Interaktion von Deletionsmutanten von Staphylococcus aureus mit menschlichen Zellen


Bachelorarbeit, 2020

99 Seiten, Note: 1.0

Anonym


Leseprobe


Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Staphylococcus aureus
1.1.1 Allgemeines und klinische Bedeutung
1.1.2 Virulenzfaktoren von S. aureus
1.1.3 Intrazelluläres Vorkommen und Persistenz von S. aureus
1.1.4 Nebraska Transposon Mutant Library
1.1.5 Auswahl der USA300 JE2-Mutanten
1.2 Verwendete Zelllinien
1.3 Ziel dieser Arbeit

2 Materialien und Methoden
2.1 Chemikalien
2.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien
2.3 Arbeiten mit tierischen Zellen
2.3.1 A549 Lungenepithel-Zellen
2.3.2 THP1 Leukämie-Monozyten-Zellen
2.3.3 Zellzahlbestimmung
2.3.4 Einfrieren von THP1 und A549-Zellen
2.4 Arbeiten mit Mikroorganismen
2.4.1 Bakterienstämme
2.4.2 Bestimmung der Korrelation zwischen CFU/ml und OD60o
2.4.3 Erstellung von Stocks
2.5 Analytik
2.5.1 Kultivierung in Infektionsmedium
2.5.2 Bakterielle Infektion
2.5.3 Lactat Dehydrogenase Release Assay
2.5.4 Durchflusszytometrie zur Messung von Apoptose und Nekrose

3 Ergebnisse
3.1 Colony forming units von S. aureus für die Bestimmung der MOI
3.2 Infektion von A549- und dTHP1-Zellen mit S. aureus Stämmen
3.2.1 Wachstum von S. aureus Stämmen in Infektionsmedium
3.2.2 Viablität von internalisierten S. aureus Stämmen
3.2.3 Viabilität von A549- und dTHPI-Zellen nach Infektion
3.2.4 Intrazelluläre Multiplikation von S. aureus nach Infektion
3.2.5 Charakterisierung des Zelltods nach Infektion
3.3 Persistenz von S. aureus in dTHP1 Zellen

4 Diskussion
4.1 Ergebnisdiskussion
4.1.1 Wachstum von S. aureus Stämmen in Infektionsmedium
4.1.2 Viabilität von internalisiertem S. aureus und infizierten Wirtszellen
4.1.2.1 Übersicht
4.1.2.2 AbrnQ1
4.1.2.3 AcodY
4.1.2.4 Ahly
4.1.2.5 Arot
4.1.3 Intrazelluläre Multiplikation von S. aureus nach Infektion
4.1.4 Charakterisierung des Zelltods nach Infektion
4.1.5 Persistenz von S. aureus in dTHP1 Zellen
4.2 Validität der Methoden

5 Ausblick

6 Literaturverzeichnis

7 Abbildungsverzeichnis

8 Tabellenverzeichnis

9 Abkürzungsverzeichnis

10 Anhang

Zusammenfassung

Staphylococcus aureus ist ein gram-positiver, fakultativ anaerober Mikroorganismus. Er wird von rund einem Drittel der Weltbevölkerung getragen und bleibt beim gesunden Menschen zumeist symptomatisch unauffällig. Gelangt er in die Blutbahn, kann S. aureus aber aufgrund seines opportunistischen Charakters eine Reihe von schweren invasiven Krankheiten verursachen. Angefangen bei oberflächlichen Haut- und Weichgewebsinfektionen, kann das Bakterium bis hin zur Sepsis und zum toxischen Schocksyndrom führen. Behandlungsmöglichkeiten werden besonders durch die starke Zunahme auftretender Resistenzen gegenüber Antibiotika erschwert. Zahlreiche Studien haben in vitro das Auftreten von S. aureus als intrazelluläres Pathogen in professionellen und nicht-professionellen Phagozyten bestätigt und auch in vivo konnte mittlerweile die Persistenz von S. aureus in Wirtszellen als wichtiger Schritt der Etablierung einer chronischen Infektion im menschlichen Organismus durch das Bakterium bestätigt werden. S. aureus ist somit in hohem Maße fähig, der Immunabwehr zu entkommen. Aufgrund der Gesamtsituation machen auch namhafte Institutionen wie das Robert Koch-Institut und die World Health Organization auf die Dringlichkeit aufmerksam. Es gilt, neue Strategien zur Suche nach Wirkstoffen und zur Bekämpfung von Infektionen durch kommensale und persistente Bakterien wie S. aureus zu finden. Diesem Anspruch soll diese Studie mit einem praktischen Ansatz folgen. Die zunehmende Erkenntnis, dass diese Bakterien sich durch veränderte Expression von Genen der intrazellulären Umgebung des Wirts anpassen, fordert nun die Identifikation von solchen für die Etablierung der Infektion essentiellen Gene. Im Zuge dieser Arbeit wurden ausgewählte spezifische Deletionsmutanten aus der Nebraska Transposon Mutant Library auf ihr Wachstum und ihre Vitalität in einem Zellkulturinfektionsmodell mit menschlichen professionellen Phagozyten (differenzierte THP1-Zellen) sowie nicht-professionellen Phagozyten (A549-Zellen) untersucht. Es wurden umfangreiche Unterschiede in der Virulenz und Persistenz zwischen den Mutanten festgestellt. Insbesondere solche Mutanten, denen Gene fehlen, deren Funktion mit Aminosäure-Transport und Toxin-Produktion assoziiert werden, zeigen veränderte Pathogen-Host-Interaktionen. Auch scheinen einige mit dem Eisenerwerb assoziierte Gene für das Überleben in Wirtszellen essentiell zu sein.

Abstract

Staphylococcus aureus is a gram-positive, facultative anaerobic mircroorganism. It is carried by about one third of the world's population, but is usually asymptomatic in healthy people. However, if it enters the bloodstream, S. aureus can cause a number of serious invasive diseases due to its opportunistic character. Starting with superficial skin and soft tissue infections, the bacterium can lead to sepsis and toxic shock syndrome. Treatment options are made particularly difficult by the sharp increase in emerging resistance to antibiotics. Numerous studies have confirmed in vitro the occurrence of S. aureus as an intracellular pathogen in professional and nonprofessional phagocytes and in vivo the persistence of S. aureus in host cells has been confirmed as an important step in the establishment of a chronic infection in the human organism by the bacterium. S. aureus is therefore highly capable of escaping the immune system. Due to the overall situation, renowned institutions such as the Robert Koch Institute and the World Health Organization are also drawing attention to the urgency of the situation. New strategies to search for active substances and to fight infections by commensal and persistent bacteria like S. aureus have to be found. This study will follow this claim with a practical approach. The increasing knowledge that these bacteria adapt to the intracellular environment of the host by altered expression of genes now requires the identification of genes essential for the establishment of the infection. In the course of this work, selected specific deletion mutants from the Nebraska Transposon Mutant Library were examined for their growth and vitality in a cell culture infection model with human professional phagocytes (differentiated THP1 cells) and non-professional phagocytes (A549 cells). Extensive differences in virulence and persistence between the mutants were found. Especially those mutants lacking genes whose function is associated with amino acid transport and toxin production show altered pathogen-host interactions. Also, some genes associated with iron acquisition appear to be essential for intracellular suvival.

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die mich während der Anfertigung dieser Bachelorarbeit unterstützt und motiviert haben.

Zuerst gebührt mein Dank Frau Prof. Bilitewski, die meine Bachelorarbeit betreut und begutachtet hat. Für die hilfreichen Anregungen und die konstruktive Kritik bei der Erstellung dieser Arbeit möchte ich mich herzlich bedanken. Ebenso möchte ich mich bei Herrn Prof. Hiller für das Interesse an meiner Forschung und die zweite Begutachtung meiner Bachelorarbeit bedanken.

Ich bedanke mich bei meinem Betreuer Aditya Shekhar für die tatkräftige Unterstützung und Anregung meiner Forschung. Außerdem möchte ich Paula Schöner für das Korrekturlesen meiner Arbeit danken.

Abschließend möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir mein Studium durch ihre Unterstützung ermöglicht haben und stets ein offenes Ohr für mich hatten.

Braunschweig, 30.03.2020

1 Einleitung

1.1 Staphylococcus aureus

1.1.1 Allgemeines und klinische Bedeutung

Im Jahr 2017 hat die World Health Organization (WHO) zum ersten Mal eine Übersicht mit antibiotikaresistenten Pathogenen herausgebracht, gegen die Forschung als dringend bewertet wird. Dabei handelt es sich um eine Liste mit priorisierten Familien von Bakterien, welche aktuell und in naher Zukunft die menschliche Gesundheit maßgeblich beeinträchtigen könnten. Dieser Katalog wurde veröffentlicht, um auf die Bedrohung der wachsenden Resistenz gegen Antibiotika aufmerksam zu machen und im Zuge dessen die Forschung und Entwicklung neuer Antibiotika gegen diese Bakterien zu beschleunigen. Die Liste der WHO ist geordnet nach der Dringlichkeit neuer Lösungen gegen entsprechende Erreger. Die Prioritäten sind unterteilt in mittlere, hohe und kritische Priorität. Staphylococcus aureus ordnet die WHO hierbei als hohe Priorität ein 1. Ebenso hat das Robert Koch-Institut bereits 2011 in einer Pressemitteilung die wichtigsten Infektionserreger priorisiert. Dabei wurde S. aureus gar in die höchste von vier Prioritätsgruppen eingeordnet und wird damit mit Erregern wie HIV, Influenza, Legionellen, Masern oder Tuberkulose gleichgestellt 2.

S. aureus ist ein bekannter Vertreter bakterieller Erreger beim Menschen, der eine Vielzahl klinischer Manifestationen verursacht. Der Infektionsweg ist zumeist die unbelebte Umgebung, d. h. gemeinsam Nutzung hygienischer Gegenstände, oder die direkte Übertragung durch die Hände. Die Inkubationszeit bei nicht-oraler Infektion beträgt 4-10 Tage 3. Ungefähr 30 % der weltweiten Bevölkerung ist von Staphylococcus aureus - überwiegend asymptotisch - kolonisiert 4. Infektionen sind sowohl in Gemeinschafts- als auch Krankenhauseinrichtungen weit verbreitet. Dabei ist die Behandlung aufgrund des Auftretens multiresistenter Stämme wie Methicillin- resistentem Staphylococcus aureus schwierig 5. Methicillin galt lange Zeit als ideales Pharmakon. Aufgrund seiner Toxizität wurde das Antibiotikum aber durch ähnliche ß-Lactam-Antibiotika, wie Oxacillin, ersetzt. Trotz des Wechsels zu anderen, stabileren Antibiotika spricht man bei den entsprechenden Resistenzen weiterhin vom Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus oder aber vom multi-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA), weil die Resistenz gegen Methicillin häufig mit der Resistenz gegen die anderen Antibiotika einhergeht. 6 In Abb. 1 ist die Verbreitung von MRSA im Jahr 2017 ersichtlich. Hier wird deutlich, dass MRSA weltweit ein Thema ist.

S. aureus kommt in der Umwelt vor und ist auch in der normalen menschlichen Flora zu finden, so kommt er bei den meisten gesunden Personen auf der Haut und den Schleimhäuten (meist nasal) vor. Unter normalen Gegebenheiten verursacht S. aureus keine Infektion auf der gesunden Haut, gelangt er jedoch in die Blutbahn oder in das innere Gewebe, können diese Bakterien eine Vielzahl potenziell schwerer Infektionen verursachen. Diese gliedert man grob in pyogene und toxin-vermittelte Erkrankungen 3. Pyogene Infektionen können sowohl oberflächlich als auch tiefgehend sein. Hierunter zählen beispielsweise Furunkel, Abszesse, Wundinfektionen, Sinusitis, Pneumonie, Endokarditis und gar Sepsis. Die Toxine von S. aureus führen entweder zur Ödem-Bildung zwischen den Zellschichten oder zu einem Toxischen Schock-Syndrom, welches symptomatisch mit starkem Fieber vergleichbar ist 3.

Staphylokokken zählen zur Familie der Micrococcaceae, sind unbeweglich, grampositiv und fakultativ anaerob. Die Größe der Bakterien beträgt etwa 1 pm und sie lagern sich meist zu Haufen bzw. in einer Traube (griech. Staphylos) aneinander an 7. Sie wachsen unter verschiedenen Temperaturen, optimal sind aber 30 bis 37 °C. Verglichen mit anderen Gattungen ist Staphylococcus durch weitgehende pH- Toleranz sowie Schutz vor Austrocknung recht unempfindlich 3.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: Weltweite relative Ausbreitung von Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus im Jahr 2017. Das Bakterium ist auf allen Kontinenten weitgehend vertreten (adaptiert von 8).

1.1.2 Virulenzfaktoren von S. aureus

Es ist noch nicht vollständig verstanden, wie Staphylokokken epitheliale Barrieren überwinden und im Zuge dessen eine Kolonisation zu einer Infektion führt. Mikroverletzungen im Epithel oder auch ein aktives Überwinden der Barrieren auf para- oder transzellulärem Weg stellen Möglichkeiten dar. Sobald die Bakterien in die Blutbahn gelangen, verfügen sie über eine Vielzahl an Mechanismen, um der Immunabwehr des Wirts auszuweichen und metastasierende Infektionen in diesem zu etablieren 9.

Für die Entstehung einer invasiven Infektion ist die Adhärenz von S. aureus an Wirtsgewebe, Endothel oder extrazelluläre Matrix der erste kritische Schritt. Hierfür verfügt S. aureus über einige Oberflächenproteine (Adhäsine), die eine Interaktion mit den Wirtsstrukturen eingehen. Nach erfolgreicher Adhäsion kommt es zur Bildung eines Biofilms. Dieser hat für die Bakterien entscheidende Überlebensvorteile. Die feste Haftung und hohe Dichte erschwert es dem Wirtsimmunsystem, auf die Bakte- rien im Biofilm zuzugreifen. Er stellt zudem eine Diffusionsbarriere für Antibiotika dar. Im Biofilm eingelagerte Proteine sowie Polysaccharide fungieren als Nährstoffe für die Bakterien 10.

Neben Adhäsinen verfügt S. aureus über ein großes Spektrum an Virulenzfaktoren. Die Ausstattung mit diesen ist stammesspezifisch und kann durchaus variieren. Außerdem wird die Expression der meisten Virulenzfaktoren durch komplexe Regulationssysteme gesteuert, abhängig von Wachstumsphase, Nährstoffangebot und weiteren Umweltfaktoren 9. Die Virulenzfaktoren von S. aureus werden zusammengefasst zu Kapseln, verschiedenen Zellwandbestandteilen und Oberflächenproteinen sowie sezernierten Komponenten (Enzyme, Toxine, Peptide). Eine Übersicht über die wichtigsten Virulenzfaktoren folgt in Abb. 2. Viele Untersuchungen weisen darauf hin, dass das porenbildende a-Hämolysin bei der Etablierung von S. aureus- Infektionen eine zentrale Rolle übernimmt 11. Das a-Toxin kommt bei über 90 % aller klinischen Isolate vor und ist damit einer der häufigsten Virulenzfaktoren von S. aureus 9.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: Übersicht über die zellulären und sekretierten Virulenzfaktoren von S. aureus, a-Toxin als wichtiges sekretiertes Protein zur Etablierung der Infektion (adaptiert von 12).

1.1.3 Intrazelluläres Vorkommen und Persistenz von S. aureus

S. aureus produziert zahlreiche Proteine, die mit Komponenten des menschlichen Immunsystems interagieren. Dieses ist allgemein unterteilt in die angeborene sowie die adaptive Immunabwehr. Professionelle Phagozyten (z.B. Makrophagen, Monozyten, Granulozyten), ihre sekretierten Produkte (z.B. antimikrobielle Peptide, Reaktive Sauerstoffspezies ROS) und das Komplementsystem gehören der angeborenen bzw. unspezifischen Immunantwort an, während T-Zellen, B-Zellen und Antikörper der adaptiven bzw. spezifischen Immunantwort zugehören 13. Eine entsprechende Übersicht zu den Faktoren der Immunantwort von Makrophagen ist in Abb. 3 gezeigt.

Nachdem S. aureus lange Zeit als klassisches extrazelluläres Pathogen beschrieben wurde, besteht mittlerweile kein Zweifel mehr an der seiner Fähigkeit auch intrazellulär zu persistieren. Mit in w'fro-Modellen mit nicht-professionellen Phagozyten wurde vielfach gezeigt, dass S. aureus in diese eindringen und in ihnen eben auch über einen längeren Zeitraum persistieren kann. In den letzten Jahren wurde dieses Phänomen auch zunehmend bei Infektionsmodellen mit professionellen Phagozyten beobachtet. Zahlreiche in wVo-Untersuchungen stützen nun die Annahme, dass die Internalisierung des Bakteriums in Wirtszellen maßgeblich zur Pathogenese von S. aureus-Infektionen beiträgt 7. Gleich nach der Wirtszellinvasion sind die Bakterien in einer exponentiellen Wachstumsphase, in welcher sie große Mengen an Toxinen und Enzymen sekretieren. Dies kann zu starken Entzündungsreaktionen oder gar dem Tod der Wirtszelle führen 9.

Die verschiedenen Strategien von S. aureus, die es ihm erlauben im intrazellulären Milieu zu überleben und den Abwehrmechanismen der jeweiligen Wirtszelle zu entkommen, hängen maßgeblich vom Bakterienstamm und eben auch von der Wirtszelle ab. S. aureus passt dabei seine Genexpression den Gegebenheiten spezifisch an 7. Die Produktion verschiedener Toxine wie a-Toxin ermöglicht dem Bakterium, das Phagolysosom zu verlassen und in das Zytosol überzugehen. Es wird zudem beschrieben, dass nachdem S. aureus ins Zytosol übergeht, er die Apoptose der Wirtszelle induzieren und sogar die Autophagie für sich nutzen kann 14.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3: Ein schematischer Überblick über die antimikrobiellen Mechanismen von Makrophagen auf intrazellulärer und extrazellulärer Ebene (adaptiert von 15).

Nach Invasion der Wirtszelle ist im Anschluss an die akute inflammatorische Reaktion auch ein persistierender Infektionsverlauf möglich. So können die Bakterien über Wochen und Monate in Zellen bzw. in Gewebe des Wirts verbleiben. Die Anzahl der persistierenden Bakterien ist dabei sehr gering 16. Daher können zunächst einmal wenige bis keine inflammatorische Reaktionen observiert werden. Die Zahl intrazellulärer Bakterien ist unmittelbar nach Infektion der Wirtszellen und erfolgreicher Invasion sehr hoch, nimmt aber im Verlaufe der Inkubationszeit wieder ab. Dies liegt daran, dass der Wirt den Bakterien zumeist nicht schutzlos ausgeliefert ist. Professionelle und auch nicht-professionelle Phagozyten verfügen nämlich über ImmunMechanismen, welche helfen, die internalisierten Bakterien innerhalb weniger Tage zu minimieren. Dabei sind professionelle Phagozyten mit bakterizid wirkenden Abwehrmechanismen wie beispielsweise den reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ausgestattet, während nicht-professionelle Phagozyten spezifisch Abbauwege wie die Autophagie nutzen, um die Bakterien abzutöten 17.

1.1.4 Nebraska Transposon Mutant Library

Der Center of Staphylococcal Research (CSR) hat eine Sammlung von sequenzdefinierten Transposon-Mutanten von Staphylococcus aureus - namentlich die Nebraska Mutant Library - erstellt, welche die Forschungsmöglichkeiten der Staphy- lokokken-Forschungsgemeinschaft vorantreiben soll. Die Ansammlung dieser Stämme besteht aus mutierten Derivaten des Stamms USA300 LAC. Zur Erstellung der Bibliothek wurden einzelne Gene durch Insertion des marinen Transposons bursa aurealis gestört, auch bekannt als Transposon-Mutagenese. Das Ergebnis sind Mutanten, in denen jeweils eines der ca. 2 k nicht-essentiellen bekannten Gene im Genom von S. aureus inaktiviert ist, welche nun zur Analyse zur Verfügung stehen. Nicht-essentiell heißt in diesem Zusammenhang nur, dass Bakterien mit einer Mutation dieser Gene aller Voraussicht nach noch lebens- und vermehrungsfähig sind. Die Insertionsstellen für jede Mutante dieser Sammlung wurden identifiziert, indem die Nukleotidsequenzen der betreffenden Verbindungsfragmente, welche das Ende des Transposons und die flankierende DNA enthalten, bestimmt wurden. In Zusammenarbeit mit dem Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA) wurden die produzierten Transposon-Mutanten der StaphylokokkenForschungsgemeinschaft zu Untersuchungen zur Verfügung gestellt 18. Informationen über die S. aureus-Transposon-Mutanten, die aktuell zur Verfügung stehen, können der Internetseite des CSR (www.unmc.edu) entnommen werden. Tab. 3 zeigt die für diese Arbeit ausgewählten Mutanten. Die mit jeder Mutante verbundenen Daten wurden direkt aus der USA300_FPR3757-Genomsequenz (NCBI- Referenzsequenz NC_007793) gewonnen und teilweise mit Hilfe der Universal Protein Resource-Datenbank (UniProt) ergänzt 19 20. Diese Liste wird in regelmäßigen Abständen aktualisiert, wenn weitere Mutanten in die Sammlung aufgenommen werden. S. aureus USA300 LAC, ist ein gut charakterisierter MRSA-Stamm. Er wurde von einem Gefängnisinsassen des Los Angeles County isoliert 18. Um die genetische Manipulation zu vereinfachen und Transpositions-Interferenzen zu vermeiden, wurden die Plasmide von USA300 LAC behandelt, sodass der Stamm USA300 JE2 entstand, der für die nachfolgende Transposon-Mutagenese zur Erstellung der Bibliothek Verwendung fand 21.

1.1.5 Auswahl der USA300 JE2-Mutanten

Die ausgewählten Transposon-Mutanten lassen sich grob in drei Kategorien einteilen. So haben die deletierten Gene etwas mit dem Stoffwechsel von Eisen oder Aminosäuren zu tun, oder sind an der Bildung von Toxinen beteiligt.

Der Stoffwechsel bzw. genauer der Erwerb von Eisen durch den Erreger wird als kritische Determinante betitelt, die das Ergebnis der Host-Pathogen-Wechselwirkung maßgeblich beeinflusst 22. Eisen hat ein einzigartiges Redoxpotential, das es als idealen Cofaktor in verschiedenen biochemischen Reaktionen agieren lässt. Somit ist es essentiell für das Wachstum und die Vermehrung nahezu aller Organismen. Darunter zählen auch pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus. Überschüssiges Eisen wird bei Wirbeltieren sogar in Proteine sequestriert, um die Ressourcen für eindringende Krankheitserreger zu begrenzen. Über 90 % des bei Säugetieren vorliegenden Eisens ist intrazellulär und daher keine gute Quelle für extrazelluläre Pathogene, solange es intrazellulär bleibt 23. Extrazellulär wird Eisen durch hochaffine Transportproteine wie Transferrin oder Lactoferrin für Bakterien unzugänglich gemacht. Der Prozess der Limitierung der Verfügbarkeit eines Nährstoffs wird auch als nutritional immunity bezeichnet 24.

Auf die eisenlimitierte Umgebung reagiert S. aureus, indem er Eisenaufnahmesysteme und weitere Virulenzfaktoren vermehrt exprimiert 25. Um die Sequestrierung essentieller Nährstoffe zu umgehen, haben bakterielle Krankheitserreger Systeme entwickelt, welche die Beschaffung von z. B. Eisen während einer Infektion ermöglichen, wie zum Beispiel die Synthese von Siderophoren, bei denen es sich um niedermolekulare hochaffine Eisenchelatoren handelt. Der Erwerb von Eisen ist für Besiedlung und Pathogenese durch S. aureus erforderlich. So ist Eisen ein wesentlicher Faktor im Prozess der Biofilmbildung im Zuge der Infektion (s. Abb. 4) 26. In der Zellhülle des Bakteriums liegen spezielle Bindeproteine zur Aufnahme und Transport von Eisen und Eisenkomplexen vor 23. Mutanten, denen die Gene für eben solche Proteine fehlen, bilden einen Teil dieser Arbeit.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4: Faktoren für die Biofilmbildung bei S. aureus, Eisen neben Chelatoren, Gallium-Komplexen und Siderophor-Inhibitoren als elementarer Bestandteil der Etablierung der Virulenz (adaptiert von 26).

Während der Invasion des Wirtes muss sich Staphylococcus aureus schnell an eine Vielzahl von Kohlen- und Stickstoffquellen anpassen 27. Aminosäuren werden typischerweise selektiv oder zusammen mit strukturverwandten Aminosäuren durch Aminosäure-Transporter befördert. Diese sind in Bakterien allgegenwärtig 28. Verzweigte Aminosäuren - kurz BCAAs (branched chain amino acids) - wie Leucin (Leu), Isoleucin (Ile) und Valin (Val) sind lipophil. BCAAs können sowohl im Kern von globulären Proteinen sowie bei Zelloberflächenproteinen in der Transmembrandomäne vorliegen 29. Sie sind für Wachstum und Virulenz des Bakteriums unerlässlich. Sie unterstützen nicht nur die Proteinsynthese, sondern sind zudem Vorläufer für branched chain fatty acids (BFCAs). Trotz dieser elementaren Funktion, wird die Synthese von Leu und Val von S. aureus unterdrückt. Stattdessen wird die Aufnahme dieser BCAAs aus dem extrazellulären Milieu bevorzugt 30. Des Weiteren sind BCAAs Corepressoren für codY, welches die Expression von Genen für Virulenzfaktoren reguliert. Somit sind insbesondere verzweigte Aminosäuren ein entscheidendes Bindeglied zwischen dem Metabolismus und der Virulenz der Zelle (s. Abb. 5) 31. Für die Akquisition dieser verzweigten Aminosäuren liegen bei Bakterien spezifische Transportmechanismen vor. Diese umfassen u. a. sekundäre Transporter wie die Kationen-Symporter. Dazu gehört z. B. brnQ 32. Eben solche Transposon- Mutanten, denen die Gene für diesen oder ähnliche Transporter fehlen, bilden eine weitere Gruppe der zu untersuchenden Stämme.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 5: Einflussfaktoren auf die Virulenz von Staphyloccous aureus, verzweigte Aminosäuren (BCAAs) regulieren das Gen codY, welches die Signalkaskaden zwischen Metabolismus und Virulenzfaktoren verbindet (adaptiert von 33).

Zu dem großen Repertoire an Virulenzfaktoren von S. aureus gehören allen voran auch ausgeschiedene Toxine. Viele dieser Toxine schädigen Biomembranen und führen zum Absterben der Zelle. S. aureus produziert starke Hämolysine und Leuko- zidine (s. Abb. 6). Des Weiteren sezerniert das Bakterium einige Faktoren, welche die Komplementkaskade hemmen oder gar die Erkennung durch die Wirtsabwehr verhindern 34. Das a-Toxin, welches auch als a-Hämolysin bekannt ist, ist ein ß- Fass porenbildendes Toxin. Es wird von 95-100 % aller S. aureus-Isolate exprimiert 35. Die Monomere des Toxins lagern sich in der Membran der Wirtszelle zu einem Heptamer zusammen, was letztlich zur Lyse der Zelle führt. 36. Es ist seit jüngster Zeit als potentielles Ziel für die Entwicklung von Impfstoffen und von Therapeutika bekannt, da es bei S. aureus-Infektionen häufig zur Schwere des Krankheitsverlaufes beiträgt 37. a-Hämolysin wird als einer der wichtigsten Virulenzfaktoren beschrieben 38.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 6: Membranschädigende Toxine von S. aureus. Rezeptor-vermittelten Toxinen (links) wie a- Toxin stehen Rezeptor-unabhängige Toxine (rechts) wie die Phenol-löslichen Moduline (PSMs) gegenüber (adaptiert von 34).

1.2 Verwendete ZeNUmen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Zelllinien verwendet, zum einen die Epithelzelllinie A549 als Repräsentant für nicht-professionelle Phagozyten und für Zellen, die die physikalische Barriere für S. aureus bilden, und zum anderen die monozyti- sche Zelllinie THP-1 als Repräsentant der angeborenen Immunabwehr.

Bei den A549-Zellen handelt es sich um eine spezifizierte, humane Zelllinie, welche für Zellkulturen im Bereich der Infektionsbiologie und Molekularbiologie verwendet wird. Die Zellen entstammen einem explantierten Adenokarzinom der Lunge eines 58-jährigen Amerikaners. Sie wurden 1972 von Donald J. Giard am Massachusetts Institute of Technology (MIT) etabliert 39. A549-Zellen wachsen in Kultur einschichtig adhärent. RPMI-1640 oder Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) unter jeweiliger Zugabe von Fetalem Kälberserum (englisch fetal bovine serum: FBS) stellen die gängigen Zellkulturmedien dar 40. Die Verdopplungszeit von A549-Zellen beträgt durchschnittlich 22,8 h 41.

Bei den THP1-Zellen handelt es sich um eine humane monozytäre Zelllinie, die ursprünglich von einem 1-jährigen Patienten mit akuter monozytärer Leukämie stammt. Sie weisen eine große, runde Einzelzellmorphologie auf 42. RPMI-1640 unter Zugabe von Fetalem Kälberserum (FBS) ist das gängige Zellkulturmedium 43. THP1- Zellen, die mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) differenziert werden (dTHP1), sind als Modell für die Funktion und Biologie menschlicher Makrophagen weit verbreitet. Die für die Differenzierung verwendeten Bedingungen, insbesondere die Konzentration von PMA und die Dauer der Behandlung, sind jedoch sehr unterschiedlich 44. Die dTHP1-Zellen haben eine Verdopplungszeit von bis zu 50 h 45.

Diese Zelllinien - eine Epithelzelllinie und eine Makrophagenzelllinie in der differenzierten Form - wurden verwendet, da sie repräsentativ für die erste Verteidigungslinie des Menschen vor Infektionen sind 39. Zudem finden sie häufig Anwendung in zahlreichen Publikationen der Toxikologie und Infektionsbiologie, was es erleichtert, vorangegangene Untersuchungen zu replizieren und an diese anzuknüpfen. Zelllinien von Mensch oder auch Maus, die aus Krebszellen gewonnen werden, sind wichtige in-vitro-Werkzeuge geworden, um zelluläre Funktionen, Mechanismen und Reaktionen sowie Signalwege und Nährstoff- und Arzneimitteltransport zu untersuchen 46. Im Vergleich zu primären Zellen sind sie zwar verändert, da sie in kontinuierlicher Kultur gehalten werden können, bieten aber damit den Vorteil konstanter und reproduzierbarer Eigenschaften, da sie unabhängig von der jeweiligen Physiologie eines Spenders sind. Gegenüber in-vivo-Untersuchungen haben sie in erster Linie einen finanziellen sowie ethischen Vorteil.

1.3 Ziel dieser Arbeit

Einige S. aureus-Populationen haben sich im hospitalassoziierten Bereich seit einiger Zeit etabliert und erlangen multiple Resistenzen gegenüber zuvor wirkenden Penicillin-Derivaten. Insbesondere Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus ist heute weltweit einer der am häufigsten auftretenden Verursacher von sporadischen und endemischen Infektionen in Gesundheitseinrichtungen. Die letzten Jahre waren zudem von einem starken Anstieg von MRSA-verursachten Infektionen bei Tieren geprägt. Die Frage zum zoonotischen Charakter von animalem MRSA ist noch ungeklärt und steht zur Diskussion 47. Diese Arbeit verfolgt deshalb das Ziel, die Patho- gen-Host-Interaktion zwischen S. aureus und menschlichen Zellen umfassender zu verstehen. Es sollen Hinweise auf für die Invasion und das Überleben in Wirtszellen essentiellen genetischen Faktoren von S. aureus gefunden werden, um damit mögliche Angriffspunkte für künftige Wirkstoffe zu identifizieren. Hierfür sollen ausgewählte spezifische Deletionsmutanten aus der Nebraska Transposon Mutant Library in Kultur genommen werden, um zunächst ihr Wachstumsverhalten zu analysieren und dann zu prüfen, ob ihre Vitalität in einem Zellkulturinfektionsmodell mit menschlichen Zellen beeinflusst ist. Dabei soll auch über einen längeren Zeitraum infiziert werden, um die intrazelluläre Persistenz des Bakteriums und dessen Mutanten und die damit womöglich einhergehenden phänotypischen Veränderungen zu analysieren. Zudem soll die Wirtszell-Vitalität nach erfolgter Infektion mittels verschiedener Methoden charakterisiert werden, um Rückschlüsse auf die Virulenz der S. aureus-Stämme ziehen zu können.

Es wurden Mutanten ausgewählt, um die Rolle der Eisenaufnahme, von Störungen des Aminosäurestoffwechsels und von Toxinen von S. aureus zu analysieren, insbesondere ihre Funktion für die Persistenz einer Infektion.

2 Materialien und Methoden

2.1 Chemikalien

Tab. 1: Chemikalien.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Tab. 2: Geräte und Verbrauchsmaterialien.

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2.3 Arbeiten mit tierischen Zellen

2.3.1 A549 Lungenepithel-Zellen

A549-Zellen wurden bei 37 °C in 25 ml DMEM + 10 % FBS in T75-Zellkulturflaschen kultiviert. Die Konfluenz wurde mit dem Mikroskop bei zehnfacher Vergrößerung festgestellt. Bei 70-90 % Konfluenz konnte eine Subkultivierung erfolgen. Dafür wurde zunächst der Überstand verworfen. Die Zellen wurden mit 8 ml PBS gewaschen. Die adhärenten Zellen wurden mit 2 ml Accutase für 2-3 min bei 37 °C inkubiert. Durch vorsichtiges Klopfen wurden so die Zellen vom Boden gelöst. Es wurde mit Zellkulturmedium auf 10 ml aufgefüllt und anschließend in 50 ml-Falconröhrchen überführt. Die Zellen wurden für 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert und dann in 5 ml Zellkulturmedium resuspendiert. 200-300 pl wurden zur Zellzahlbestimmung in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Abb. 7 zeigt die adhärenten einschichtigen A549-Zellen in einer 96-Well-Platte.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 7: Adhärente A549-Zellen in einer 96-Well-Platte b. m. V. x 10.

2.3.2 THP1 Leukämie-Monozyten-Zellen

THP1-Zellen wurden bei 37 °C in 30 ml RPMI + 10 % FBS in T75-Zellkulturflaschen kultiviert. Die Konfluenz wurde mit dem Mikroskop bei zehnfacher Vergrößerung festgestellt. Bei 80-90 % Konfluenz konnte eine Subkultivierung erfolgen. Dafür wurde das Zellkulturmedium entnommen und anschließend in 50 ml-Falconröhrchen überführt. Die Zellen wurden für 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert und dann in 5 ml Zellkulturmedium resuspendiert. 200-500 pl wurden zur Zellzahlbestimmung in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt.

THP1-Zellen wurden mit PMA zu Makrophagen (dTHPI) differenziert. Hierfür wurden je 1 ml Zellkulturmedium 2 pl 100 pM PMA hinzugefügt, sodass eine Endkonzentration von 200 nM PMA vorlag. Die Zellen wurden nach dem Zählvorgang in eine 96- Well-Platte gesät und bei 37 °C inkubiert. Nach 24 h wurde der veränderte Phänotyp unter dem Mikroskop festgestellt, das Medium mit PMA entfernt und neues Zellkulturmedium zugeführt. Für ein Experiment wurden die Zellen erneut für 24 h inkubiert. Abb. 8 zeigt die THP1-Zellen in undifferenzierter und differenzierter Form in einer 96- Well-Platte.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 8: In einer 96-Well-Platte sind undifferenzierte (links) THP1-Zellen in Suspension und rundlich vor bzw. differenzierte (rechts) THP1-Zellen (dTHP1) sind adhärent und ordnen sich in Trauben an, b. m. V. x10.

2.3.3 Zellzahlbestimmung

Die Zellzahl wurde mit dem CASY Cell Counter bestimmt. Dafür wurden 25 pl der jeweiligen Zellsuspension in CASY-Lösung zu einem Endvolumen von 10 ml aufgenommen und gerührt. Nach mehrfacher Reinigung des Geräts mit CASY-Lösung, wurde die Zellzahl pro ml dreifach bestimmt. Der CASY Cell Counter zeigt das Ergebnis in cells/ml für eine Verdünnung von 1:200. Da 1:400 verdünnt wurde, muss das Ergebnis entsprechend um den weiteren Verdünnungsfaktor angepasst werden. Für alle Infektionsexperimente wurden pro Well 105 dTHPI- bzw. 5 • 104 A549-Zellen in ein jeweiliges Endvolumen von 100 pl gesät.

2.3.4 Einfrieren von THP1 und A549-ZeMen

Das Gefriermedium bestand aus 10 % DMSO, 20 % FBS und 70 % RPMI (für THP1) bzw. DMEM (für A549).

5 • 106 Zellen pro ml Gefriermedium wurden in Kryoröhrchen und in den Container mit Isopropanol zur kryogenen Lagerung (Mr. Frosty) bei -80 °C übertragen. Am nächsten Tag wurden die Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff überführt.

2.4 Arbeiten mit Mikroorganismen

2.4.1 Bakterienstämme

Der Staphylococcus aureus USA300 JE2 Wildtyp und die Mutanten des selbigen Stammes wurden auf dieselbe Weise behandelt. In anfänglichen, in den Ergebnissen nicht aufgeführten Versuchen, wurde noch Erythromycin in den Übernachtkulturen der Mutanten verwendet, um die Integrität dieser gewährleisten zu können. Jedoch führte dies zu erhöhtem Wachstum. Die untersuchten Mutanten stehen in der nachfolgenden Tab. 3. Es handelt sich um Deletionen von vermutlich wichtigen Bestandteilen der Aufnahme und des Transports von Eisen und Aminosäuren, sowie der Produktion von Virulenzfaktoren.

Tab. 3: Übersicht über die verwendeten Staphylococcus aureus USA300 JE2-Transposon-Mutanten geordnet nach Stammnamen (zusammengetragen von 48).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.4.2 Bestimmung der Korrelation zwischen CFU/ml und OD600

Es wurden Übernachtkulturen des S. aureus Wildtypstamms in 20 ml TSB angesetzt. Nach Messen der OD60o wurde eine Präkultur mit OD 0.05 eingestellt. Bei OD 0.3 wurden die Verdünnungen 10-4 und 10-5 in 1.5 ml Eppendorf-Gefäßen erstellt. Je 50 pl der Verdünnungen wurden auf je eine Agar-Platte pipettiert, mit einem Dri- galskispatel gleichmäßig verteilt und für 24 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde durch zählen der Kolonien die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro ml berechnet. Dieses Experiment ist notwendig, um die multiplicity of infection (MOI) für nachfolgende Experimente mit Bakterien und Zellen einstellen zu können. Die MOI ist das Verhältnis der Anzahl der Pathogene gegenüber der Anzahl der plattierten Zellen im Reaktionsansatz 49. Eine MOI von 10 hat sich für allgemeine infektionsbiologische Untersuchungen als wirksam erwiesen. Zum einen wird dadurch gewährleistet, dass genügend Erreger vorliegen, sodass ausreichend Kontakt mit den Zellen während der vorgesehenen Inkubationszeit möglich ist. Andererseits kann eine höhere MOI gar kontraproduktiv für die Infektionsdynamik sein, da bei zu hoher MOI die Zellen vollständig und direkt lysiert werden, sodass Unterschiede in der Infektiosität unterschiedlicher Stämme gar nicht ausgemacht werden können 50. Die Zellmortalität ist dann eher ein Resultat des Eindringungsprozesses statt der nachfolgenden Infektion durch den jeweiligen Erreger 51.

2.4.3 Erstellung von Stocks

0.5 ml 50 % Glycerol verdünnt mit PBS wurden mit 0.5 ml jeweiliger Bakteriensuspension (OD600 0.2) gründlich vermischt und in sterilen Eppendorf-Gefäßen bei -80 °C gelagert.

2.5 Analytik

2.5.1 Kultivierung in Infektionsmedium

Es sollte die Vitalität aller betrachteten Stämme im reinen Infektionsmedium betrachtet. Dies soll Auskunft darüber geben, ob Wachstumsunterschiede zwischen diesen Stämmen in anderen Vergleichen auf unterschiedliche Toleranz des Infektionsmediums zurückgehen, oder ob die Unterschiede tatsächlich der diversen Wechselwirkung zwischen dem jeweiligen Pathogen und dem Wirt zugrunde liegen.

Es wurden Übernachkulturen des S. aureus Wildtypstamms in 4 ml TSB angesetzt. Die OD600 der Übernachtkulturen wurde gemessen und die jeweilige Präkultur mit einer OD von 0.1 in 4 ml RPMI eingestellt. Ab OD 0.5 wurden 0.5 ml in je ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für 5 min und 9000 rfc bei 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurden die Proben zunächst zu OD 0.2, und schließlich in einer 96-Well- Platte mit RPMI-Medium zu OD 0.01 verdünnt. Die OD von jeweils drei biologischen Replikaten aller Stämme wurde nach 0 h, 6 h und 24 h gemessen.

2.5.2 Bakterielle Infektion

Das Ziel der bakteriellen Infektion ist es, die Vitalität der zu untersuchenden Stämme in vitro mit repräsentativen humanen Zelllinien zu untersuchen. Zur Auswertung werden die colony forming units (CFU, englisch für koloniebildende Einheiten) ausgezählt.

Das Medium der gesäten Zellen (s. 2.3.1 und 2.3.2) wurde entfernt und durch 84 pl je Well in den Infektionsansätzen bzw. 100 pl in den Kontrollen ersetzt. Es wurden Übernachkulturen des S. aureus Wildtypstamms in 4 ml TSB angesetzt. Die OD60o der Übernachtkulturen wurde gemessen und die jeweilige Präkultur mit einer OD von 0.1 in 4 ml TSB eingestellt. Ab OD 0.5 wurden 0.5 ml in je ein EppendorfReaktionsgefäß überführt und für 5 min und 9000 rfc bei 4 °C zentrifugiert. Für alle Experimente wurde eine MOI von 10 eingestellt. Basierend auf dem Ergebnis des vorangegangen CFU-Experiments aus 2.4.2 wurde errechnet, dass bei OD 0.2 der Bakteriensuspensionen 16 pl etwa 106 Bakterien entsprechen. Um eine OD von 0.2 einzustellen, wurde in entsprechender Menge RPMI resuspendiert. Die Zellen wur- den in drei biologischen Replikaten mit 16 pl des jeweiligen Bakterienstamms infiziert und für 6 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde das Medium vorsichtig abgenommen und durch je 100 pl RPMI + 100 pg/ml Gentamycin ersetzt. Das Gentamycin tötet die extrazellulären Bakterien im Well ab. Nach 1 h wurde das Medium erneut vorsichtig abgenommen und durch 100 pl 0.1 % Triton X-100 in Wasser mit HPLC-Qualität ersetzt. Triton lysiert Zellen. Nach 10 min Einwirkzeit wurden die Wells durch mehrfaches Pipettieren gut durchmischt. Anschließend wurde der aufgeschäumte Inhalt jeweils in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit je 900 pl PBS überführt und durch Vortexen gründlich durchmischt. Für Versuche mit dTHP1-Zellen wurden je Replikat 5 pl der 1000 pl Ausgangslösung auf TSA plattiert, bevor durch Verwerfen und Zufügen von neuem PBS exakt 1:2 verdünnt und erneut je 5 pl plattiert wurden. Dies wurde ein weiteres Mal wiederholt, sodass letztlich auf der Platte die Verdünnungen 1:200, 1:400 sowie 1:800 in drei biologischen Replikaten vorliegen. Bei Versuchen mit A549-Zellen wurde die 1000 pl Ausgangslösung zunächst 1:4 verdünnt, sodass mit 1:800 die erste Verdünnung auf der TSA-Platte vorliegt. Nach gleichem Prinzip wie in den dTHP1-Experimenten wurden nach jeweiligem Plattieren die weiteren Verdünnungen 1:1600 und 1:3200 erreicht. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden die CFUs gezählt und mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor die Bakterienzahl pro Well berechnet.

Zur Ermittlung der Persistenz der erfolgreich internalisierten Mutanten im Vergleich zum Wildtyp, soll über längere Zeit infiziert werden. Bis einschließlich des Schritts der Infektion, gleicht das Protokoll. Anschließend wurde für 2 h bei 37 °C inkubiert. Danach wurde das Medium vorsichtig abgenommen und durch je 100 pl RPMI + 100 pg/ml Gentamycin ersetzt. Die Proben wurden nun für weitere 72 h bei 37 °C inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurde gemäß dem Protokoll lysiert, ausplattiert und gezählt.

X hpi bedeutet im Zusammenhang mit CFU-Experimenten dieser Arbeit, dass für X h inkubiert und anschließend wie beschrieben für 1 h mit Gentamycin behandelt wurde. Genaugenommen sind es demzufolge 7 h, die die Proben inkubiert wurden. Die Gentamycin-Behandlung wird hier aber als Prozess der Analytik eingeordnet.

[...]

Ende der Leseprobe aus 99 Seiten

Details

Titel
Interaktion von Deletionsmutanten von Staphylococcus aureus mit menschlichen Zellen
Hochschule
Technische Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig
Note
1.0
Jahr
2020
Seiten
99
Katalognummer
V1010327
ISBN (eBook)
9783346401205
ISBN (Buch)
9783346401212
Sprache
Deutsch
Schlagworte
Mikrobiologie, Infektionsbiologie, Zellkultur, S. aureus, Chemische Biologie
Arbeit zitieren
Anonym, 2020, Interaktion von Deletionsmutanten von Staphylococcus aureus mit menschlichen Zellen, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/1010327

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