5 (vom Assistenten übernommen)

Na₂CO₃-Puffer 0,05 M pH 9,6 (vom Assistenten übernommen)

(Der Na₂CO₃-Puffer 0,05 M hatte einen pH von 8,7 und wurde mit NaOH auf 9,6 eingestellt.)

Schweineserumalbuminlösung 10,7 mg/l (vom Assistenten übernommen)

Standards: Es werden 10 Standards mit den Konzentrationen zwischen 10,7 mg/l SSA und 1,7 mg/l SSA (mit Na₂CO₃-Puffer verdünnt) hergestellt.

Rinderserumalbuminlösung 10,4 mg/l

10,4 mg RSA in 100 ml Na₂CO₃-Puffer lösen und dann 1:10 verdünnen
(jeweils Schaumbildung → wurde nicht berücksichtigt).

Standards: Es werden 10 Standards mit den Konzentrationen zwischen 10,4 mg/l RSA und 1,4 mg/l RSA (mit Na₂CO₃-Puffer verdünnt) hergestellt.

Caseinlösung

10 mg Casein in 10 ml PBS-Puffer 0,05 M lösen (Schaumbldg.).

Antikörperlösungen

je 10 _l Antikörper in 10 ml PBS-Puffer 0,1 M (Verdünnung: 1: 1000) lösen (Schaumbldg.).

Antikörperlösungen + Casein

je 10 _l Antikörper in 10 ml PBS-Puffer 0,1 M (Verdünnung: 1: 1000) lösen und 10 mg Casein (1 mg/ml) zugeben (Schaumbldg.).

Färbelösung

Lösen der pNPP- und Tris-Puffer-Tabletten in 20 ml Deionat.

Waschlösung

0,025 ml Tween 20 in 50 ml PBS-Puffer 0,05 M lösen (Schaumbldg.).

2.3. Geräte

Microtiterplatten, Nunc Maxi Sorp 12 x 8
Reader 400 SF plus, mit 405 nm Filter
Wägeschiffchen
200 _l Kolbenhubpipette (verstellbar) + Spitzen
30 - 300 _l Kolbenhubpipette, 12 channel + Spitzen
ELISA-Plastikrahmen
ELISA-Microtiterstreifen
5 ml Glasreagenzgläser
Meßkolben 10 ml, 50 ml,100 ml
Vakuumpumpe
Brutschrank für 30°C und 37°C

3. Methodik

3.1. Inkubieren der Microtiterplatte

Die Microtiterplatte wird mit je 100 µl Standard inkubiert.
Die Platte wird nun für 24 Stunden bei 4°C erschütterungsfrei stehengelassen.
Die spezifischen Antigene binden an das starre Polystyrol.

3.2. Waschen

Lösungen mit einer an eine Vakuumpumpe angeschlossenen Pipettenspitze absaugen, 150 µl Waschlösung in die ,,wells" geben und Flüssigkeit wieder absaugen; Vorgang 5 mal wiederholen.

Bei diesem Vorgang werden die nicht gebundenen Antigene, Antikörper und nicht gebundenes Casein ausgewaschen. Gutes Waschen der ELISA - Platte gibt gute Signale, bei zuviel waschen riskiert man aber das Herunterlösen der bereits gebundenen Stoffe.

3.3. Blockieren

Je 100 µl Caseinlsg einfüllen und 2 Stunden bei 37°C stehenlassen.

Das Casein bindet an die noch freien Stellen der Mikrotiterplatte, dadurch soll eine mögliche Background-Bindung des Antikörpers vermieden oder zumindest niedrig gehalten werden.

3.4. Waschen (siehe 3.2.)

3.5. Primärer Antikörper

Nun werden je well 100 µl des 1. Antikörpers einpipettiert und für 24 Stunden bei 4°C stehengelassen.

Der Antikörper bindet an das Antigen.

3.6. Waschen (siehe 3.2.)

3.7. Sekundärer Antikörper

100 µl des sekundären Antikörpers in alle wells füllen und 2 Stunden bei 37°C stehenlassen.

Der Antikörper, der mit dem Enzym Alkalische Phosphatase markiert ist , bindet an den Antikörper, der bereits an das Antigen gebunden hat.

3.8. Waschen (siehe 3.2.)

3.9. Färben

200 µl der Färbelösung zugeben und in 5 min - Abständen die Extinktionen bei 405 nm messen.

Das Enzym Alkalische Phosphatase spaltet das pNPP in das gelbe Endprodukt p-Nitrophenol. Die Konzentration (Intensität) des entstehenden Farbstoffs läßt Rückschlüsse auf die ursprüngliche Konzentration des gesuchten Antikörpers zu.

4. Durchführung

4.1. 1. Versuch (durchgeführt am 17., 18., 23. und 24. 03. 1999)

4.1.1. Inkubieren der Microtiterplatte

^{RSA
1,4 mg/l}

^{RSA
2,4 mg/l}

^{RSA
3,4 mg/l}

^{RSA
4,4 mg/l}

^{RSA
5,4 mg/l}

^{RSA
6,4 mg/l}

^{RSA
7,4 mg/l}

^{RSA
8,4 mg/l}

^{RSA
9,4 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{RSA
2,4 mg/l}

^{RSA
3,4 mg/l}

^{RSA
4,4 mg/l}

^{RSA
5,4 mg/l}

^{RSA
6,4 mg/l}

^{RSA
7,4 mg/l}

^{RSA
8,4 mg/l}

^{RSA
9,4 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{SSA
2,7 mg/l}

^{SSA
3,7 mg/l}

^{SSA
4,7 mg/l}

^{SSA
5,7 mg/l}

^{SSA
6,7 mg/l}

^{SSA
7,7 mg/l}

^{SSA
8,7 mg/l}

^{SSA
9,7 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{SSA
2,7 mg/l}

^{SSA
3,7 mg/l}

^{SSA
4,7 mg/l}

^{SSA
5,7 mg/l}

^{SSA
6,7 mg/l}

^{SSA
7,7 mg/l}

^{SSA
8,7 mg/l}

^{SSA
9,7 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

⁴

⁵

⁶

⁷

⁸

⁹

¹⁰

¹¹

¹²

In den Reihen A und B wurden die RSA-Standards und in C und D die SSA-Standards aufgetragen (von 2 bis 11 in steigender Konzentration); in den Spalten 1 und 12 wurde Na₂CO₃-Puffer gefüllt (=Blindwert).

4.1.2. Blockieren

Die Platte wurde mit der Caseinlsg. bis zum nächsten Arbeitstag bei 4°C stehengelassen.

Vor dem nächsten Schritt wurde die Platte, nach Rat des Assistenten, eine halbe Stunde in den 37°C Brutschrank gestellt.

4.1.3. Primärer Antikörper

Bei den Reihen A und B wurde der Antikörper gegen Rind eingefüllt, bei C und D der Antikörper gegen Schwein.

4.1.4 Färben

Die Extinktionen wurden nach ca. einer halben Stunde gemessen.

4.1.5. Anmerkung

Beim ersten Versuch wurde für das Einpipettieren von Lösungen ausschließlich die 200_l Kolbenhubpipette verwendet.

4.2. 2. Versuch (durchgeführt am 09., 10. und 11. 03. 1999)

4.2.1. Inkubieren der Mikrotiterplatte

Durch den Einsatz des NUNC - Modul - Systems, das lediglich Streifen á 8 wells (von A nach H) ermöglicht, wurde eine andere Auftragung gewählt.

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
9,4 mg/l}

^{RSA
8,4 mg/l}

^{SSA
9,7 mg/l}

^{SSA
8,7 mg/l}

^{RSA
7,4 mg/l}

^{RSA
6,4 mg/l}

^{SSA
7,7 mg/l}

^{SSA
6,7 mg/l}

^{RSA
5,4 mg/l}

^{RSA
4,4 mg/l}

^{SSA
5,7 mg/l}

^{SSA
4,7 mg/l}

^{RSA
3,4 mg/l}

^{RSA
2,4 mg/l}

^{SSA
3,7 mg/l}

^{SSA
2,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

⁴

⁵

⁶

⁷

⁸

⁹

¹⁰

¹¹

¹²

In den Spalten 1 und 2 wurden die RSA-Standards und in 3 und 4 die SSA-Standards aufgetragen (von G bis B in steigender Konzentration; da aber nur 8 wells zur Verfügung standen, haben wir in den Spalten 1 und 3 die Standards mit den Konzentrationen von 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0, 10.0 mg/l, und in den Spalten 2 und 4 die Standards mit den Konzentrationen von 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 mg/l gegeben); in den Reihen A und H wurde Na₂CO₃-Puffer gefüllt (=Blindwert).

4.2.2. Primärer Antikörper

Bei den Spalten 1 und 2 wurde der Antikörper gegen Rind eingefüllt, bei 3 und 4 der Antikörper gegen Schwein.

4.2.3. Anmerkung

Ab diesem Versuch wurde für das Einpipettieren von Lösungen die 12-Kanal- Kolbenhubpipette verwendet; bei jedem Waschvorgang wurde die Platte auf dem Schüttler geschüttelt und nach jedem Waschvorgang wurde die Waschlsg. zuerst ausgesaugt und anschließend auf einem Küchenrollepapier ausgeklopft.

4.3. 3. Versuch (durchgeführt am 23., 24. und 25. 03. 1999)

4.3.1. Inkubieren der Mikrotiterplatten

^{E. 1}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

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⁵

⁶

⁷

⁸

⁹

¹⁰

¹¹

¹²

⁴

⁵

⁶

⁷

⁸

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¹⁰

¹¹

¹²

^{E. 2}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
10,4 mg/l}

^{SSA
10,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

^{RSA
1,4 mg/l}

^{SSA
1,7 mg/l}

⁴

⁵

⁶

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⁸

⁹

¹⁰

¹¹

¹²

Bei diesem Versuch wurde ein Doppelansatz gemacht.

In den Spalten 1,2,5 und 6 wurden die RSA-Standards und in 3,4,7 und 8 die SSA-Standards aufgetragen (den 10,0 mg/l Standard in den Reihen B-D, und den 1,0 mg/l Standard in den Reihen E-G); in den Reihen A und H wurde Na₂CO₃-Puffer gefüllt (=Blindwert).

4.3.2. Waschen

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⁹

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¹¹

¹²

^{E. 1}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

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⁵

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¹²

^{E. 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

^{WV 2}

^{WV 1}

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¹⁰

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¹²

ELISA 1,2: Spalten 1,2,7,8: Leeren, 150 µl Waschlsg. zugeben, 3 min einweichen lassen, Flüssigkeit aussaugen; Vorgang 3 mal wiederholen und dann Flüssigkeit ausschütteln.

Spalten 3-6: Leeren, 2 x 150 µl Deionat, 1 x 150µl Waschlsg., 2 x 150 µl Deionat und 1 x 150 µl 0,05 M PBS-Puffer zugeben, und jeweils wieder Flüssigkeit aussaugen.

4.3.3. Blockieren

⁴

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^{E. 1}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

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^{E. 2}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

^{B 1h}

^{B 2h}

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ELISA 1,2: Spalten 1,3,5,7: 100 µl Casein zugeben und 1 Stunde bei 37°C stehen lassen.

Spalten 2,4,6,8: 100 µl Casein zugeben und 2 Stunde bei 37°C stehen lassen.

4.3.4. Primärer Antikörper

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^{IA 1}

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^{E. 2}

^{IA 2}

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ELISA 1: Spalten 1,2,5,6: 100 µl des Antikörpers gegen Rind + Casein einpipettieren und für 2 Stunden bei 30°C stehenlassen.

Spalten 3,4,7,8: 100 µl des Antikörpers gegen Schwein + Casein einpipettieren und für 2 Stunden bei 30°C stehenlassen.

ELISA 2: Spalten 1,2,5,6: 100 µl des Antikörpers gegen Rind + Casein einpipettieren und für 24 Stunden bei 4°C stehenlassen.

Spalten 3,4,7,8: 100 µl des Antikörpers gegen Schwein + Casein einpipettieren und für 24 Stunden bei 4°C stehenlassen.

4.3.5. Sekundärer Antikörper

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^{E. 1}

^{IA 1}

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^{E. 2}

^{IA 2}

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ELISA 1: Spalten 1-8: 100 µl des Antikörpers gegen Huhn + Casein einpipettieren und für 2 ¼ Stunden bei 30°C stehenlassen.

ELISA 2: Spalten 1-8: 100 µl des Antikörpers gegen Huhn + Casein einpipettieren und für 2 Stunden bei 37°C stehenlassen.

5. Ergebnisse

5.1. 1. Versuch

Es konnte keine Auswertung gemacht werden, da einige Werte, sowie ein Teil der Blindwerte, zu hoch waren.

Die Probenextinktionen zeigten keinen Zusammenhang zu den Konzentrationen.

5.2. 2. Versuch

Es konnte keine brauchbare Auswertung gemacht werden, da die meisten Blindwerte höher als die Standards waren, und manche verdünntere Standards höhere Werte aufwiesen, als die konzentrierteren.

Die Blindwerte stiegen im Verlauf der Messung auf mind. das 10-fache der Anfangsextinktionen (d.h. der 1. Messung). Die Probenextinktionen stiegen willkürlich und in keinem Zusammenhang zu den Konzentrationen, und blieben größtenteils unter den Extinktionen der Blindwerte.

5.3. 3. Versuch

Auch hier waren die meisten Werte beider ELISAs zu hoch.
Die Extinktionen der Blindwerte stiegen auf ca. das 10-fache der Anfangsextinktionen, dabei blieben ihre Werte aber unter den Werten der Standards.

6. Diskussion

5.1. 1. Versuch

Da der Test keine Ergebnisse brachte, führten wir ihn noch einmal durch.

5.2. 2. Versuch

Grund für dieses Ergebnis könnte das Auswaschen des Caseins sein und das Anlagern der Antikörper an die Oberfläche der ELISA - Platte. Aufgrund dieser Vermutung haben wir beim nächsten Versuch unter anderem zwei verschiedene Waschtechniken ausprobiert.

Wir verglichen einen Vorgang bei dem dreimal mit Waschlösung gewaschen wurde und 3 minütlicher Einwirkzeit, mit einem Vorgang bei dem sechsmal mit verschiedenen Lösungen gewaschen wurde und keine Einwirkzeit angewandt wurde.

Dadurch verglichen wir eine intensivere Methode mit einer sanfteren Methode.

Ein weiterer Grund könnte die Dissoziation des Caseins aufgrund der längeren Inkubationszeit bei 37°C sein. Deshalb wählten wir zusätzlich eine kürzere Inkubationszeit.

Da wir in der Literatur verschiedene Inkubationszeiten für den primären Antikörper und den sekundären Antikörper fanden, versuchten wir einen Unterschied zwischen den einzelnen Arten festzustellen.

5.3. 3. Versuch

Bei der ELISA - Platte 1 waren alle Standards zu hoch, bei der ELISA - Platte 2 nur ein Teil. Die Ursache könnte in den unterschiedlichen Inkubationsarten mit dem 1. Antikörper und dem 2. Antikörper liegen. Bei der E. 2 haben wir festgestellt, daß es Unterschiede zwischen der beiden Wascharten gibt. Die auf die 2. Art gewaschenen (Spalten 3 - 6) waren bis auf 2 außerhalb des Meßbereiches, die auf die 1. Art gewaschenen zeigten zwar Werte, welche aber wiederum keinen Zusammenhang zu den Konzentrationen zeigten. Die unterschiedlichen Arten des Blockierens zeigten keinen Einfluß auf die Ergebnisse.

7. Literatur

KEMENY, D. M.: ELISA - Anwendung des Enzyme Linked Immunsorbent Assay im biologisch/medizinischen Labor, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1994, ISBN 3-437-11493-X, pp. 24,78,79,104,105

REHM, Hubert: Der Experimentator → Proteinbiochemie, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1997, 2. Auflage, ISBN 3-437-25750-1, p. 150 Arbeitsvorschrift des Assistenten

Abkürzungen

ELISA =   Enzyme Linked Immunsorbent Assay
IgY =    Immunglobulin Yotta
IgG   =   Immunglobulin G
RSA =   Rinderserumalbumin
SSA =    Schweineserumalbumin
ALP =    alkalische Phsophatase
M =    molar [mol/l]
PBS =    Phosphat gepufferte Saline
pNPP =    p-Nitrophenylphosphat
NaOH =    Natronlauge
Na₂CO₃ =    Natriumcarbonat
P Na₂CO₃- =   Puffer
E. ELISA - =    Platte
WV   =   Waschvorgang
B 1h   =   1 Stunde Blockieren
B 2h   =   2 Stunden Blockieren
IA =    Inkubationsart