Untersuchung von DNA Repair-Mechanismen von Mensch und Schimpanse

Inhalt

1. Einleitung
1.1 Das Cisplatinexperiment
1.1.1 Cisplat
1.1.1.1 Wirkungsweise von Cisplati
1.1.1.2 Klinische Bedeutung von Cisplatin
1.1.2 DNA-Schäde
1.1.3 DNA-Reparatu
1.1.3.1 Direct Repa
1.1.3.2 Excision Repa
1.1.3.3 Einzelstragreparatur
1.1.3.4 Doppelstrangbruchreparat
1.1.4 Tumorgenese
1.1.5 Genregulation.
1.1.5.1 Transkripti
1.1.5.2 Regulation der Transkription durch Promoter
1.1.5.3 Epigenetische Regulation der Genexpressio

2. Material und Methoden
2.1 Labormethoden
2.1.1 Vorbereitun
2.1.2 Ermittlung der Reparaturleistung
2.1.2.1 Membrane Dot Blot-Verfahre
2.1.2.2 GE-gekoppelte ICP-M
2.1.3 Gen-Expressionsmessung
2.2 Bioinformatische Methode
2.2.1 Analyse der kodierenden Sequenzberei
2.2.1.1 Untersuchung der dN/dS-Rat
2.2.1.2 Untersuchung mit dem Haplotte
2.2.2 Analyse der regulatorischen Bereiche
2.2.2.1 Untersuchung putativer Promoterbereiche
2.2.2.2 Untersuchung der 5’- und 3’-UTR´
2.2.2.3 Untersuchung der Intro

3. Ergebnisse
3.1 Laborergebnisse
3.1.1 Reparaturleistu
3.1.1.1 Membrane Dot Blot
3.1.1.2 GE-gekoppelte ICP-M
3.1.2 Gen-Expression
3.2 Bioinformatische Ergebnisse.
3.2.1 Kodierende Bereic
3.2.1.1 dN/dS-Metho
3.2.1.2 Haplott
3.2.2 Regulatorische Bereich
3.2.2.1 Putative Promoterbereic
3.2.2.2 Untranslatierte Bereic
3.2.2.3 Introns
3.2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse

4. Diskussion
4.1 Labormethoden und Ergebnis
4.1.1 Das Ausgangsmateri
4.1.2 Die Untersuchung der DNA-Reparatu
4.1.3 Die Untersuchung der Gen-Expressi
4.2 Bioinformatische Methoden und Ergebniss
4.2.1 Kodierende Bereic
4.2.1.1 dN/dS-Metho
4.2.1.2 Der Haplotter-Tes
4.2.2 Regulatorische Bereich
4.2.2.1 Putative Promoterbereic
4.2.2.2 5’-UTR und 3’-UTR-Berei
4.2.2.3 Intronbereiche
4.2.2.4 Betrachtung aller Bereic
4.3 Die Planungs-Strategie des Cisplatinexperiment
4.3.1 Restrukturierung des Cisplatinexperimen
4.3.2 Die Vorteile einer Logframe-Planung
4.4 Zusammenfassu

5. Ausblick

7. Literatur

1. Einleitung

Die afrikanischen Affen (Schimpansen, Bonobos, Gorillas) sind die nähesten, lebenden Verwandten des modernen Menschen. Der letzte gemeinsame Vorfahre von Mensch und Schimpanse wird vor ca. 4,6 – 6,2 mio Jahren angenommen (Hellmann, 2003).

Die geringe Divergenz der genomischen Sequenzen und die evolutionsbiologisch kurze Zeit seit dem letzen gemeinsamen Vorfahren, machen den Schimpansen zum interessantesten Kandidaten für biologische und medizinische Fragestellungen und Vergleiche. Speziell die komparative Genomik gibt uns die Möglichkeit, Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen uns und den Schimpansen, als uns biologisch am nähesten stehende, noch existierende Art, zu entdecken (Hardison, 2003).

Allerdings sind mit dem aktuellen Wissensstand die phänotypischen Unterschiede durch den genomischen Vergleich noch kaum zu erklären. Oder, um es mit den Worten von Svante Pääbo, Co-Autor einer Studie des „Chimpanzee Sequenzing and Analysis Consortium“, zu sagen: „Part of the secret is hidden in there, but we don´t understand it yet“ (Pääbo, in: Culotta, E., 2005).

Schon kurz nach der Veröffentlichung der Schimpansensequenz im September 2005, ergaben sich interessante Beobachtungen, zum Beispiel dass in Genen mit größerer Expressionsbreite (d.h. die in mehreren Gewebetypen aktiv sind), Expressionslevels und Sequenzmuster weniger zwischen den beiden Arten Mensch und Schimpanse divergieren als in Genen mit geringerer Expressionsbreite (Khaitovich, 2005). Interessant erscheint auch die Vermutung, dass in der Gruppe jener Gene, welche die stärkste positive Selektion zeigen, eine überraschend hohe Anzahl von tumorsuppressiven Genen involviert ist (Nielsen, 2005).

Nicht erst seit der Sequenzierung des Schimpansengenoms ist es bekannt, dass die afrikanischen großen Affen eine andere, geringere Empfänglichkeit für Krebserkrankungen aufzeigen als der Mensch. Eine Tatsache die auch kürzlich in einer vergleichenden Analyse erneut bestätigt wurde (Puente et al., 2006). Die Unterschiede bezüglich der Empfänglichkeit für Krebserkrankungen zwischen Schimpansen und Menschen sind zum Teil enorm: epitheliale Tumoren werden für 20% der Todesfälle in westlichen Industrienationen verantwortlich gemacht. Bei Schimpansen liegt diese Zahl unter 2%.

Es gibt verschiedene Gründe warum das so sein könnte:

- Umweltfaktoren (inkl. Ernährung und Gewohnheiten)
- unterschiedliche Lebenserwartung
- genetische Unterschiede

In der Humangenetik wird durch die Untersuchung der molekularen Ursachen von Krebserkrankungen eine wichtige Basis für mögliche Behandlungs- und Diagnosemethoden in der Zukunft geschaffen.

Ein besonders bedeutender Aspekt molekularer Onkologie ist das Verständnis der DNA-Reparatur, da eine gestörte DNA-Reparatur ein zentraler Mechanismus der Tumorentstehung ist.

Auf Grund der oben geschilderten Unterschiede bezüglich der Tumorempfänglichkeit von Schimpanse und Mensch erscheint es daher besonders sinnvoll, die DNA-Reparatur beider Arten miteinander zu vergleichen. Diese Überlegung liegt dem Cisplatinexperiment zu Grunde.

Im Cisplatinexperiment wurde versucht, durch labortechnische und bioinformatische Methoden Erkenntnisse über DNA- Reparaturmechanismen im Vergleich Mensch und Schimpanse zu gewinnen. Die erwarteten Ergebnisse sollten zur Klärung von Fragen bezüglich der unterschiedlichen Tumorempfäng-lichkeit beider Arten beitragen.

1. 1 Das Cisplatinexperiment

Wie bereits erwähnt, beeinflussen verschiedenste Faktoren zelluläre Abläufe und können zu Beschädigungen der DNA führen. Diese können die Reparaturmechanismen überfordern und zur Tumorentstehung führen.

Da die verschiedenen Reparaturmechanismen sehr komplex sind und z.T. in Kaskaden interagieren, wurde im Rahmen des Cisplatinexperiments versucht die Versuchsbedingungen zu standardisieren und nur eine begrenzte Anzahl Einflussfaktoren zuzulassen.

Es wurden Human- und Schimpansenzellkulturen mit Cisplatin, einem in der Krebstherapie eingesetzten Medikament, behandelt (Kap. 1.1.1). So wurde eine gezielte DNA-Schädigung provoziert, deren Reparatur in verschiedenen Zeitabständen beobachtet wurde.

Der Vergleich von Reparaturleistung, Genexpression und bioinformatisch generierten Daten sollte Aufschluss über die zu Grunde liegenden Mechanismen und potentiellen Unterschiede der DNA- Reparatur zwischen den beiden Arten geben.

Zunächst sollen die theoretischen Grundlagen des Cisplatinexperiments vorgestellt werden: Cisplatin (Kap. 1.1.1), die verschiedenen DNA-Schäden (Kap. 1.1.2), DNA-Repair (Kap. 1.1.3), Tumorgenese (Kap. 1.1.4) und Genregulation (Kap. 1.1.5).

1.1.1 Cisplatin

Der Großteil heute gegen Krebs eingesetzter Medikamente sind sogenannte Zytostatika (zellteilungshemmende Wirkstoffe). Ihre Funktionsweise beruht auf der Wechselwirkung mit DNA oder auf bestimmten Stoffwechselvorgängen während der Zellteilung. Sie können in einer aktiven Phase des Zellzyklus, nicht jedoch bei in der sogenannten G0-Ruhe-Phase befindlichen Zellen wirksam werden. Es werden folgende Gruppen von Zytostatika unterschieden (Arndt, 1996):

- DNA-alkylierende Agentien wie z. B. Stickstoff-Lost-Derivate (Cyclophosphamid), Nitrosoharnstoffe (Carmustin), Ethylenimine (Triethylenmelamin), Methansulfonate (Busulfan) und Platinkomplexe (Cisplatin);
- Antimetabolite wie z. B. Folsäureantagonisten (Methotrexat), Pyrimidinanaloga (5-Fluoruracil) und Purinanaloga (Mercaptopurin);
- Mitosehemmstoffe wie z. B. Vinca-Alkaloide (Vinblastin, Vincristin und Vindesin);
- Antibiotika wie z. B. Bleomycin, Mitomycin, Anthracycline (Daunorubicin und Doxorubicin) und Endiine (Neocarcinostatin, Dynemicin A und Estramycine)
- Enzyme wie z. B. L-Asparaginase;

Die anorganische Substanz von cis -Diamin(dichloro)platin(II), üblicherweise als Cisplatin oder cis -DDP bezeichnet, ist ein Krebsmedikament, das in die Klasse der DNA-schädigenden Agentien fällt. Cisplatin ist ein Schwermetall-Komplex mit einem zentralen Platin-Atom, dass umgeben ist von zwei Chlorid-Atomen und zwei Ammonium-Molekülen in der cis -Position (Abb. 1.1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.: 1.1: Cisplatinmolekül (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=441203)

Cisplatin ist ein weißes Pulver mit einem Molekulargewicht von 300,1. Es ist in Wasser und Salzlösung löslich und in Diethylformamid (PubChem, NCBI).

1.1.1.1 Wirkungsweise von Cisplatin

Cisplatin wird intravenös appliziert. Ungefähr die Hälfte des Platins wird wieder ausgeschieden. Der Rest verteilt sich auf verschiedene Gewebe. Als neutrales Molekül diffundiert Cisplatin passiv durch die Zellmembran in das Zytoplasma, wo eine wesentlich geringere Chloridionen-Konzentration herrscht. Durch Hydrolyse entstehen kationische Komplexe, die zur DNA diffundieren und dort unter Bildung zytotoxischer Veränderungen binden.

Nach Abspaltung von Cl- entstehen Bindungen zu den Stickstoffatomen von Nukleotidbasen und zwar in vitro zu N7 von Guanin (höchste Platin-Bindungsaffinität), zu N1 und N7 von Adenin und zu N3 von Cytosin. Durch die Wasserstoffbrückenbindungen in der DNA sind N1 von Adenin und N3 von Cytosin abgeschirmt (Huang, 1995).

Es gibt vier Bindungsmöglichkeiten von Cisplatin an Guanin in doppelsträngiger DNA (Abb. 1.2):

- Chelatkomplexbildung durch Stickstoff- und Sauerstoffkoordination an einer Base
- Verknüpfung zweier Nukleobasen eines DNA-Strangs ("intrastrand cross-linking")
- Quervernetzung zweier verschiedener DNA-Stränge ("interstrand cross-linking")
- Verknüpfung der DNA mit einem Protein

Bindungsanteile:

1,2-intrastrand d(GpG) cross-linking: 65 %

1,2-intrastrand d(ApG)"-Verknüpfung: 25 %

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.2: Bindungsmöglichkeiten von Cisplatin an DNA (www.jcu.edu.au/.../research/cisplatinweb.htm)

Den hohen Grad an Spezifität erklärt man durch die Platinkomplexen leicht zugängliche, große Furche der DNA-Doppelhelix und thermodynamische Faktoren.

1.1.1.2 Klinische Bedeutung von Cisplatin

Cisplatin ist seit 1979 zugelassen. Es wird als Einzelpräparat oder in Verbindung mit anderen Zytostatika gegen Hoden-, Ovarial-, Blasen- und Lungenkarzinome sowie gegen Tumore im Hals-Kopf-Bereich eingesetzt (Arndt, 1996).

Nebenwirkungen:

- Beeinträchtigungen des Gastrointestinalbereichs
- Myelotoxizität (knochenmarkschädigende Wirkung)
- Nephrotoxizität (nierenschädigende Wirkung)
- Ototoxizität (Schädigung des Hörnervs)
- periphere Neuropathien (Nervenleiden),

Einschränkungen der Therapie entstehen durch Resistenzen. Es gibt zwei Arten von Resistenzen gegen Cisplatin: 1. die erworbene Resistenz und 2. die angeborene Resistenz. Für Resistenzen werden mehrere Mechanismen angenommen:

- Hemmung der Wirkstoffaufnahme
- Zunahme der Produktion zellulärer Thiole (Erhöhung der Proteinfunktionalität)
- Erweiterte replikative Umgehung der Cisplatin-DNA-Addukte
- Veränderungen in der Konzentration von regulatorischen Proteinen:

(DNA Polymerase beta, ERCC1, PCNA, C-fos, C-myc, p53)

- Zunahme in der Reparaturantwort der Cisplatin-DNA-Addukte

Die Resistenzen können durch Verwendung alternativer Platinverbindungen umgangen werden, zum Beispiel durch Oxalplatin (Johnsson Matthey, JMB Overview, 2004). Wichtig ist es, im Rahmen des Cisplatinexperiments zu beachten, dass Resistenzen auch in vitro beobachtet wurden.

1.1.2 DNA-Schäden

Die DNA des Zellkerns ist in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus einer Vielzahl von Schädigungen ausgesetzt. Dabei kommt es allein durch die normalen, nicht-pathologischen Stoffwechselvorgänge in der Zelle täglich zu enorm vielen, ungefähr 70.000 Beschädigungen (Beneke, 2005). Schon eine einzige davon kann, unrepariert, zu ernsten Folgen für die Gesundheit führen. Eine der schlimmsten davon ist Krebs, von dem seit den 1970er Jahren ein direkter Zusammenhang mit DNA-Schädigungen bekannt ist (National Cancer Institute, Newscenter 1970).

Die Reparaturvorgänge zwischen nukleärer DNA (nDNA) und mitochondrialer DNA (mtDNA) unterscheiden sich (Abb. 1.3). nDNA ist auf Grund der spezifischen Art der Verpackung geschützter und dadurch weniger Noxen ausgesetzt als mtDNA. Letztere befindet sich innerhalb des stoffwechselaktiven Mitochondriums und ist vor allem durch oxidative Phosphorylierung (®ATP) erheblichem oxidativen Stress ausgesetzt und damit einer erhöhten DNA-Schädigung.

Grundsätzlich sind viele der DNA Repair-Mechanismen bei mtDNA und nDNA gleich oder ähnlich. Der wichtigste Unterschied ist, dass der mitochondriale Reparaturapparat ohne Nucleotide Excision Repair (NER) auskommen muss. Eine Tatsache, die zunächst durch die hohe Kopienzahl von mtDNA pro Mitochondrium (i.d.R. 3-6 Kopien) und durch die Reparatur über z.B. homologe Rekombination kompensiert werden kann, die aber dem alternden Organismus zunehmend Probleme bereitet. Beim Base Excision Repair (BER) sind die Zusammenhänge zwischen Altern und geringerer BER allerdings nicht so leicht herzustellen (Nilsen, Krokan, 2001).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.3: Reparaturwege mitochondrialer und nukleärer DNA (Best, 2005)

Im Folgenden soll nur die Schädigung von nDNA betrachtet werden, da Cisplatin, zumindest nach Kenntnislage, ausschließlich nukleäre DNA schädigt.

Folgende Schädigungen können auftreten (Strachan and Read, 1999):

- Verlust von Purin-Basen durch spontane Abspaltung von der Base-Zucker- Verbindung

Purin-Basen: Adenin und Guanin (Abb 1.4) sind die beiden Nukleotid- Basen des Purins

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.4: Nukleotidbasen des Purins

Base-Zucker-Verbindung: Verbindung zwischen dem C1-Atom des Zuckers und einem N-Atom der Base ® N-glykosidische Bindung (Abb. 1.5)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.5: N-glykosidische Bindung (www.uni-koeln.de/.../images/rojin_james04.gif)

- Deaminierung: Cytosine (Pyrimidin) und gelegentlich Adenine (Purin) deaminieren (= Stickstoff-Abgabe) spontan zu Uracil respektive Hypoxanthin (Abb. 1.6)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.6: Desaminierung von Cytosin

(www.zum.de/.../Materialien/beck/bilder/Cu1.gif)

- Chemische Substanzen, z.B. Alkylierende1 Agentien bilden Verbindungen mit DNA Basen (Abb. 1.7)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.7: Alkylierung von DNA-Basen

(www.zum.de/.../Materialien/beck/bilder/alk1.GIF)

Viele Umwelt-Chemikalien, aber auch zelleigene Stoffe können die DNA alkylieren. Empfindliche Stellen sind die Heteroatome der Basen.

Es entstehen pro Tag mehrere hundert 3-Methyladenin-Nukleotide. Alkylierende Agenzien wie Pestizide und Kampfgase verstärken die Alkylierung, sodass die natürlichen Reparaturmechanismen überfordert sind.

- Sauerstoffradikale: attackieren Purine und Pyrimidin-Ringe

Die Basen der Nukleinsäuren sind gegen eine Reihe von Chemikalien empfindlich. Z. B. Sauerstoff-, Peroxid- und Hydroxil-Radikale oder H2O2, die als normales Nebenprodukt von Oxidationen entstehen, aber auch durch ionisierende Strahlung (Röntgenstrahlung). Dabei werden die Basen oxidiert.

Ein typisches Produkt der Thyminoxidation ist Thyminglykol (Abb., 1.8):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.8: Thymin-Oxidation

(www.zum.de/.../beck/bilder/!thymin1.gif)

- UV-Licht: veranlasst Thymine zur Bildung stabiler Dimere.

Die häufigsten Photoprodukte durch UV-Licht sind Thymidindimere, genauer Pyrimidin-Cyklobutan-Dimere zwischen benachbarten Pyrimidinen. T-T-Dimere werden neben T-C oder C-T-Dimeren am häufigsten gebildet.

Die Abbildung zeigt ein T-T-Dimer. Dabei besteht der Cyklobutanring (blau) in Wirklichkeit aus gleichlangen Bindungen, was das DNA-Molekül an der Stelle verzerrt. Dimere können auch durch eine einzige kovalente1 Bindung zwischen dem C-Atom in Position 6 des Pyrimidins und dem C-Atom in Pos. 4 des anderen Pyrimidinrings entstehen (Abb. 1.9).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.9: Thymin-Dimer

(www.zum.de/.../beck/bilder/!thymin2.gif)

- Replikationsfehler resultieren im Einbau einer falschen Base
- Strahlung (z.B. Radioaktivität) verursacht Einzel- und Doppelstrangbrüche
- Strangbrüche der DNA: resultieren durch Replikations- und Rekombinations-fehler
- Crosslinks: Kovalente Verbindungen zwischen Basen des gleichen Stranges (® Intrastrand crosslinks) und gegenüberliegender Stränge (® interstrand-crosslinks)

Arten und Häufigkeit von DNA-Schädigung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab 1.1 (Beneke, 2005)

Strangvernetzungen (Intrastrand-, Interstrandcrosslinks) sind die Haupt-DNA-Schädigungen, die durch Cisplatin verursacht werden. Im Folgenden werden die verschiedenen Reparaturwege dargestellt. Besondere Gewichtung erhält die Nucleotide excision repair (NER), da sie der Hauptreparaturweg für die durch Cisplatin verursachten Crosslinking-Schädigungen der DNA ist.

1.1.3 DNA-Reparatur

Zur Reparatur von DNA- Schäden stehen der Zelle eine Vielzahl an Methoden zur Verfügung. Im Folgenden werden nun die wichtigsten, bekannten Methoden aufgeführt, wobei der NER, der Nukleotid Exzisions- Reparatur (engl.: „Nucleotide Excision Repair“) aus den genannten Gründen eine etwas größere Beachtung eingeräumt wird.

1.1.3.1 Direct Repair

Die direkte Reparatur (engl.: „Direct Repair“) erscheint vielleicht als der einfachste Weg eine DNA-Schädigung zu beseitigen, in den meisten Fällen stehen dem aber thermodynamische und kinetische Probleme im Weg (Huberman, 2006).

Es sollen 4 beispielhafte Reparaturwege der Direct Repair-Systeme dargestellt werden:

Beispiel 1

Eines der best- untersuchten Direct Repair-Systeme ist das CPD-Photolyase-System. Obwohl CPD Photolyasen nicht in Mammalia vorkommen, konnten Mäuse die genetisch dergestalt verändert waren, dass sie ein fremdes CPD Photolyase-Gen exprimierten, UV-resistenter gemacht werden (Huberman, 2006).

Grundsätzlich gibt es ein Problem mit Direct Repair-Mechanismen: sie gehen verschwenderisch mit den Ressourcen der Zelle um. Jeder einzelne Typ chemischer Veränderung an den Basen erfordert einen eigenen, spezifischen Reparatur- Mechanismus (Kimball, 2006).

Beispiel 2

Die Dealkylierung von O6- Alkylguanin. Dabei wird die Alkylgruppe (z.B. CH3) die sich an die DNA angelagert hat und somit für eine Punktmutation gesorgt hatte, zu einem Cystein-Molekül in einer O6-Alkyltransferase transferiert. Die Alkyl-Gruppe kann in der Größe von Methyl bis Benzyl reichen. Natürlich muss dann auch das Protein (die O6-Alkyltransferase) dealkyliert werden, denn nach dem Transfer der Alkylgruppe ist das Protein weitgehend inaktiviert. Diese erfordert eine erhöhte Synthese (und damit eine erhöhte Transkription) des Proteins; sollte zum Beispiel aber das kodierende Gen durch epigenetisches Silencing stillgelegt sein, erhöht sich die Mutationsrate und damit das Krebsrisiko (Huberman, 2006).

Beispiel 3

AlkB vermittelte Demethylierung (Abb. 1.9). AlkB ist ein nahezu ubiquitäres Protein das zu den alpha-keto-glutarat-abhängigen Oxygenase-Enzymen gehört. Diese Enzyme oxidieren chemisch inerte Verbindungen. AlkB ist in der Lage, die Methylierung1 umzukehren.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.9: AlkB vermittelte Demethylierung (Huberman, J., 2006)

AlkB katalysiert die Reaktion, welche die oxidative Decarboxylierung2 der Alpha-Keto-Glutaminsäure (aKG) mit der Hydroxylierung3 (OH-Gruppe) der Methylgruppe koppelt. Die Methylgruppe zerfällt dann spontan zu Formaldehyd H-CHO und der Originalzustand der Base ist wieder hergestellt.

Beispiel 4

Das Schließen von Kerben in der DNA durch DNA-Ligasen. Die Ligasen können allerdings ausschließlich Kerben mit 5’–Phosphat und 3’-Hydoxyl-Konfiguration reparieren. Andere Konfigurationen, oder zusätzliche Schäden im DNA-Zucker-Phosphat-„Rückgrat“ oder der Basen, benötigen erheblich kompliziertere Mechanismen. Da diese dann zum Teil erst vor der eigentlichen Reparatur durch die Ligasen erfolgen müssen, gehören sie nicht mehr unbedingt zu den Direct Repair-Systemen (Huberman, 2006).

1.1.3.2 Excision Repair

Es gibt 3 Kategorien der Exzisionsreparatur:

1. Base Excision Repair (BER); repariert Schäden von 1-8 Basen Länge
2. Nucleotide Excision Repair (NER); repariert Strangschäden von bis zu 30 Basen Länge
3. Mismatch Repair (MMR); repariert durch Fehlpaarung entstandene Schäden

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

zu 1.) Base Excision Repair

Base Excision Repair (BER) repariert vorwiegend Schäden, die durch Hydrolyse, Alkylierung oder Oxidation von Nukleotidbasen entstanden sind.

BER geschieht über zwei Wege: short-patch BER und long-patch BER (Abb. 1.10). Dabei scheint die short-patch BER etwa 75-90% der BER´s auszumachen (Nilsen u. Krokan, 2001). BER benötigt drei Enzyme: eine Glycosylase, eine Endonuklease und eine Polymerase.

Kompliziertere Basenmodifikationen können nicht über den Short-Patch-Weg repariert werden, sondern müssen den Long-patch-Weg gehen.

Grundsätzlich wird die BER durch eine Glycosylase eingeleitet. Bei der short patch BER interagiert PolB direkt mit HAP1 um ein Nukleotid einzufügen. Die verbleibende Lücke wird von der Ligase 3 in Zusammenarbeit mit XRCC1 wieder aufgefüllt.

Bei der Long-patch BER werden bis zu 8 Nukleotiden wieder aufgefüllt. Trotzdem ist der Name „long-patch“ irreführend: die weitaus meisten Synthesen sind nur 2 nt´s lang (Nilsen u. Krokan, 2001). Theoretisch könnten die Lücken mit Ligase 3 aufgefüllt werden; ist PCNA in den Reparaturkomplex involviert, was meistens der Fall ist, wird mit Ligase 1 aufgefüllt.

Es gibt offenbar bislang keine bekannten Krankheiten (beim Menschen), die auf einer defekten BER beruhen (Strachan & Read, 1999). Das könnte daran liegen, dass Defekte dieser Art lethal sind.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.10: Short- und Long-Patch BER (Cambridge University Press, 2005)

zu 2.) Nucleotide excision repair

Nucleotide Excision Repair (NER) ist einer der Hauptwege menschlicher DNA-Reparatursysteme. NER besteht aus zwei Unterpfaden und zwar der Global Genome Repair (GGR) und der Transcription-Coupled Repair (TCR). TCR wurde entdeckt als man die Eigenschaften der Zellen von Patienten mit Cockayne Syndrom (CS) und Xeroderma Pigmentosum (XP) verglich (Cooper et al., 2005). Beides sind Erbkrankheiten und haben eine extreme UV-Empfindlichkeit zur Folge. Allerdings gibt es einen entscheidenden Unterschied: bei XP fehlt die Fähigkeit UV-induzierte, globale DNA-Schäden zu reparieren. bei CS ist dieser globale Reparaturmechanismus (GGR) intakt; dafür ist ein anderer Mechanismus defekt, welcher für die direkte Reparatur aktiv transkribierter Gene sorgt: Transcriptipon-Coupled Repair (TCR).

Global genome repair

GGR ist der langsamere Reparaturweg und überprüft schrittweise das ganze Genom (Abb. 1.11). Er erkennt Strangdefekte mit den XP-Proteinen, so genannt weil ein Defekt in den diese Proteine kodierenden Genen (7 Gene: XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG) zu Xeroderma Pigmentosum führt.

Grundsätzlich lässt sich GGR in 6 Schritte unterteilen, wobei die ersten beiden Schritte ohne zusätzliche Energie in Form von ATP ablaufen, während die nachfolgenden Schritte ATP rekrutieren (Riedl, 2003) :

1. Schritt: NER-Komplex 1 (NER-C1)

XPC-HR23B bindet an die Schadensstelle und leitet den „Vorschnittkomplex“ ein.

2. Schritt: NER-Komplex 2 (NER-C2)

Transcriptionsfaktor IIH (TFIIH), zu dessen Bestandteilen die Helikasen XPB und XPB gehören, bindet an NER-C1 und entwindet die DNA im Bereich der Schadensstelle. Er liefert außerdem Substrate für die später dazukommenden Endonukleasen.

SCHRITT 1 UND SCHRITT 2 BILDEN DEN INITIATIONSKOMPLEX

(OHNE ATP)

3. Schritt: NER-Komplex 3 (NER-C3)

Ab jetzt kommt zusätzliche Energie in Form von ATP ins Spiel. XPA und NER-C2 bilden NER-C3. XPA fungiert als eine Art Keil um die DNA- Struktur „fertig“ zu machen für die nächsten Schritte.

4. Schritt: NER-Komplex 4 (NER-C4)

Das Einzelstrang-bindende Protein RPA kommt jetzt dazu und bildet mit NER-C3 zusammen NER-C4. Es interagiert mit XPA und stabilisiert es gleichzeitig innerhalb des NER-C4.

5. Schritt: NER-Komplex 5 (NER-C5)

Die Endonuklease XPG bindet etwa 2 Nukleotide 3’-aufwärts der Schadensstelle und bildet mit NER-C4 zusammen NER-C5. Mit der Ankuft von XPG wird XPC-HR23B abgespalten. Es bleibt funktionell aktiv um neue Inzisionen einzuleiten.

6. Schritt: NER-Komplex 6 (NER-C6)

Das Anbinden von XPF-ERCC1 vervollständigt den sogenannten „dual incision“-Komplex, der an zwei Stellen, 3’ und 5’ zur Schädigung, ein 20-40 Nukleotide großes Stück herausschneidet.

SCHRITT 3 BIS SCHRITT 6 LAUFEN MIT ZUSÄTZLICHER ENERGIE (ATP) AB

Nach dem letzten Schritt spaltet sich TFIIH ab und steht einerseits wieder der NER aber auch der Pol II-Transkription zur Verfügung (TFIIH kann also zwischen DNA- Repair und mRNA Synthese hin und herwandern).

Mit der Ankunft weiterer Resynthesefaktoren –die ausgeschnittene Stelle muss wieder aufgefüllt werden- werden alle NER-Faktoren wieder abgegeben: bis auf RPA. RPA ist ein integrativer Bestandteil beider Prozesse, der NER und der Resynthese. Offenbar fungiert RPA einerseits als Schutz des ausgeschnittenen Strangs vor den unbeabsichtigten Angriffen durch Nukleasen und andererseits als „Promoter“ für die Bindung von PCNA und RFC, welche die Resynthese starten. Zum Resyntheseapparat gehören außerdem Ligase und die DNA-Polymerasen Delta und Epsilon (Riedl, T., 2003).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.11 (Riedl, T., 2003)

Transcription-coupled repair

Transcription-Coupled Repair (TCR) ist für die Reparatur aktiv transkribierter Gene zuständig (Abb. 1.12). Dieser aktiv transkribierten DNA wird höchste Priorität eingeräumt. Üblicherweise detektiert ein TCR-Enzym eine durch DNA-Schäden gestoppte RNA Polymerase. Diese Enzyme werden als CS-Enzyme zusammengefasst, weil ihr Fehlen oder ihre Beschädigung das sogenannte Cockayne-Syndrom hervorruft, eine schwere Form vorzeitigen Alterns die unweigerlich zu einem frühen Tod führt, während XP-Patienten bei entsprechendem Verhalten ein relativ normales Leben führen können: außer sie haben die Variante XP-V. Diese Patienten sind aufgrund der durch XP-V verursachten Mutation Translesion bypass-defizient. Sie entwickeln Hautkrebs um das 20-30 Lebensjahr herum (Mullenders, Stary and Sarasin 2001).

CS-Patienten haben eine Lebenserwartung von ca. 12 Jahren und sind körperlich und geistig schwer retardiert.

Das Cockayne-Syndrom entsteht durch Mutationen von CSA oder CSB-Genen (Mutationen in XPB, XPD und XPG können auch klinische CS verursachen).

Während der Transkription kann es passieren, das die Pol II auf ein z.B. durch UV-Licht oder oxidativen Stress beschädigtes Nukleotid stösst und anhält, also ihren Transkriptionsprozess unterbricht (das kann übrigens auch der Fall sein bei einer hochrepetitiven Sequenz, bei der sich die DNA auf sich selbst faltet).

Jetzt kommt der TCR-Prozess in Gang: egal ob der Grund für das Anhalten der POL II ein DNA-Schaden war oder nicht, die Proteine XPG und CSB gehen davon aus das die angehaltene Transkription nachteilig ist und detektieren den Stop. Bei diesem Vorgang wird CSB von XPG unterstützt; das könnte die Erklärung dafür sein, das Mutationen des XPG kodierenden Gens auch zu CS führen, auch wenn CSB korrekt arbeitet.

Eine weitere Funktion von XPG ist es, den beschädigten Strang an einer Seite der Läsion zu schneiden. Um die um alle beiden Stränge „geklammerte“ Transkriptionsblase zu öffnen, welche ja verhindert, dass XPG an den beschädigten Strang herankommt, bindet jetzt TFIIH. Dieser Transkriptionsfaktor ,der auch bei der GGR eine wichtige Rolle spielt, verursacht eine Konformationsänderung der POL II und „öffnet“ die Klammer.

Das könnte im Übrigen auch erklären, warum XPB und XPD, beides Bestandteile von TFIIH und beide mit XP assoziiert, bei Mutation der entsprechenden kodierenden Gene das Cockayne-Syndrom verursachen können (Cooper, 2005).

Auf jeden Fall zeigt dieser Mechanismus deutlich die Effizienz der TCR: die Beschädigung wird beseitigt, während die POL II nicht entfernt wird und die bislang transkribierte Information nicht verloren ist. Nur wenn dieses Vorgehen und alle Alternativen scheitern, wird POL II zerstört und die Transkription neu gestartet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.12 (Cooper et al., 2005)

zu 3.) Mismatch Repair

DNA Mismatch Repair (MMR) ist ein hoch konservierter Reparaturmechanismus, ein Umstand der seine Bedeutung unterstreicht (Edelbrock, 2005).

MMR repariert Nukleotidfehlpaarungen und InDel-Loops (IDLs), die durch Replikation, Rekombination oder Reparaturfehler entstehen (Abb. 1.13).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.13: DNA-Mismatch Repair (www.bio.miami.edu)

Besonders das Fehlen der Reparaturfähigkeit bei InDel-Loops, die durch das „Verrutschen“ des neusynthetisierten Stranges entstehen, führt zur sogenannten Mikrosatelliten-Instabilität (MSI). Dadurch verändern sich die Längen dieser repetitiven Bereiche.

Eine defiziente MMR ist assoziiert mit dem erblichem nicht-polypösem kolorektalem Karzinom (HNPCC). Mit etwa 55.000 jährlichen Neuerkrankungen machen bösartige kolorektale Tumore ungefähr 1/3 aller Krebserkrankungen in Deutschland aus. Männer sind häufiger betroffen als Frauen. Man geht von 5-10% genetischer Prädisposition aus (Rädle, 2005).

MMR kann A-C und T-C Fehlpaarungen effektiver korrigieren als G-A und T-C Fehlpaarungen. Besonders problematisch sind C-C Fehler.

Zwei Heterodimere von MutS -Homologen (für die DNA-Strang-„Überwachung“ zuständig, homolog zu MutS von E.coli) wurden in menschlichen Zellen gefunden (Abb. 1.14):

hMSH2 und hMSH6 erkennen und binden an Fehlpaarungen und kurzen IDLs. Dieses Heterodimer wird als hMutS a bezeichnet. Das hMutS b Heterodimer, bestehend aus hMSH2 und hMSH3 bindet an längere, bis zu 12 Nukleotide langen IDLs. Wenn eine Zelle hMSH2-Proteine nicht exprimiert, fehlen auch die assoziierten Partner hMSH3 und hMSH6; ein Problem das direkt mit defekter MMR und zu einem hohen Prozentsatz mit HNPCC in Zusammenhang gebracht wird (Edelbrock, M. 2005).

Von den MutL- Homologen sind drei bekannt:

hMLH1 und hPMS2 bilden zusammen das hMutL a Heterodimer. Das zweite Heterodimer, hMutL b wird aus LMH1 und PMS1 gebildet. Das dritte Heterodimer besteht aus MLH1 und MLH3 (= hMutLγ). Experimente mit transgenen Mäusen legen jedoch die Vermutung nahe, dass diese beiden nur eine untergeordnete Rolle in der MMR spielen, da Knockout-Mäuse keine Karzinome entwickelten.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.14: (Universitätsklinikum des Saarlandes, Innere Medizin)

Im Gegensatz dazu bewirkt das Fehlen des hMLH1 Proteins das Fehlen des hPMS2 Proteins (beim hMutL a - Dimer). Dieses wiederum führt zu defekter MMR, MSI und damit zu einem hohen Prozentsatz an HNPCC. Man vermutet, dass das MutLa Heterodimer als eine Art Vermittler zwischen dem MutSa- DNA-Komplex und Enzymaktivitäten, die stromabwärts für Identifizierung, Exzision und Ersatz der unkorrekten Base verantwortlich sind, fungiert.

Am komplexen MMR Reparatursystem sind außerdem PCNA (proliferating cell nuclear antigen), EXO1 (Exonuclease 1), RPA (replication protein A), RFC (Replikatin Faktor C) DNA Polymerase δ und Energie in Form von ATP aktiv beteiligt (Edelbrock, 2005).

Da eine Menge Untersuchungen zur MMR an E. coli und S. cerevisiae stattfanden, soll die untenstehende Tabelle als „Homologenschlüssel“ dienen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab. 1.2: Homologenschlüssel (Roswell Park Cancer Institute)

1.1.3.3 Einzelstrangbruchreparatur

Ungefähr 50.000 Einzelstrangbrüche pro Zelle kommen täglich vor. Damit gehören Einzelstrangbrüche zu den häufigsten DNA Läsionen (Beneke, 2005). Unrepariert sind sie ein Hauptstressor genetischer Stabilität und eine Gefahr für das Überleben der Zelle. Sie beschleunigen Mutationen und lassen Chromosomenaberrationsraten ansteigen (Brem, 2005).

Die folgende Abbildung (Abb. 1.15) zeigt die Grundprinzipien der Einzelstrangreparatur (SSBR) für Säugerzellen; Hefen besitzen keine Homologen zu PARP, XRCC1 und DNA Ligase III (Huberman, 2005).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.15: DNA-Einzelstrangbruchreparatur (Roswell Park Cancer Institute)

Zuerst muss der Bruch detektiert werden. Zuständig hierfür ist PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase, in der Abbildung gelb), welches an den Strangbruch bindet.

Als nächstes binden XRCC1 (orange) und DNA Ligase III (grün). Um die Strangenden in 5’-Phosphat und 3’-OH zu konvertieren und die Lücken zu schließen, werden PNK (Poly-Nukleotid-Kinase) und Polymerase β rekrutiert.

Anschließend schließt Ligase III die verbleibende Lücke (Huberman, 2005).

Bei der SSBR spielt XRCC1 eine sehr wichtige Rolle. Eine Reduktion von XRCC1-Protein in humanen Zellen führt zu einer Abnahme der Einzelstrangreparaturtätigkeit (Brem, 2005).

1.1.3.4 Doppelstrangbruchreparatur (DSBR)

Die Doppelstrangbruchreparatur korrigiert Doppelstrangbrüche (DSB) der DNA. DSB können in Größenordnungen von bis zu 10 pro Zelle pro Tag (Beneke, 2005) vorkommen und gehören zu den sehr gefährlichen DNA-Schäden. Sie werden nicht nur durch exogene Einflüsse wie radioaktive Strahlung und andere genotoxische Noxen verursacht, sondern auch durch endogene Einflüsse wie z.B. Replikationsgabelbruch. Darüberhinaus entstehen DSB´s im meiotischen DNA-Stoffwechsel (Spaltung durch Endonukleasen) und beim Rearrangement von Immunglobulinen. Die Zelle muss die beiden auseinander gebrochenen Enden wieder zusammenfügen, oder homologes DNA-Material an Ort und Stelle bringen, um keine Zyklusarreste oder die Apoptose (= der programmierte Zelltod) auszulösen (Shin, 2004).

Um den sehr komplexen und bislang noch nicht vollständig verstandenen Reparaturprozess zu kontrollieren, müssen unter anderem auch Konformations- und Oberflächenstrukturänderungen während der beteiligten DNA-Protein- und Protein-Protein-Interaktionen stattfinden; ein Umstand der erklärt, warum die hier verwendeten Proteinkomplexe größer als in anderen Reparatursystemen sind (Shin, 2004).

Zwei Reparaturwege für DSB´s sind bekannt:

1. Homologe Rekombination (HR, oder RER), und
2. Non-Homologous end joining (NHEJ)

zu 1.) Homologe Rekombination

Das Schlüsselenzym für die homologe Rekombination ist Rad51. Es bildet mit anderen Proteinen und einzelsträngiger DNA Reparaturkomplexe, die im Zellkern als Focus sichtbar sind (Haaf et al., 1995, 1999).

HR ist eine relativ genaue, wenn auch weniger verwendete Methode der DSB-Reparatur. Sie findet überwiegend während der S- und G2- Phase des Zellzyklus (also vor der Mitose) statt und verwendet DNA von Schwesterchromatiden oder homologen Chromosomen als Matrize um neue, fehlerfreie DNA zu synthetisieren.

Das RAD52-Protein erkennt den DSB und lagert sich an die beiden Enden an, während RAD51 nach geeignetem Material, also einer homologen Sequenz auf einem unbeschädigten Schwesterchromatid sucht. Dabei wird es offenbar durch BRCA2 unterstützt (Orelli, 2001). Das BRCA1 Protein scheint eher indirekt in diesen Prozess involviert zu sein. Auf jeden Fall sind beide, BRCA1 und BRCA2 wichtige Faktoren der Homologen Rekombination denn BRCA1- und BRCA2-defekte Zellen sind auch defizient in der HR, ein Umstand der ernste Auswirkungen auf die betroffenen Zellen hat (Liu, 2002 ).

Bislang können zwei Wege der homologen Rekombination erkannt werden (Abb. 1.16): Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA) und Single-Strand Annealing (SSA).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.16: Homologe Rekombination (www.Cellectis.com)

In der oben gezeigten Version konservativer DNA Synthese (Abb. 1.16, links), entsteht ein Doppelstrangbruch in einem der zwei homologen Chromosomen (grün).

Die 5’-Enden werden durch eine Endonuklease entfernt um die 3’-Enden in einer Einzelstrangform zu exponieren. Durch Rad51 vermittelte Proteine, finden die 3’-Enden komplementärer Regionen in den Schwesterchromatiden, bzw. homologen Chromosomen (blau).

Nach dieser sogenannten „Strang-Invasion“ (engl.: strand invasion) werden die 3’-Enden als Primer (= Starter-Sequenzen) zur Synthese neuer DNA benutzt (rot), indem sie die Donor Stränge (blau) als Matrize benutzen. Nach entsprechend langer Synthese sind die neuen Stränge lang genug um sich einander anzunähern und „verschmelzen“ zu können. Überhänge werden dabei durch eine sog. Flap-Endonuklease geschnitten, Lücken durch eine Polymerase aufgefüllt. Verbleibende Kerben schließt eine Ligase. Das Chromosom (grün) ist nun repariert und enthält in der neu synthetisierten Region genetische Information des blauen Chromosoms (www.Cellectis.com/dsbr).

Im Unterschied zur SSA ist die SDSA konservativ. Das bedeutet, dass beide Stränge der reparierten DNA des defekten Chomosoms neu synthetisiert werden, während dessen beide Matrizenstränge wieder zurück an das homologe Chromosom (bzw. Schwesterchromatid) gehen.

Single strand annealing (Abb. 1.16, rechts) beginnt ähnlich wie SDSA: nach dem Doppelstrangbruch werden die 5’-Enden geschnitten. Dadurch werden komplementäre Regionen innerhalb der 3’-„Stränge“ exponiert, welche die Bruchstelle flankieren (oft flankieren short repeat-Sequenzen).

Die Überhänge werden durch „Flap removal“ entfernt (FEN1-ähnliche Nuklease) und ligiert.

Der Doppelstrangbruch ist nun repariert, hat aber die Information der beiden „Flaps“ verloren. Der grundlegende Unterschied zu SDSA ist, das SSA nicht konservativ ist (www.Cellectis.com/dsbr).

Offenbar benutzen die meisten die Doppelstrangbruchreparatur-Systeme, welche mit Hilfe von Schwesternchromatid- oder Homologen-DNA reparieren, eine wie auch immer geartete Variante der SDSA.

Gelingt die Synthese nicht, so ist mit ernsten Erkrankungen wie dem Bloom-Syndrom zu rechnen (Adams, 2003). Das Bloom-Syndrom ist eine autosomal-rezessive Erkrankung mit u.a. schweren prä- und postnatalen Entwicklungsstörungen und UV-Unverträglichkeit (OMIM, Bloom syndrome, #210900).

(zu 2.) Non-homologous End-joining (NHEJ)

Beim NHEJ werden, einfach ausgedrückt, die freien DNA-Enden zwei oder mehrerer Bruchorte in falscher Kombination wieder zusammengefügt (Abb. 1.17). Voraussetzung dafür ist, dass die beteiligten Enden während der Reparatur zeitlich und räumlich zusammentreffen. Dabei gibt es offenbar einen Zusammenhang zwischen der Fehlverknüpfungswahrscheinlichkeit und der räumlichen Nähe zum Zeitpunkt der DSB Induktion (engl.: „Proximity Effect“). Es ist wahrscheinlich, dass homologe Chromosomen in Reichweite sind: Chromosomen nehmen innerhalb des Kerns eine territoriale Anordnung ein. Genreiche Chromosomen befinden sich im inneren, genärmere im äußeren Bereich des Kerns. Innerhalb der Territorien gibt es eine radiale Anordnung, sodass früh replizierende, genreiche Regionen sich zum Kerninneren hin ausrichten. Beides zusammen, also Territorialität und Radialität führen zu einer Anreicherung in einem Subvolumen des Kerns. Die genannten Ereignisse erhöhen die Wahrscheinlichkeit von Interaktionen zwischen Genen (Friedl, 2003).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.17: DSBR- NHEJ (Budman und Chu, 2005)

1.1.4 Tumorgenese

Unsere Erbinformation, die DNA, ist permanent einer großen Vielfalt von Angriffen und Schädigungen durch innere und äußere Einflüsse ausgesetzt.

Der entstehende Schaden reicht von einigen veränderten Nukleotiden eines einzelnen Strangs bis zu Doppelstrangbrüchen der DNA-Doppelhelix.

Weil diese Schädigungen sich akkumulieren und zu schweren Stoffwechseldefekten und Tumorbildung führen können, hat die Natur ein ganzes Arsenal an Reparaturmöglichkeiten entwickelt, von denen die bis jetzt bekannten, im wesentlichen bereits in Kapitel 1.1.3 dargestellt wurden.

Jede Zelle hat drei Möglichkeiten: sie kann ihren Zellstatus halten, sie kann sich teilen oder sie kann in die Apoptose gehen. Einige Zellen haben darüber hinaus die Option sich zu differenzieren. Die Zellen wählen eine dieser Optionen als Reaktion auf interne und externe Signale. Diese Signale führen zu einem komplexen Netzwerk von Interaktionen, deren Ergebnis nicht immer einfach vorherzusagen ist. Dabei können Schäden am Genom entstehen (Strachan, & Read., 1999).

Das Genom ist die Gesamtheit aller biologischen Informationen und DNA-enthaltenden Strukturen im Zellkern eines Individuums.

Grundsätzlich kann innerhalb des Genoms zwischen gen- und genähnlichen und extragenen DNA-Sequenzen unterschieden werden (Passarge, 2004).

Gesunde Körperzellen reparieren Schäden am Genom und teilen sich danach. Gelingt dies nicht, gehen sie in die Apoptose, den programmierten Zelltod. Die Integrität des Genoms wird vom TP53-Gen kodierten p53- Protein kontrolliert. Es wird daher auch als „Hüter des Genoms“ bezeichnet.

Können die Schäden nicht repariert werden und gelingt es der Zelle nicht, in die Apoptose zu gehen, entstehen sich autonom und progressiv vermehrende, entartete Zellen. Diese Zellen können dann Tumore bilden (Roche Medizin 3., 1993).

Damit ein maligner Tumor entstehen kann, müssen zwei Dinge geschehen: das Genom einer Zelle muss zum einen durch „karzinogene“ Faktoren transformiert und zum anderen durch „ko-kazinogene“ Faktoren zum wachsen gebracht werden.

Zellwachstum wird normalerweise mittels Anregung und Inhibition durch sogenannte Wachstumsfaktoren kontrolliert. Verliert die Zelle über diese Mechanismen die Kontrolle, kann sie aus ihrem Verband ausbrechen und „metastasieren“. Durch Verlust der Fähigkeit zur Inhibition kann sie „immortalisiert“, also unsterblich gemacht werden.

Normalerweise gibt es sehr wirksame Mechanismen, die dafür sorgen, dass jede Beschädigung oder Transformation der DNA repariert wird. Und selbst wenn eine oder zwei Beschädigungen nicht repariert werden konnten, muss dass nicht notwendigerweise zur Tumorgenese führen.

Untersuchungen haben gezeigt, dass mindestens 6-7 Mutationen pro Zelle notwendig sind um diese in eine Krebszelle zu transformieren (Strachan, & Read, 1999).

Kazinogene und ko-karzinogene Stoffe wirken letztlich auf zwei Gruppen von Genen, die man zusammengefasst als Onkogene bezeichnet (dieser Begriff ist etwas irreführend, da nur eine Veränderung nicht aber die normale Funktion „onkogen“ ist).

Bei der ersten Gruppe von Onkogenen besteht die normale Funktion darin, „an der Kontrolle von Zellproliferation und –differenzierung durch Interaktion mit Wachstumsfaktoren und membrangebundenen Rezeptormolekülen beteiligt zu sein“ (Passarge, 2004). Dabei unterliegen sie drei wesentlichen Grundmechanismen: Phosphorylierung von Signalproteinen, Signaltransduktion durch GTPasen und Kontrolle der DNA-Replikation (Passarge, 2004).

Durch Mutation bereits eines Allels (normalerweise hat jedes Gen an einem bestimmten Genlocus zwei Allele, also je eine maternale und eine paternale Form) können sie tumorauslösend in die Kontrolle der Zellproliferation eingreifen. Mutationen können z.B. Punktmutationen, Translokationen und Gen-Amplifikationen sein. Auf jeden Fall sind die Mutationen, die zur Aktivierung der Onkogene führen somatischer Natur, dass heißt sie werden nicht über die Keimbahn vererbt; diese wären vermutlich lethal (Strachan, & Read, 1999).

Die Gene der zweiten Gruppe werden als Tumor-Suppressor-Gene bezeichnet. Sie wirken normalerweise inhibierend auf die Zellproliferation.

Während die Onkogene der ersten Gruppe (eigentlich Proto-Onkogene) dominant sind, also ein betroffenes Allel zur Ausprägung bereits ausreichend ist, sind die Suppressor-Gene rezessiv. Das heißt, auf beiden Allelen muss ein Ereignis passieren damit das Gen inaktiviert wird. Dabei kann die erste Mutation germinal (keimzellbezogen) oder somatisch sein. Der Unterschied ist, das bei einer germinalen Mutation alle Zellen prädispositioniert sind, während bei einer somatischen Mutation zunächst nur eine Zelle betroffen ist. Ein Tumor entsteht dann nach Funktionsverlust des zweiten Allels, und zwar sporadisch bei der somatisch mutierten und hereditär bei der germinal mutierten Zelle (Passarge, 2004).

Von den Tumor-Suppressorgenen gibt es nur wenige, geschätzt werden ein paar Dutzend. Im Gegensatz dazu gibt es weit über hundert dominante Onkogene (Friedrich, 2005).

Eine Darstellung des Ablaufes möglicher Wege der Tumorbildung wurde in Abb. 1.18 versucht.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1.1.5 Genregulation

Durch die Schädigung der DNA einer Zelle durch Cisplatin werden, wie bereits geschildert, bestimmte Reparaturmechanismen auf den Plan gerufen. Dazu müssen sogenannte Reparaturgene, welche für die entsprechenden Reparatur- Proteine kodieren, reguliert werden.

Die Regulation von Genen, deren Information innerhalb eines kodierenden Bereiches liegt, wird über komplexe intrazelluläre Vorgänge gesteuert, der sogenannten Genexpression (Passarge, 2004).

Die Expression eines Gens kann qualitativ und quantitativ erfasst werden und ermöglicht Aussagen über dessen Bedeutung innerhalb eines Stoffwechselprozesses.

1.1.5.1 Transkription

Das Umschreiben der Information eines DNA-Stranges in ein RNA-Molekül ist die erste Phase der Dekodierung eines aktiven Gens (Passarge, 2004). Dabei kann die Transkription aktiviert oder gehemmt werden.

Katalysiert wird die Transkription durch RNA-Polymerase. Auf Grund der ausgesprochenen Spezifität der Transkription gibt es drei verschiedene RNA-Polymerasen mit verschiedenen Promoter-Regionen und verschiedenen Aufgaben. RNA-Polymerase I und RNA-Polymerase III synthetisieren RNA welche Polypeptid-kodierenden Genen bei der Expression assistiert (rRNA, tRNA etc.). RNA-Polymerase II transkribiert Polypeptid-kodierende Gene (Strachan & Read, 1999).

Um die Transkription zu starten, bindet die RNA-Polymerase und andere zahlreiche Proteine (Transkriptionsfaktoren) an spezifische, evolutionär konservierte DNA-Sequenzen, die deswegen auch Promoter genannt werden. Für ein Gen können sehr viele Promoter existieren und deren unterschiedlicher Gebrauch resultiert in vielen alternativen Isoformen (Strachan, & Read, 1999). Gestartet wird die Transkription 5´-aufwärts eines Gens und verläuft dann in 5´- 3´-Richtung (also von der Hydroxy-Gruppe an Position C5 eines Zuckerrestes in Richtung Position C3 des nächsten Zuckerrestes) bis zum definierten Ende (Stop-Kodon). Dort wird der Transkriptionskomplex entfernt (terminiert).

Durch Modifikation eines Kodons kann das Stopkodon schon innerhalb der kodierenden Sequenz liegen. Es entsteht der Sonderfall des RNA-Editing, der zu einer veränderten Form des Genproduktes führt (Bsp.: Apo-B-100/Apo-B-84 Protein).

Reguliert wird die Transkription zusätzlich durch regulatorische Sequenzen die 5´-aufwärts, 3´-abwärts und auch innerhalb der Introns eines Gens liegen können. An diese binden gen-regulatorische, DNA-bindende Proteine spezifisch, z.B. Zinkfingerproteine, Hormone response-Elemente etc. (Strachan & Read, 1999).

Die Transkription ist sehr schnell: es werden pro Minute ca. 1800 Nukleotide polymerisiert.

Die vorläufige Version der mRNA, auch primäres Transkript genannt, wird noch im Zellkern transformiert. Dabei werden Introns (bestimmte, nicht-kodierende Bereiche) herausgeschnitten und eine (7-Methyl-Guanosin-) 5´-„Kappe“ (Cap) und ein 3´-„Poly-A-Schwanz“ (Tail), also eine Polyadenylierung, angehängt.

Es können auch Exons (kodierende Bereiche) entfernt werden, den spezifischen Stoffwechselanforderungen entsprechend. Diesen Vorgang bezeichnet man als alternatives Spleissen (engl.: „alternative splicing“).

RNA-Polymerisierung und Verarbeitung finden im Zellkern statt. Danach verlässt die fertige mRNA den Kern und wird im Zytoplasma von den Ribosomen „übersetzt“, translatiert (Strachan & Read, 1999).

Ein Gen kann auch noch nach der Transkription inaktiviert werden und zwar durch posttranskriptionale Stilllegung (engl.: „Gene Silencing“) durch RNA-Interferenz (RNAi). Dabei werden kurze, doppelsträngige RNA-Moleküle (21-23 bp), auch (engl.) small interfering RNA (siRNA) genannt, mit hoher Spezifität für das Zielmolekül mit Helikase und Nuklease-Molekülen assoziiert (RNA induced silencing complex = RISC). Der RISC bindet an die mRNA-Moleküle und spaltet diese. Die Bruchstücke werden von zellulären RNA-Nukleasen verdaut (Passarge, 2004).

1.1.5.2 Regulation der Transkription durch Promoter

RNA-Polymerase allein kann DNA nicht einfach transkribieren. Sie muss zuerst die Transkriptionsstartstelle erkennen und daran gebunden werden. Dies wird vermittelt durch Transkriptionsfaktoren.

Cis- und Transacting elements

Als Erkennungssignal für die Transkriptionsfaktoren dienen kurze Sequenzen der DNA, welche normalerweise stromaufwärts des zu transkribierenden Gens liegen. Diese Sequenzen, die evolutionär hochgradig konserviert sind (Konsensussequenzen), bilden zusammen den Promoter. Diese Promoterelemente werden (engl.) als „cis-acting“ bezeichnet, da ihre Funktion ausschließlich auf den DNA Duplex auf dem sie sich befinden, beschränkt ist.

An diese Promoterelemente binden Transkriptionsfaktoren, welche durch Gene an anderer, weiter entfernter Stelle synthetisiert wurden. Diese Transkriptionsfaktoren werden deshalb (engl.) als „trans-acting“ bezeichnet (Strachan & Read, 1999). Mutationen im Promotorbereich können krebsauslösend sein (Pickering, Willis, 2005), eine Tatsache, die ihre Bedeutung im Cisplatinexperiment unterstreicht.

Transkriptionsfaktoren sind oft die Endpunkte einer Signaltransduktion, die von der Zelloberfläche bis zur DNA reicht und mit deren Hilfe die Zelle auf unterschiedlichste Umweltanforderungen reagiert. Gene werden häufig in Interaktion zusammen transkribiert und befinden sich in Säugern (im Unterschied zu Bakterien) oft auf unterschiedlichen Chromosomen, also räumlich sehr weit von einander entfernt (Passarge, 2004).

Um trotzdem Gene parallel zueinander regulieren zu können, gibt es allgemeine und spezifische Kontrollelemente (Abb 1.19). Allgemeine Kontrollelemente gibt es in den meisten Genen, spezifische nur in wenigen (Dieterich, 2004).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.19 Allgemeine und spezifische Kontrollelemente (Bucher 1990, in: Dieterich, 2004)

Auch die Transkriptionsfaktoren werden in allgemeine, für alle Gene wirksame und zellspezifische, nur für bestimmte Gene wirksame Transkriptionsfaktoren, die signalabhängig sind (Passarge, 2004), unterteilt.

Darüber hinaus haben Transkriptionsfaktoren zwei sogenannte „Domains“ (engl.) um einerseits an die DNA zu binden (engl.: „DNA-binding domain“) und andererseits die „Transkriptionsmaschine“ zu aktivieren (engl.: „activation domain“). Dabei müssen die beiden Domains nicht notwendigerweise Teile ein und desselben Proteins sein: die entsprechenden Partner können sich sozusagen im Team ergänzen.

Cis- und Transacting Elements können nur in nicht eng gepacktem Chromatin (Chromatin = DNA und asoziierte Proteine) interagieren. Dazu muss das Chromatin eine, durch Enzyme vermittelte, offene Konformation annehmen (Dieterich, 2004).

Bedeutung der RNA-Polymerasen

Die Sequenzmotive der Promotoren sind ebenfalls spezifisch. Mutationen in der Promotersequenz können unterschiedliche Transkriptionsintensitäten zur Folge haben. Darüber hinaus haben die drei verschiedenen RNA-Polymerasen auch verschiedene Promoterregionen (Strachan & Read, 1999):

1. RNA-Polymerase I synthetisiert rRNA im Nukleolus und macht 50 –70 % der
zellulären Aktivität aus. Der Promoter besteht aus einem UCE (engl.:
„Upstream Control Element“) und einem zentralen Promoter (engl.:
„Corepromoter“), an welche die Transkriptionsfaktoren UBF1 und UBF2
(engl.: „Upstream Binding Factor 1, 2“) binden.

2. RNA-Polymerase II synthetisiert Vorläufer (= Prä-) mRNA und macht 20-40%
der zellulären Aktivität aus. Sie bindet an den Pol II-Promoter, an den
wiederum TFII-Faktoren binden (TF=Transkriptionfaktor, II= Polymerase II-
assoziiert).

3. RNA-Polymerase III synthetisiert tRNA sowie kleine RNA´s und 5S-rRNA´s.
Die Promotoren für Pol III befinden sich stromauf- und abwärts bzw.
innerhalb des transkribierten Bereiches. An die Promoter binden TFIII-
Faktoren.

Promotoren können in verschiedene „Cisacting“- Komponenten unterschieden werden:

Core-Promoter

binden den basalen Transkriptionskomplex. In Abwesenheit von zusätzlichen Regulationselementen führen sie zu einer relativ geringen (basalen) Transkription des entsprechenden Gens. Sie befinden sich normalerweise relativ nah an der eigentlichen Transkriptionsstartstelle. Core-Promoter enthalten Elemente wie die, von GC-reichen Sequenzen umgebene, TATA-Box, die etwas weiter stromaufwärts der TATA-Box gelegene TRE-Sequenz (TFIIB-Recognition- Element) und die Initiatorsequenz an der Startseite der Transkription.

Noncore-Promoter

befinden sich üblicherweise in der proximalen Region stromaufwärts des Core-Promoters. Hier kommen GC-Boxen und CCAAT-Boxen vor. Sie können als Enhancer (engl. für: „Verstärker“)-Sequenzen dienen und die Transkription verstärken. Die Regulierung durch Enhancer ist relativ unabhängig von Orientierung und Distanz zum Core-Promoter. Sie können zusätzlich gewebsspezifisch arbeiten.

Silencer

Silencer (engl., etwa: „Beruhiger“) reduzieren Transkriptionslevels. Sie können sich ausser in Exons überall befinden und unterteilen sich in positionsunabhängige, klassische Silencer und positionsabhängige, negative regulatorische Elemente (engl.: „Negative Regulatory Elements“).

Boundary Elements (engl., etwa: „Begrenzungselemente“)

blockieren Einflüsse und Agentien, welche einen positiven oder negativen Einfluß auf die Transkription haben.

Response Elements (engl.:, etwa: „Antwortelemente“)

modulieren die Transkription in Reaktion auf externe Stimuli wie zum Beispiel Hormone. Sie befinden sich normalerweise etwas stromaufwärts der Promoterelemente.

Abb. 1.20 liefert ein Beispiel für Cisacting Elements eines Promoters (human IL2). Die verschiedenen rot markierten Stellen dienen verschiedenen (transacting-) Transkriptionsfaktoren als Bindungsstellen. Start von Transkription und Translation sind durch rote Pfeile markiert. Die Translation beginnt 3 Basen später, weil das erste Basen-Triplett, atg, nur als Startsignal fungiert (Dieterich, 2004).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.20: Cisacting Promoter Elements human IL2 (Dieterich, 2004)

1.1.5.3 Epigenetische Regulation der Genexpression

Zusätzlich zu den genetischen Faktoren der Genexpression kommen noch Regulationsmechanismen über sogenannte RNA-Gene und epigenetische Faktoren.

Es gibt vielfältige epigenetische Regulationsmechanismen wie den Histon-Code und die DNA-Methylierung (Gibbs, 2006). Da in der vorliegenden Arbeit diese Faktoren aber nicht in die Untersuchungen einfließen, wird an dieser Stelle von einer Darstellung der genannten Regulationsmechanismen abgesehen.

2. Material und Methoden

Die Grund-Fragestellung des Cisplatinexperiments lautete: gibt es Unterschiede in der DNA-Reparatur zwischen Mensch und Schimpanse?

Zur Untersuchung dieser Problematik wurden zur Auswahl der Methoden einige Vorversuche gemacht, auf die hier nicht näher eingegangen wird.

Es wurde danach eine Strategie gewählt, die es ermöglichen sollte, Reparatur zu erkennen und zu quantifizieren, auffällig exprimierte und daher mit dem cisplatininduzierten Reparaturprozess in Zusammenhang stehende Repair-Gene zu detektieren und die Struktur dieser Kandidatengene bioinformatisch zu analysieren. Besonders die bioinformatische Strukturanalyse soll hier als eigener Anteil am Cisplatinexperiment im Vordergrund stehen, da die Laborarbeit eine Gemeinschaftsarbeit war und für die vorliegende Arbeit hauptsächlich als Datengrundlage diente.

2.1 Labormethoden

Zur Generierung von Daten im Labor wurden Standard-Methoden angewandt. Zusätzlich wurden aufgrund der spezifischen Anforderungen des Experiments etablierte Techniken modifiziert und zum Teil neue Techniken etabliert.

Im Folgenden sollen erst die verwandten Techniken vorgestellt werden. Da die Methoden, wie erwähnt, Standards sind, werden bei der Beschreibung eher die Grundprinzipien erläutert und nur wo es notwendig erscheint, eine detailliertere

Schilderung angestrebt.

In Abb. 2.1 ist die geplante Vorgehensweise und Methodenauswahl (Experimental Outline) schematisch dargestellt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2.1: Experimental Outline

2.1.1 Vorbereitung

Die verarbeiteten Zellen waren Lymphoblastenzellen (mit Epstein-Barr-Virus immortalisiert) von Schimpanse (♂) und Mensch (♂). Die Zellen wurden vermehrt (RPMI 1640 Medium) und in flüssigem Stickstoff gelagert.

Die Zellen wurden anschleißend mit dem DNA-toxischen Medikament Cisplatin (GRYFARMA) behandelt (1h Inkubation bei 37°C und 5% CO2).

Die Suspension wurde in Falcontubes überführt und 5min mit 1000rpm bei RT zentrifugiert. Anschließend wurde noch zweimal analog mit 1 x PBS-Puffer gewaschen und zentrifugiert.

Das Zellpellet wurde in RPMI 1640 Medium resuspendiert und in einer Kulturflasche bei 37°C und 5% CO2 drei Zellzyklen lang weiterkultiviert.

Es wurden stündlich Proben entnommen und auf je zwei Falcontubes (für RNA bzw. DNA-Extraktion) verteilt. Es wurde bei RT 5min mit 1000rpm zentrifugiert und noch einmal analog mit 1 x PBS gewaschen. Die Pellets wurden bei –80°C gelagert.

- PBS – Puffer: 136 mM NaCl, 2 mM KCl, 10,6 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4; pH7,2-7,4
- RPMI 1640 Medium „spezial“:500 ml RPMI 1640 Medium, 70 ml FKS (Fötales Kälberserum),5 ml L- Glutamin, 0,5 ml Gentamycin, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml MEM (nichtessentielle AS)

Extraktion der DNA

Die DNA der Proben wurden mit einem QIAampÒ DNA Mini Kit extrahiert. Dazu wurde das „Cultured Cell“-Protokoll (anschl. „Blood and Body Fluid Spin Protokoll”) mit 2 Waschschritten gewählt (February 2003).

Anschließend wurde die DNA-Konzentration mit dem NANODROP von PeqLab bestimmt.

Die DNA wurde von je vier männlichen Individuen pro Spezies „gepoolt“.

Extraktion der RNA

Das Zellpellet wurde auf Eis aufgetaut, mit 1ml Trizol-Reagenz verstetzt und durch auf- und abpipettieren und vortexen bei RT aufgeschlossen (anschl. 5 min. Inkubation bei RT).

Es wurden dann 200µl Chloroform zugegeben, geschüttelt und 2min bei RT inkubiert. Danach wurde bei 4°C mit 12000rpm für 15 min zentrifugiert.

Zur Fällung der RNA wurde von dem Zwei-Phasengemisch die obere Phase abgenommen, mit einem etwa gleich großen Volumen Isopropanol gemischt und 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde mit 12000rpm bei 4°C für 10 min zentrifugiert und so ein RNA-Pellet hergestellt.

Der Überstand wurde abpipettiert und anschließend zweimal mit 70%-igen EtOH gewaschen (je 5min bei 4°C und 12000rpm).

Nach dem Trocknen (über Kopf) wurde das Pellet mit H2O DEPC unter permanenter Kühlung resuspendiert und anschließend bei –80°C eingefroren.

2.1.2 Ermittlung der Reparaturleistung

Um eine Reparaturleistung zu bestimmen, muß das Ausmaß des Schadens, die darauf folgende Reparaturarbeit und deren Dauer berücksichtigt werden.

2.1.2.1 Membrane Dot Blot-Verfahren

Zur Ermittlung der DNA- Reparatur der behandelten Zellen wurde ein Membrane Dot Blot-Verfahren angewendet. Mit diesem Verfahren, etabliert von Weis, 2004 wurde jeweils im Stundentakt über insgesamt 7 Stunden die DNA- Reparatur gemessen.

Zuerst wurde die DNA denaturiert und auf eine Nylonmembran aufgebracht.

Zur Detektion wurde ein Antikörper eingesetzt. Der Anti-single strand/double strand DNA-Antikörper (Anti-ss/dsDNA-AK) bindet spezifisch an single strand DNA. Durch die Cisplatinschädigung entstehen sogenannte „Crosslinks“, also Inter- und Intrastrandverbindungen, welche durch DNA-Reparatursysteme herausgeschnitten werden. Dabei entstehen unter anderem charakteristische, einsträngige DNA-Abschnitte, sogenannte „single-strand-DNA (engl.)“ oder, abgekürzt, ssDNA.

Die Menge an detektierter ssDNA (normalisiert) kann also als Maß für die entstandene Reparatur gelten.

2.1.2.2 GE-gekoppelte ICP-MS

Die Besonderheit der Cisplatin-induzierten DNA-Schädigung liegt darin, dass DNA-Crosslinks (mit hoher Affinität zu Guanin) entstehen und dass das Platin in diesen Addukten eingebaut bleibt. Es liegt also nahe, über eine Platinbestimmung die entstandene DNA-Schädigung zu ermitteln.

Eine Recherche über Arbeits- und Gesundheitsschutz (Umweltbundesamt 2003; Institut für Energie und Umwelttechnik IUTA e.V. 2006) und beim MPI für Polymertechnik in Mainz (Blümler, pers. Mitteilung) ergab, dass Platinmessungen an biologischem Material mittels einer ICP-MS mit großer Präzision durchgeführt werden können.

Mitarbeiter des Institutes für anorganische und analytische Chemie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz haben eine völlig neuartige Methode zur Platinbestimmung (und nahezu aller anderen an DNA gebundenen Elemente) entwickelt und publiziert (Brüchert und Bettmer, 2005):

die Gel-Elektrophorese- gekoppelte Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (GE-gekoppelte ICP-MS).

Mit einer Mindestnachweisgrenze von 1ng DNA (Fragmentgrößenabhängig) stellte GE-gekoppelte ICP-MS für uns die Methode der Wahl dar.

Der Vorteil dieser Methode ist eine hohe Element- und Isotopenspezifität, die Möglichkeit mehrere Elemente simultan zu bestimmen und, der für die erweiterte Methode entscheidende Faktor, die Kopplungsmöglichkeit mit anderen Trenntechniken.

Mit der vorgestellten Methode wurden DNA- Proben von 0-h und 1h des Cisplatinexperimentes gemessen.

2.1.3 Expressionsmessung im Cisplatinexperiment

Die Proben wurden zur Auswertung auf einen sog. Repairchip hybridisiert. Dabei wurden je Spezies cisplatinbehandelte Gruppen (als Pools) gegen unbehandelte Kontrollgruppen (als Pools) hybridisiert.

Der Repair-Chip enthält cDNA´s von ca. 150 Genen, welche in DNA-Reparaturmechanismen involviert sind. Die entsprechenden cDNA-Klone wurden schon während eines früheren Experimentes von Frau Weis (Inst. f. Humangenetik, Uniklinik Mainz) mittels PCR amplifiziert, sequenziert und zum spotten vorbereitet. Die Chips wurden von Oliver Bitz (Institut für Molekulargenetik, Universität Mainz) mit dem Spottering Roboter OMNIGRID GeneMachine (GeneWorx) gespottet.

Zur Aktivierung wurden die Chips über heißem Wasserdampf bis zum Beschlagen des Glases gehalten und danach auf eine 80°C heissen Platte gelegt (face up). Danach wurde ein UV-Crossliniking durchgeführt, in Succinic- Anhydrid/Na-Borat-Lösung inkubiert, mit Aqua bidest. gewaschen und mit Druckluft getrocknet.

Vor der Chiphybridisierung wurden zunächst die RNA-Proben in cDNA umgeschrieben (Transcriptase SuperScript II, Invitrogen), mit Lucidea Spike RNA (Amersham) als Referenz versehen, mit den Farbstoffen cy3 und cy5 (Amersham) markiert und aufgereinigt (NucleoSpinâExtract Kit, Macherey & Nagel).

Zur Hybridisierung der Chips wurden die Proben mit Human Cot DNA (Invitrogen) versehen, um unspezifische Bindungen zu vermeiden. Dann wurde mit Hybridisierungspuffer (UltraHyb, Ambion) aufgefüllt, denaturiert und in die Hybridisierungsanlage injiziert. Hybridisiert wurde bei 42°C für 15 min im Lucidea Slide Pro Hybridizer (Amersham Biosciences) und anschließend gewaschen.

Die Expression wurde im Affymetrix Array Scanner 428TM gemessen (die Emission von Cy3 bei 570 nm und von Cy5 bei 680 nm) und von jedem Kanal ein Bild gespeichert (als TIF-Datei).

Ausgewertet wurden die Bilder mit der Imagine Software. Dazu werden zwei Bilder des gleichen Chips übereinander gelegt (cy3/cy5) und über deren Spots ein sog. „Grid“ gezogen. Die Kreise des Grids werden automatisch und manuell auf die Spots zentriert. Die Intensität wird innerhalb der Kreise gemessen und durch die Software mit den entsprechenden, auf dem Chip aufgebrachten Genen korreliert.

Die gemessenen Daten wurden mit dem institutsinternen „R“-Skript („R“ ist eine Sprache für statistische Computeranalysen) normalisiert.

Die in einer Excel-Tabelle aufgelisteten Arraydaten enthielten die gemessenen Expressionen der beiden Farbstoffmarkierten Slides (cy3 und cy5). Pro Gen waren je vier cy3 und vier cy5 Spots, also insgesamt acht Spots auszuwerten.

Dazu wurden aus den Daten alle Kontrollen und Leerwerte (K,k, YIR, blank, leer) entfernt. Anschließend wurden alle Spots, deren Werte zwischen 0,83 und 1,29 lagen, entfernt.

Alle Werte, die nun übrig waren, wurden manuell überprüft: es mussten die Spots beider Farbstoffe für je ein Gen die gleiche Tendenz haben (also entweder überwiegend hoch- oder herunterreguliert sein). Alle Daten der (nach diesem so definierten Fold Change) nicht regulierten Gene, wurden wiederum entfernt.

Die Ergebnisse wurden dann mit dem Genschlüssel abgeglichen, um die Namen der den Daten zugeordneten Gene zu finden.

2.2 Bioinformatische Methoden

Die aus den experimentellen Ergebnissen hervorgegangenen sogenannten „Kandidatengene“ wurden anschließend auf bioinformatischem Wege strukturell untersucht.

Dabei wurden Online- und Offline-Anwenderprogramme verwendet.

Es wurde vermutet, dass den im Labor-Experiment beobachteten Reparaturmustern Entsprechungen in den strukturellen Mustern gegenüberstehen.

Da im Rahmen des Cisplatinexperimentes natürlich nur für den Reparaturprozess relevante Strukturen im Vordergrund standen, wurden die zu untersuchenden Bereiche in kodierende und regulatorische Bereiche unterteilt. Putativ nicht-regulatorische und nicht-kodierende Bereiche wurden nicht untersucht.

Untersuchungsgegenstand waren mögliche Selektionsereignisse auf DNA- Ebene. Dabei wird die Sequenzevolution unterteilt in negative, positive und beinahe neutrale Selektion (Pál, 2006):

- Negative Selektion: Auch „purifying selection“ genannt. Entfernung einer nachteiligen genetischen Variante aufgrund des entstehenden reproduktiven Nachteils ihres Trägers.
- Positive Selektion (auch: Darwin´sche Selektion oder adaptive Evolution): Die forcierte Verbreitung einer genetischen Variante in einer Population aufgrund des reproduktiven Vorteils ihres Trägers.
- beinahe neutrale Selektion: Eine genetische Variante kann nicht selektiert werden, da ihr reproduktiver Vor- oder Nachteil für ihren Träger zu klein ist und ihr Schicksal allein durch genetische Drift bestimmt wird
- Genetische Drift: Veränderung der zufälligen Verteilung von Genen durch zufälligen Verlust oder Erwerb nichtadaptiver Allele innerhalb einer Population.

2.2.1 Analyse der kodierenden Sequenzbereiche

Als kodierende Sequenzbereiche wurden die ORF´s, die „Open Reading Frames“ der Kandidatengene angesehen. Diese sind aminosäurerelevant und wurden auf positive Selektion untersucht. Bei Untersuchungen dieser Art ergeben sich Hinweise darauf, ob ein Gen unter neutraler, negativer oder positiver Selektion steht.

2.2.1.1 Untersuchung der dN/dS-Ratio

Von den Kandidatengenen wurden zunächst die ORF´s von Pan und Homo über Ensembl (= Internet-Datenbank) herausgesucht und in BioEdit (= Anwendersoftware) mit ClustalW aligniert. Fehlten Sequenzbereiche bei Pan, wurde der entsprechende Bereich bei Homo herausgeschnitten und in Ensembl gegen Pan „geBLASTet“ (= Sequenzhomologen- Suchfunktion).

Anschließend wurde der fehlende Bereich eingefügt, aligniert und über MEGA 3.0 (= Anwendersoftware) das dN/dS-Verhältnis bestimmt.

Dazu wurde das modifizierte Nei-Gojobori mit Jukes-Cantor-Correction-Modell für paarweisen Sequenzvegleich benutzt. Dieses Modell berücksichtigt Transitionen/Transversionen und multiple Substitutionen.

Ist dN/dS > 1 , bedeutet das, die untersuchte Sequenz ist positiv selektioniert. Bei dN/dS < 1wird eine negative und bei dN/dS = 1 eine neutrale Selektion unterstellt.

2.2.1.2 Untersuchung mit dem Haplotter

Um Hinweise auf eventuelle positive Selektion, die durch den dN/dS-Test detektiert würde zu vergleichen, wurde zusätzlich eine Haplotter-Untersuchung gemacht.

Dieses Verfahren gibt anhand von Haplotypen-Vergleichen Auskunft über Regionen positiver Selektion innerhalb der (bisher nur) Spezies Homo.

Ein iHS-Wert > 2 mit einen p-value < 0,001 gilt als Nachweis für positive Selektion. Dieser Nachweis gilt für den ganzen Lokus, im Gegensatz zur dN/dS- Untersuchung, die nur den ORF berücksichtigt.

2.2.2 Analyse der regulatorischen Bereiche

Regulatorische Sequenzen sind per definitionem nicht-aminosäure-kodierende Sequenzen.

Diese lassen sich wie folgt unterteilen:

- Putative 5´-upstream-Promoterbereiche (eigentlich schon außerhalb des Gens, also strenggenommen „intergenisch“, via Regulation zum nachgeschalteten Gen gehörend)
- Intergenische Sequenzen (Bereiche zwischen den Genen)
- 5´-UTR-Bereiche („oberhalb“ des ORF, aber innerhalb des Transkripts)
- 3´-UTR-Bereiche („unterhalb“ des ORF, aber innerhalb des Transkripts)
- Introns (Bereiche innerhalb eines Gens, zwischen den Exons befindlich)

Etwa 97% der DNA sind nicht-kodierend.

Grundgedanke der Untersuchung ist es, regulatorische und kodierende Bereiche im Bezug zueinander zu setzen.

Wenn zum Beispiel ein Kandidatengen dieser Untersuchung im Pan/Homo -Vergleich unterschiedliche Expressionsmuster aber gleichzeitig starke Konservierung im kodierenden Bereich zeigt, so könnten die detektierten Expressionsunterschiede mit Divergenzen in den regulatorischen Bereichen zusammenhängen.

Es gibt verschiedene Ansätze zu bestimmen, wann nicht-kodierende Sequenzen als positiv selektioniert gelten, zum Beispiel den Vergleich der InDel- Verteilung unter der Neutralitätsannahme (Lunter et al., 2006).

In dieser Arbeit wurde die allgemeine, durchschnittliche Sequenzdivergenz zwischen Schimpansen- und Menschengenom als Grundlage der Selektions-untersuchung gewählt. Diese beträgt 1,06% Nukleotiddivergenz („fixed divergence“) und ca. 3,0% euchromatische Divergenz (InDel´s), zusammengenommen also 4,06% Sequenzdivergenz. Rechnet man intraspezifische Polymorphismen in der Nukleotiddivergenz von ca. 0,17% hinzu kommt man auf 4,23% Divergenz (The Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium, 2005; Britten, 2002).

Wenn die Divergenz in den untersuchten Strukturen also über einem konservativ gewählten Durchschnitt von (gerundet) über 5,0% liegt und zusätzlich durch lokale Ereignisse wie eine Häufung von Austauschen in räumlich nahen, putativ neutralen Positionen nicht erklärt werden kann, dann wird von einer positiven Selektion dieses Bereiches ausgegangen.

Da in dieser Berechnung InDel- Ereignisse mit berücksichtigt sind, werden Nukleotid- und Längendivergenzen homologer Bereiche zusammen bewertet.

2.2.2.1 Untersuchung putativer Promotorbereiche

Wie schon im Kapitel über Genexpression dargestellt, können 5´-stromaufwärts gelegene Sequenzbereiche von Genen als „putative Promotorbereiche“ angesehen werden.

Einer Untersuchung von Dieterich (2004) zur Folge können ca. 95% der Promotoren in einem 1,5Kb-Fenster eingegrenzt werden. Die meisten Pomotoren befinden sich etwa 1Kb (Median 303bp) um die Transkriptions-Startstelle (TSS).

Um den Begriff „putativer Promotorsequenzbereich“ genauer einzugrenzen, wird analog zu einer Arbeit von Khaitovich et al. (2005), eine Region 1500bp stromaufwärts und 500bp stromabwärts der TSS als putativer Promotor-sequenzbereich definiert.

Zuerst wurden die bekannten Transkriptionsstartstellen (TSS) der humanen Sequenzen über Homo sapiens Promoter Database (HsPD) bestimmt.

Von diesen ausgehend wurden insgesamt 2000bp herausgeschnitten und in Ensembl nach homologen Pan -Sequenzen „geBLASTet“. Beide Sequenzen, also je einmal 2000bp von Homo und 2000bp von Pan, wurden dann in BioEdit aligniert und die Divergenz berechnet (1 – Sequence Identity= Divergenz). Bei einigen Sequenzen war die Annotation der Schimpansensequenz noch nicht vollständig. Die fehlenden Nukleotide werden dann üblicherweise mit „N“ bezeichnet. Diese „N“´s wurden bei der Auswertung herausgerechnet (corrected value), was im Ergebnis keine nennenswerten Unterschiede machte.

Von einer Verwendung von „Promoterfindern“, wie zum Beispiel dem „Dragon Promoter Finder“ oder „PromoterScan“ wurde nach anfänglichen Versuchen abgesehen, da die Ergebnisse uneinheitlich waren.

2.2.2.2 Untersuchung der 5´- und 3´-UTR´s

Die untranslatierten Bereiche wurden nach Sequenzdivergenzen untersucht.

Dazu wurden wiederum auf Grund der qualitativ besseren Annotation aus der humanen Sequenz die UTR-Bereiche gegen die Pan -Sequenz in Ensembl geBLASTet, sofern keine entsprechenden UTR-Sequenzen für Pan angegeben wurden.

Anschließend wurden die Sequenzen in BioEdit aligniert und die Divergenzen berechnet (1 – Sequence Identity = Divergenz).

2.2.2.3 Untersuchung der Introns

Da aus den vergangenen Studien zu erwarten ist, dass die Kandidatengene des Cisplatinexperimentes ohnehin stark konserviert sind und die unterschiedlichen Expressionen eher auf einer diversen Regulation beruhen, erscheint die Untersuchung regulatorischer Bereiche, speziell der Introns obligat: „further investigations will be necessary to determine the influences of ... genetic changes in cancer, or whether additional factors, such as changes in gene regulation, ... contribute to this process“ (Puente, 2006).

Da Introns, außer regulatorischen, zusätzlich potentiell wichtige strukturelle Eigenschaften besitzen, wurden zuerst die (Gesamt-) Längen der Introns von Pan und Homo miteinander verglichen.

Um die Gesamtlänge (in bp) der Introns eines Gens zu erhalten, wurde die Länge der Transkriptsequenz des betreffenden Gens von der Länge der genomischen (Gen-) Sequenz abgezogen.

Anschliessend wurden die Längen verglichen und deren Abweichung voneinander berechnet. Da es für die Untersuchung nur von Interesse war, ob eine positive Selektion stattgefunden hatte oder nicht, wurden die Intronpaare die sich in mehr als 5% (= festgelegter Cut- Off-Wert für pos. Selektion) unterschieden, ohne weitere Analyse als positiv selektioniert betrachtet. InDel- Ereignisse, Repeats, Interspezies- Distanzen und Intraspezies-Polymorphismen waren ja bereits bei der Festlegung des Cut- Off- Wertes berücksichtigt worden.

Die Sequenzen, die weniger als 5% (Längen-) divergent waren, wurden zusätzlich in BioEdit aligniert und bezüglich ihrer Nukleotiddivergenz berechnet. Wurde eine Nukleotiddivergenz von über 5% nachgewiesen, wurde ebenfalls eine positive Selektion der betreffenden Introns eines Kandidatengens unterstellt.

3. Ergebnisse

Im Folgenden sollen die Ergebnisse der verwendeten und weiter oben erläuterten Methoden dargestellt werden.

3.1 Laborergebnisse

3.1.1 Reparaturleistung

Die Ermittlung der DNA- Reparaturleistung der Zellen bestehend aus der Ermittlung des exakten DNA- Schadens mittels ICP-MS-Methode und der Bestimmung der darauf folgenden Reparaturarbeit über das Membrane Dot Blot-Verfahren muss im Endergebnis auf Grund der noch nicht vollständig zu Ende entwickelten GE-gekopptelten ICP-MS-Methode vorerst offen bleiben. Die Reparaturarbeit allerdings konnte mit dem Membrane Dot Blot-Verfahren gemessen werden.

3.1.1.1 Membrane Dot Blot- Ergebnisse

Als Ergebnis der Membrane Dot Blots der stündlich gezogenen Zellproben, zeigten sich im Bereich 1h für Mensch und Schimpanse und für 5h bzw. 6h von Schimpanse respektive Mensch sichtbar erhöhte Reparaturpeaks (Abb. 3.1).

Zeit (in Stunden)

Abb.3.1: Ergebnisse Membrane Dot Blot

3.1.1.2 GE-gekoppelte ICP-MS

Zur exakten Ermittlung der Schädigung der DNA durch die Cisplatinapplikation wurde als neues, noch nicht bis zur Reife entwickeltes Verfahren, die GE-gekoppelte ICP-MS eingesetzt. Bislang wurden nur einige wenige Proben gemessen, die zwar mit Vorsicht zu interpretieren sind, aber doch jetzt schon vermuten lassen, dass man hier eine Methode generiert, die bei stringenter Weiterentwicklung eine wertvolle Hilfe zur exakten Quantifikation von Bruchstückgrößen und Metallanhaftungen an DNA/RNA- Matrizen sein kann.

In Abb. 3.2 sind Messungen zu sehen, die Schimpansenlymphoblasten sofort (0h) bzw. 1h nach 30-minütiger Cisplatinapplikation zeigen. Deutlich zu erkennen ist, dass der 100-200bp-Peak der 0h-Probe bei der 1h-Probe nicht mehr zu auszumachen ist.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3.2: 0h und 1h Cisplatin (Pan)

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Abb. 3.3: 0h Cisplatin (Homo)

Eine 0h-Probe von menschlichen Zellen ergab in einer ersten Messung, dass Platinanhaftungen im Bereich 100-200bp und 15000 – 18000bp– Fraktionen zu sehen sind (Abb. 3.3).

3.1.2 Gen-Expression

Die Gen-Expressionen der ausgewählten Reparaturgene des Cisplatin-experiments wurden mit cDNA- Microarrays gemessen. Auf die cDNA Chips waren ca. 150, aus dem GO-Cluster „DNA-Repair“ ausgewählte Gene gespottet. Davon wurden insgesamt 31 als (relativ zu den anderen Genen) hoch-, bzw. herunterreguliert gemessen (Tab. 3.1).

Tab. 3.1: Regulierte Gene, Einzeldarstellung (1h, 5h und 6h)

Bei der 1h-Probe sind bei Pan nur zwei Gene hochreguliert, bei Homo dreizehn Gene. Bei der 5h-Probe sind bei Pan acht gene hoch- und sechs Gene herunterreguliert. Bei Homo sind nur 3 Gene hochreguliert. Die 6h-Probe zeigt bei Pan nur drei, bei Homo vier hochregulierte Gene; bei Homo sind zusätzlich noch zwei Gene herunterreguliert.

Eine zusammenfassende Darstellung zeigt Abb. 3.4.

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Abb. 3.4: Regulierte Gene, Zusammenfassung (1h, 5h und 6h)

3.2 Bioinformatische Ergebnisse

3.2.1 Kodierende Bereiche

3.2.1.1 dN/dS- Methode

Die für Aminosäuren kodierenden Bereiche der Kandidatengene (n=31) wurden mittels dN/dS- Methode untersucht. Dabei gilt ein dN/dS-Verhältnis von >1 als Hinweis auf positive Selektion. Die in Tab. 3.2 aufgeführten Ergebnisse zeigen für kein Einziges Gen ein dN/dS-Verhältnis > 1, was bedeutet, dass keines der 31 Kandidatengene im kodierenden Bereich positiv selektioniert ist.

Die Gene, für deren dN/dS-Verhältnis „kein Ergebnis“ angegeben ist, sind ebenfalls als nicht positiv selektioniert anzusehen. Der Eintrag „kein Ergebnis“ entsteht rechnerisch durch einem dS-Wert von Null.

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Tab. 3.2

3.2.1.2 Haplotter

Der Haplotter überprüft anhand von (humanen) HapMap-Daten (Haplotypen-Datenbank) rezente positive Selektion (10.000 – 12.000 Jahre vor Heute) an einem gegebenen Lokus. Er ist kein direktes Instrument um Vergleiche zwischen Mensch und Schimpanse zu ermöglichen. Im Falle einer, durch den Haplotter detektierten, positiven Selektionierung, ist diese wahrscheinlich auf schnelle Anpassungen an lokale Bedingungen zurückzuführen.

Es zeigten alle untersuchten Gene im Haplotter-Test (Tab. 3.3) eine negative Selektion (iHS<2), außer REV1 und TNKS. REV1 liegt mit einem iHS>2 im Bereich einer möglichen positiven Selektion, wird aber, gemäß den Instruktionen zum Haplotter- Test (Voight, B., 2006) auf Grund der zu geringen Singnifikanz (p=0,011) verworfen. TNKS liegt mit dem iHS-Wert (Abb. 3.5) hochsignifikant (p=0,00009) über 2 (Tab. 3.4) und kann deshalb als positiv selektioniert gelten.

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Tab. 3.3

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Abb. 3.5

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Tab. 3.4

3.2.2 Regulatorische Bereiche

Als regulatorische Bereiche wurden die putativen Promoterbereiche, 3’- und 5’-UTR- und Intronbereiche der Kandidatengene untersucht. Als Cut Off- Wert für eine positive Selektion galt 5% Sequenzdivergenz.

3.2.2.1 Putative Promotorbereiche

Legt man die veranschlagten mindestens 5% Divergenz als Cut-Off- Wert für positive Selektion zu Grunde, lässt sich nur ein Gen als positiv selektioniert bewerten: DNAJA3, mit einer Divergenz von 12,32% (Abb. 3.6). Alle anderen Gene liegen weit unter dem Cut Off-Wert (PMS2L4 mit 3,75% als höchstes der folgenden Gene).

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Abb. 3.6

Die angegebenen Divergenzwerte sind korrigierte Werte, d.h. fehlende Sequenzinformationen, die dem noch vorläufigen Charakter der Schimpansensequenz- Annotierung geschuldet sind, wurden nicht in die Berechnung mit einbezogen. Drei Gene konnten nicht analysiert werden (KIAA070, XAB1, TOP1).

In Tabelle 3.5 wurde aufgeschlüsselt, bei welchen Genen wieviel Nukleotide auf Grund fehlender Sequenzinformation beim Schimpansen herausgeschnitten wurden (Tab. 3.5).

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Tab. 3.5

3.2.2.2 Untranslatierte Bereiche (UTR´s)

Die Ergebnisse der Untersuchung der UTR´s zeigen deutlich mehr über 5% divergente Gene als der bisher betrachtete Promoterbereich (Tab. 3.6).

Im 3’-UTR, also im stromabwärts terminalen Exonbereich, zeigen 5 Gene mehr als 5% Divergenz: ILF1(FOXK2), NTPBP1(XAB1), TRF4-2, XRCC3 und MDM2.

Weitere 5 Gene zeigen im 5’-UTR-Bereich über 5% Divergenz: UBE2V1, TOP3B, TERT, XRCC3 und SIRT5.

Auffällig ist, das XRCC3 in beiden UTR’s über 5% Divergenz (3’-UTR = 25,34%; 5’-UTR = 19,43%) zeigt.

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Tab. 3.6

3.2.2.3 Introns

Abb. 3.7 zeigt die zusammengeschnittenen Introns der jeweiligen Kandidatengene (=Intronlänge gesamt).

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Tab. 3.7

Die zusammengeschnittenen Introns wurden bezüglich der Länge, bzw. bei unter 5% Längendivergenz auch im Nukleotidbereich auf Divergenz untersucht. Nicht berücksichtigt wurde in der Betrachtung, ob die Gesamtlänge eines Introns eines Gens beim Menschen größer oder kleiner als beim Schimpansen war, da beide Varianten ohne erkennbares Muster vorkamen und die Theorien zur Funktion und Evolution der Intronlänge uneinheitlich sind (Castillo-Davis, 2002; Sarharkar, 2004; Fedorova et al., 2005; Vinogradov, 2006); nur dass es eine funktionelle Bedeutung von Intronlängen gibt, kann vorerst als Konsens gelten. Die Ergebnisse zeigen, dass bei den Introns die meisten Sequenzdivergenzen unter den untersuchten regulatorischen Bereichen vorkommen: 21 von 31 Kandidatengene (= 67,7%) zeigen mehr als 5% Divergenz.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass, wenn eine Sequenzdivergenz von über 5% auch im Intronbereich als positive Selektion zu werten ist, ca. 2/3 der Kandidatengene im Intronbereich positiv selektioniert sind. Wenn man den Introns regulatorische Bedeutung unterstellt, heißt das: die Mehrzahl der untersuchten Gene wird, unter allen untersuchten regulatorischen und putativ regulatorischen Bereichen, mindestens über den Intronbereich differenziell reguliert.

3.2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse

Um die Ergebnisse übersichtlich nebeneinander zu stellen, wurde die Form einer Ja/Nein-Matrix gewählt (Tab. 3.8). Hier gilt als Diskriminationsbedingung nur: größer/gleich 5% oder kleiner 5% Divergenz.

Eine solche Matrix spiegelt am übersichtlichsten die Tendenz der Resultate wieder, da in den Untersuchungen eine sehr große Genauigkeit schon allein auf Grund des vorläufigen Charakters der Schimpansen- Genomannotation momentan nicht erreicht werden kann (Taudien, 2006) und hier deshalb eher allgemeine Grundprinzipien herausgearbeitet werden sollen.

Zusätzlich wurden auch die Sequenzdivergenzen der ORF´s der untersuchten Gene berechnet. Die Nukleotiddivergenzen der ORF-Bereiche bleiben, gemäß der dN/dS-Untersuchung, ohne Auswirkung hinsichtlich einer positiven Selektion. Die Auswirkungen auf Aminosäureebene sind also eher zu vernachlässigen.

Dennoch kann eine Berechnung der Nukleotiddivergenz zeigen, ob an der untersuchten Stelle ein evolutionärer Druck besteht und es ist für eine ganzheitliche Beurteilung hilfreich, Vergleiche mit unmittelbar benachbarten Strukturen anzustellen.

Weiter wurde aufgelistet, in welche grundlegenden biologischen Prozesse die Kandidatengene involviert sind. Es wurden jeweils die erste Nennung bei „the Gene Ontology“ (www.geneontology.org) aufgenommen, um die relevantesten biologischen Prozesse darzustellen. Der Vergleich der GO- Angaben mit den Ergebnissen der Ja/Nein- Matrix lässt kein erkennbares Muster erkennen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab. 3.8

Um die Ergebnisse der Ja/Nein-Matrix anschaulicher zu machen, werden sie zusätzlich noch einmal in Abb. 3.7 und in Abb. 3.8 dargestellt.

Abb. 3.7 zeigt, wieviel Prozent der Gene sich in den einzelnen, untersuchten Strukturen unterscheiden (z.B. zeigt im Bereich der putativen Promoterregion nur eines der Kandidatengene über 5% Divergenz, während alle anderen Gene unterhalb der 5%-Grenze bleiben).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3.7

Abb. 3.8 zeigt die Verteilung der Kandidatengene in Bezug auf die Anzahl der divergenten Regionen. So zeigen zum Beispiel 12 Gene in nur einer Region eine Divergenz über 5%, während 9 Gene in zwei Regionen über 5% divergieren. Zunächst lässt sich feststellen, dass bei 7 der Kandidatengene keinerlei positive Selektion zu sehen ist. Regulatorische Unterschiede dieser Gene lassen sich hier also auf Basis dieser Untersuchung nicht erklären.

Die restlichen gut 3/4 der Gene sind in mindestens einem Bereich (14 Gene), oder mehr als einem Bereich (10 Gene) positiv selektioniert. Den größten Anteil haben dabei die intronischen Bereiche, die in 21 Genen positiv selektioniert sind, den geringsten die putativen Promoterbereiche, die nur bei einem Gen eine positive Selektionierung zeigen. UTR-Bereiche liegen dazwischen (je 5 Gene mit positiver Selektion dieser Bereiche).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3.8

Sechsundzwanzig der Kandidatengene (n = 31) zeigten in den ORF-Bereichen (= Aminosäurekodierende Bereiche) eine Divergenz von weit unter 5%, was deutlich unter der Divergenz der meisten, benachbarten Strukturen liegt. Fünf Gene hatten allerdings eine Divergenz von über 5% (RAP1, SIRT1, RFC5, XRCC3 und UBE2V1). So weit entspricht dieses Ergebnis, nämlich dass der Großteil (29 Gene) der ORF´s stärker konserviert ist als die regulatorischen Strukturen, den Erwartungen. Bei RAP1 und UBE2V1 gab es zwei überraschende Beobachtungen.

Bei dem Gen RAP1 war die Sequenzdivergenz der kodierenden Bereiche mit 7,58% knapp 3% größer als die der zugehörigen Introns (4,55%).

Bei UBE2V1 war diese Eigenschaft noch deutlicher zu sehen: die Sequenzdivergenz im ORF-Bereich ist mit 18,20% mehr als doppelt so hoch wie im Intronbereich (8,07% Sequenzdivergenz). Das bedeutet, dass Introns und alle anderen untersuchten Strukturen von RAP1 stärker konserviert sind als der ORF - zumindest was die Nukleotidsubstitution angeht.

4. Diskussion

4.1 Labormethoden und Ergebnisse

4.1.1 Das Ausgangsmaterial

Grundlage der Untersuchungen des Cisplatinexperiments waren sogenannte Lymphoblastoide Zellen der beiden zu vergleichenden Arten Homo sapiens und Pan troglodytes. Lymphoblastoide Zellen sind mit dem Epstein-Barr-Virus transformierte B-Lymphozyten. Durch die Transformation werden die Zellen immortalisiert, d.h. unsterblich gemacht.

Es erhebt sich an dieser Stelle jedoch die Frage, ob immortalisierte Zellen wirklich zur Grundlagenforschung über die Entstehung von Tumoren geeignet sind.

Schließlich sind Tumorzellen ebenfalls immortalisierte Zellen. Wenn man zu Grunde legt, dass im Experiment eine möglichst naturgetreue Abbildung der Wirklichkeit simuliert werden sollte, so erscheint es in diesem Zusammenhang geeigneter, „normale“, nicht immortalisierte Zellen wie zum Beispiel Fibroblasten als Ausgangsmaterial einzusetzen.

Bei der Verwendung von lymphoblastoiden Zellen bleibt immer die Frage offen, ob die Zellen auf die Cisplatinapplikation so reagiert haben, weil sie transformiert waren, oder ob nicht immortalisierte Zellen anders reagiert hätten, was die Ergebnisse natürlich in ihrer Aussage angreifbar machen würde.

Man kann also unter den genannten Aspekten durchaus die Verwendung von lymhoblastoiden Zellen im Cisplatinexperiment zur Diskussion stellen.

4.1.2 Die Untersuchung der DNA- Reparatur

Die Membrane Dot Blot-Methode eignet sich gut um die Reparaturarbeit zu beurteilen. Nur die entsprechenden Reparaturmechanismen führen zur Entstehung der charakteristischen ssDNA, welche durch den Anti- ss/dsDNA- Antikörper (Fitzgerald) detektiert wird.

Zunächst kann festgehalten werden, dass der Membrane Dot- Blot zwei auffällige Reparaturpeaks bei je 1h und 5h bei Schimpanse und 6h bei Mensch zeigt (Abb. 3.1). Das bedeutet, es gibt bei beiden Arten einen frühen und einen späten Reparaturhöhepunkt.

Allerdings kann durch die Beobachtung der reinen Reparaturarbeit nicht zwingend auf die Höhe des Schadens geschlossen werden. Unbekannt ist auch die Fragmentierung der DNA.

Um die Reparaturleistung zu evaluieren, muss aber, außer der Reparaturarbeit im entsprechenden Zeitraum, noch zusätzlich die tatsächliche Schadenshöhe bekannt sein.

Um diese zu ermitteln wurden im Rahmen einer Kooperation mit dem Institut für anorganische und analytische Chemie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz neue Wege beschritten. Grundgedanke war es die Platinanbindungen an die DNA, welche zu den erwähnten Crosslinks führen, mit Hilfe eines geeigneten Detektionsverfahrens zu ermitteln.

Die bisherigen Ergebnisse des GE-gekoppelten ICP-MS Verfahrens geben erste Hinweise darauf, dass die kurzkettigen Bruchstücke (100-200bp) welche bei der 0h-Probe zu sehen sind, offenbar durch Platininteraktion mit der DNA entstehen (der Pt-Peak läuft zeitgleich mit dem 100-200bp-Peak). Diese Bruchstücke werden offenbar schon in einer frühen Reparaturreaktion bearbeitet, denn in der 1h Probe ist kein 100-200bp-Peak mehr zu sehen (Abb. 3.2).

Die größeren Bruchstücke (15000 – 18000bp) mit möglichen Pt-Anhaftungen werden offenbar später repariert, da diese in der 1h-Probe gegenüber der 0h-Probe noch unverändert vorhanden sind (Abb. 3.3). Allerdings muss diese Schlußfolgerung zunächst eine Vermutung blieiben, da der Pt-Peak, der mit den längerkettigen Bruchstücken assoziiert wird, sich an der Nachweisgrenze bewegt (diese liegt bei einer Intensität von ca. 10.000 cps). Weitere Proben, die späteren Entnahmezeitpunkten entstammen, konnten bislang noch nicht bearbeitet werden.

Sollte sich dieses Ergebnis durch weitere Versuche bestätigen, kann zumindest festgehalten werden, dass GE-gekoppelte ICP-MS wie auch Membrane Dot-Blot eine frühe Reparaturarbeit zeigen.

Die Entwicklung der GE-gekoppelten ICP-MS-Methode soll in der Zukunft dahin führen, dass quantitative Bestimmungen des Platins (und damit der exakten Schädigung der DNA) und der Bruchstückgrößen möglich sind. Es werden deshalb in naher Zukunft noch einmal Versuche unternommen in denen getestet wird ob, durch längere Inkubationszeiten des Cisplatins, höhere Platin-Einbauraten in die DNA zu erreichen sind, ohne zu viele Zellen zu letalisieren. Damit würde die Platinmenge besser detektiert und bestimmt werden können.

Findet man ein robustes Design, welches genaue und reproduzierbare Ergebnisse liefert, lässt sich durch In Bezug-setzen der Bruchstücke zu den gemessenen Platinmengen eine genaue Ermittlung der Schadenshöhe erreichen, wie sie notwendig für die Beurteilung der Reparaturleistung ist.

Als Fazit bleibt zur DNA- Reparatur im Cisplatinexperiment festzuhalten:

Es konnte ein früher und ein später Reparaturschwerpunkt bei einer cisplatininduzierten DNA-Schädigung bei beiden Arten beobachtet werden. Die frühe Reparatur erfolgt bei beiden Arten ca. 1 Stunde, die späte Reparatur beim Schimpansen nach 5, beim Menschen nach 6 Stunden (nach Cisplatinschädigung).

Die Reparaturleistung lässt sich nicht ermitteln, da die exakte Schadenshöhe unbekannt ist.

4.1.3 Die Untersuchung der Genexpression

Eine Untersuchung der Expressionen der Gene des Repair-Chips sollte zeigen, ob es zu den bei der DNA Reparatur-Untersuchung gefundenen Reparatur-peaks entsprechende Expressionsmuster gibt.

Um die Aktivität von Genen (Expression) in unterschiedlichen Stoffwechsellagen simultan zu messen, werden standardmäßig Micoarray- und Multiplex Quantitative RT-PCR-Methoden eingesetzt (Haibe-Kains B., 2005). Mit diesen Verfahren kann kostengünstig die relative Gen-Expression in sogenannten Hochdurchsatz-Verfahren gemessen werden.

Diese Verfahren wurden im Cisplatinexperiment angewandt, um die differentielle Genexpression der stündlich gezogenen Proben (0h bis 7h) von Mensch und Schimpanse (jeweils eine cisplatinbehandelte Gruppe versus eine unbehandelte Kontrollgruppe) zu bestimmen.

Die Ergebnisse der Microarrayexperimente lassen, für sich genommen, mehr Fragen offen als sie beantworten. Zunächst einmal wurden Expressionsmuster (Tab. 3.1) gefunden, die entgegen den Erwartungen, nur teilweise mit den auffälligen Reparaturzeitpunkten (1h und 5h bzw. 6h) korrelieren (Abb. 3.1). So korrelieren die differentiell regulierten Gene (13 Gene) der 1h-Proben beim Menschen zwar mit dem hohen Reparaturpeak zu diesem Zeitpunkt; dies trifft aber nicht beim Schimpansen (2 Gene) zu.

Bei den 5h Proben korrelieren die gemessenen Expressionen beim Schimpansen (14 Gene) mit dem hohen Reparatur-Peak und beim Menschen mit dem niedrigen Reparatur- Peak (3 Gene).

Die 6h Probe korreliert beim Schimpansen zwar mit der entsprechenden niedrigen Reparatur mit nur 3 differentiell regulierten Genen; beim Menschen lässt sich nur eine schwache, Korrelation der Expression mit dem entsprechenden Reparatur- Peak zu diesem Zeitpunkt beobachten.

Man kann festhalten, dass kein eindeutiges Regulierungs-/Reparaturmuster gefunden wurde.

Dieses Problem würde bei der spezifischen Fragestellung des Cisplatinexperimentes, ungeachtet der Tatsache ob die differentiell regulierten Gene nun optimal oder suboptimal bestimmt wurden, allerdings immer auftauchen, wenn die Expressionsmessung mittels Microarraytechnik durchgeführt wird.

Das Konzept dieser Technik besteht darin, eine qualitative aber keine quantitative Messung zu ermöglichen. Das bedeutet, die erfassten Expressionen werden relativ zueinander in Bezug gesetzt aber nicht absolut bestimmt.

Die damit verbundene Problematik wird gerade am Cisplatinexperiment deutlich: wir sehen bei den 1h- Proben jeweils deutliche Reparaturpeaks aber nur beim Menschen auch entsprechend regulierte Gene. Dafür gibt es mehrere Erklärungsmöglichkeiten (korrekte Messungen vorausgesetzt): erstens könnte es sein, das der Schimpanse grundsätzlich höher „fährt“, also ein generell höheres Expressionsniveau, die DNA-Reparatur betreffend, hat und deshalb zwischen der Schimpansen- Kontrollgruppe und der Schimpansen- Cisplatingruppe nur zwei Gene differentiell reguliert sind. Vielleicht reguliert der Mensch sparsamer, wirft also die „Reparaturmaschine“ erst an, wenn es notwendig wird. Zweitens kann es sein, dass zwar die Reparaturrate ähnlich war (gemessen mit Membran Dot-Blot), aber die tatsächliche Schädigung, die bislang noch nicht genau ermittelt werden konnte, unterschiedlich hoch ausfällt. Das würde auch eine unterschiedliche Reparaturleistung bedeuten.

Es lässt sich also weiterhin festhalten dass es nicht möglich ist festzustellen, wie „teuer“ die Reparatur für den Menschen bzw. den Schimpansen ist. Denn weder die genaue Reparaturleistung, noch die wirkliche (quantitative) Expression ist bekannt.

Die Microarraytechnik ist also, wenn sie als einzige Methode zur Expressionsmessung im Cisplatinexperiment verwendet wird, in ihrer Aussage gewissen Beschränkungen unterworfen. Weiterhin findet sie natürlich auch nur Transkripte, die durch den Chip schon vorgegeben sind, d.h. Isoformen werden zum Beispiel nicht detektiert.

Darüber hinaus sollten auch die ermittelten Microarray-Ergebnisse einer kritischen Betrachtung unterzogen werden. Die Erfahrungen der letzten 10 Jahre im Zusammenhang mit Microarrayexperimenten zeigen, dass bei Anwendung dieser Technik nur bei einer optimalen Vorgehensweise auch optimale Ergebnisse geliefert werden können (Allison, 2006).

Es könnten grundsätzlich folgende Fehler vorkommen:

1. Es werden die falschen Gene als differentiell reguliert ermittelt (Benjamini, Hochberg, 1995);
2. Es werden Gene die differentiell exprimiert sind, nicht ermittelt;

diese beiden Fehler führen dazu, dass zu wenige (bzw. gar keine) oder zu viele Gene als differentiell exprimiert angesehen werden. Die weitere Datenanalyse kann zu falschen Zuordnungen (z.B. fehlerhafte Cluster) oder Interpretationen führen.

Bei der Wahl der geeigneten Microarraytechnik im Cisplatinexperiment, hat man sich, aus einer Reihe von technischen, logistischen und finanziellen Überlegungen heraus, für sogenannte cDNA- Chips entschieden. Diese konnten intern und somit kostengünstig hergestellt werden. Die entsprechende technische Ausstattung zur Bearbeitung war bereits vorhanden. Die Vielzahl an Arbeitsschritten ist allerdings fehleranfällig (Blettner, 2005). Aus diesem Grunde wurden die nötigen Schritte von einer sehr erfahrenen Mitarbeiterin des Instituts gemacht.

Die cDNA- Chips wurden mit humaner cDNA gespottet, was auf Grund der Sondenlänge und der sehr nahen Verwandschaft zwischen Mensch und Schimpanse, tolerierbar ist. Nicht tolerierbar wären weiter verwandte Primaten gewesen, dann hätten zusätztlich mit der entsprechenden cDNA sogenannte Multi- Spezies- Arrays gespottet werden müssen, um die notwendige Spezies-Spezifität zu gewährleisten.

Das Design der Microarrayexperimente sah biologische Replikation vor, und verwendete DNA von je vier Individuen, was, wie weiter oben geschildert, dem Stand der Technik entsprach (Allison, 2006; Buneß, 2006, Meese, 2006).

Die, zu geringe Samplezahl (ein Minimum von je 5 Organismen wird empfohlen) wurden zu Pools zusammengefasst. So weit ist diese Vorgehensweise üblich. Da aber immer nur je ein Pool zur Verfügung stand und nur mit mehreren Pools valide, statistische Daten erhoben werden können, muss durch diese Vorgehensweise eine Verzerrung der Ergebnisse befürchtet werden. Auf den gegebenen Möglichkeiten beruhend, wäre es vermutlich besser gewesen, die Individuen einzeln zu messen und dann zusammen zu fassen. So würden auch inter-individuelle Variation und Kovariation besser eingeschätzt werden können.

Die Schritte für das Pre-Processing sah zunächst die übliche Transformation der Daten in log2- Daten vor, um hoch- und runterregulierte Gene gleich zu behandeln.

Danach wurde, ebenfass der geltende Standard, mit einem „R“-Skript, welches institutsintern auf Basis des „R“-Paketes der BioConductor-Seite erstellt wurde, normalisiert. Dadurch wurden ergebnisverzerrende, systematische Fehler (als M/A-Plot dargestellt) reduziert (Tresch, 2005).

Um zu bestimmen, welche Gene als differentiell exprimiert anzusehen sind, wurde nach der Normalisierung ein Fold Change von 0,8 und 1,2 festgelegt. Sollten, nach weiteren wechselnden Kriterien, überwiegend Daten unter 0,8 liegen, so wurde ein Gen als herunterreguliert, bei über 1,2 als hochreguliert betrachtet.

Diese manuelle Vorgehensweise, vor kurzem noch absolut üblich, gilt heute als nicht mehr empfehlenswert. Es sollten statistische Hypothesen getestet werden um die differenzielle Regulierung zu bestimmen. Die angewendeten Methoden sollten eine hohe Power und eine geringe False Discovery Rate (FDR) haben und sollten, wie heutzutage vor Beginn eines Microarrayexperimentes empfohlen, mit einem Bioinformatiker abgesprochen sein, denn: „to call the statistician after the experiment is done may be no more than asking him to perform a post-mortem examination: he may be able to say what the experiment died of” (Ronald Fisher, 1938, in: Hankeln, T., 2006).

Die Daten wurden nicht geclustert, da eine Clusterung mit Probenset-Größen unter 50, als kaum reproduzierbar gilt und Fragestellungen bezüglich differentieller Expression offenbar nur unzureichend beantwortet (Allison, 2006).

Validiert wurden die Expressionsdaten nicht. Gerade bei der Validierung von Microarrayexperimenten gibt es kaum überzeugende Empfehlungen. Üblich ist die Bestätigung der Daten mit real time-Polymerase Chalin Reaction (rt-PCR) (Goldsmith, 2004). Aber auch zur rt-PCR als Validierungsmethode gibt es, wie weiter oben erwähnt, kritische Stimmen (Allison, 2006).

Als zusätzliche Erschwernis in der Bewertung der Ergebnisse der Microarrayexperimente erwies sich, dass die gefundenen, regulierten Gene sich von Experiment zu Experiment zum Großteil unterschieden. Nur sehr wenige Gene konnte mehrmals gefunden werden.

4.2 Bioinformatische Methoden und Ergebnisse

Grundgedanke der bioinformatischen Untersuchung im Rahmen des Cisplatinexperimentes war es, die aus den labortechnischen Ergebnissen hervorgegangenen Kandidatengene strukturell zu analysieren.

Ziel war es, eventuell mit den Laborergebnissen übereinstimmende Muster zu finden, um Erklärungsansätze für die unterschiedlichen Reparaturantworten beider Arten zu generieren.

Für die bioinformatische Untersuchung wurden, wie im Methodenteil beschrieben, Selektionsereignisse verschiedener Strukturen analysiert und beschrieben.

Die Vergleiche der Sequenzen zwischen Mensch und Schimpanse sind durch den vorläufigen Charakter der Annotation des Schimpansen und weniger DNA-Donoren, mit Vorsicht zu handhaben (The Chimpanzee Sequence and Analysis Consortium, 2005). Präzise Ergebnisse bioinformatischer Sequenzanalysen, erfordern grundsätzlich als Basis die Validierung der Annotation durch labortechnische Methoden (Hollricher, 2005). Ohne diese, also nur mit WD- Sequenzen und „Finder“- Programmen, lassen sich zwar interessante Untersuchungen anstellen; die Ergebnisse solcher Untersuchungen haben aber nur einen Näherungscharakter und werden umso schwieriger (bzw. unpräziser) je näher die Arten, deren Sequenzen untersucht wurden, miteinander verwandt sind.

Unter diesen Aspekten sollten auch die Ergebnisse der folgenden Untersuchungen als globale Trends und weniger als (Nukleotid-) genaue Resultate gesehen werden.

4.2.1 Kodierende Bereiche

Die (Protein-) Evolution benötigt zwei Schritte: die Mutation von kodierenden Nukleotiden und die Fixation neuer Varianten in einer Population (Pál, 2006).

Im Laufe der Zeit entstehen Sequenzmutationen im gesamten Genom. Im Bereich des ORF können diese zu Veränderungen der Codons und somit zu anderen Aminosäuren führen. Solche Veränderungen werden nicht-synonym genannt.

Verändert sich das Codon, aber nicht die Aminosäure (der genetische Code ist degeneriert, d.h. es gibt 64 Codons die nur für ca. 20 Aminosäuren kodieren), so spricht man von einer synonymen Veränderung.

Um homologe ORF´s zu überprüfen, sprich zu testen, ob es sich bei der entsprechenden Sequenz um eine negativ, beinahe neutral oder positiv selektionierte handelt, werden bestimmte statistische Algorhythmen angewandt.

Für statistische Methoden gilt (Clauß, Finze, Partzsch, 1995):

- Sie liefern niemals Aussagen zur inhaltlichen Bedeutung der durchgeführten Untersuchung.
- Die Statistik liefert für die Untersuchung keine Kriterien über die Beobachtungsgrößen.
- Die Anwendung ist von bestimmten Parametern abhängig, für die der Anwender verantwortlich ist.

4.2.1.1 dN/dS-Methode

Es ist verführerisch, einen Algorhythmus zu konstruieren und damit zu bestimmten Aussagen zu gelangen. Immer aber sollten mehrere Betrachtungsweisen und die Schwachstellen einer statistischen Auswertung mit in die Überlegungen einbezogen werden.

Die in der molekularen Evolutionsbiologie verwandten statistischen Methoden verwenden Sequenz- oder andere molekulare Daten.

Sie basieren auf der Theorie von Kimura (1968) und King und Jukes (1969) die ungefähr besagt, dass die meisten Polymorphismen selektiv neutral sind (Nielsen, 2001). Somit wird die Überprüfung der „neutral null hypothesis“ zum Kriterium für evolutionär relevante Bereiche.

Da oftmals die Nachteile dieser Methoden in Publikationen unterschlagen werden, soll im Folgenden noch einmal auf die besonderen Problematiken der dN/dS- Methodik eingegangen werden (Hurst et al., 2002).

Kritik am dN/dS -Methode

Die dN/dS-Untersuchung ist eine sehr gängige Methode um Sequenzen auf ihren evolutionären Gehalt zu überprüfen.

Multiple Hits

Es spielt zunächst eine Rolle, dass bei Sequenzen, die über eine gewisse Zeit divergiert sind, die tatsächliche Anzahl der Austausche unterschätzt wird. Wird zum Beispiel an der gleichen Stelle ein A erst durch ein C und dann durch ein T ersetzt, würden diese zwei Veränderungen als eine Veränderung im Alignment erscheinen.

Man kann das Ausmass der realen „Sättigung“ mit sog. „multi-hit-correction“-Methoden versuchen einzuschätzen; aber auch diese Methoden sind natürlich unterschiedlich, je nach Auffassung und bleiben letztendlich ungenau.

Unschärfe

Würde ein Teil eines Gens unter starker positiver Selektion stehen, während ein anderer, gleichlanger Teil unter gleich starker negativer Selektion steht, würde ein dN/dS = 1 –Verhältnis herauskommen.

Eine weitere Unschärfe des dN/dS -Tests besteht darin, dass es negative Selektion an synonymen Sites zu geben scheint, zum Beispiel auf Grund ökonomischer Effekte: „If two aminoacids...do the same job, then selection might favour the retention of the one for which synthesis requires less energy“ (Pál, 2006).

dS- Dips

Wenn eine sehr geringe dS aufgrund negativer Selektion (dS-Dip) synonymer Sites mit einer normalen dN verrechnet wird, könnte im Prinzip ein Wert dN/dS > 1 entstehen.

Fragwürdige Grundvoraussetzungen

Ein weiteres Problem entsteht dadurch, dass der dN/dS -Test davon ausgeht, dass synonyme Austausche selektiv neutral sind. Dann sollten sie mit einer ähnlich hohen Rate wie andere, putativ neutrale, Sequenzen evolvieren. Das tun sie nicht. Synonyme Sites evolvieren mit einer Rate von etwa 70% zu der von Pseudogenen (Chamary, 2006).

Codon Usage Bias

Weiterhin haben Vergleiche alternativ und konstitutiv exprimierter Exons ergeben, dass es einen „Codon Usage Bias“ (= unterschiedliche Frequenz der Benutzung synonymer Codons) gibt. Das heißt in diesem Fall, die Rate synonymer Selektion in konstitutiv exprimierten Exons ist höher als in alternativ exprimierten, was bedeuten würde, dass es eine Selektion für den Gebrauch optimaler Kodons in konstitutiven Exons gibt.

Transkript- Effizienz

Ein Transkript muss nicht nur in einer bestimmten Rate exprimiert werden, sondern auch in einer bestimmten Qualität. Die Introns müssen sauber herausgeschnitten werden, die resultierende mRNA muss stabil exportiert und zuverlässig von der entsprechenden tRNA transportiert werden. So scheinen effektives Splicing und mRNA- Stabilität gegen Degradation, für bestimmte Präferenzen zu sprechen. Eine Beobachtung die den evolutionär hoch konservierten und stabilen Histongenen gemacht wurde (Chamary, 2006).

Setzt man voraus, dass die verwendeten Methoden die evolutionären Ereignisse gut abbilden und berücksichtigt man die dargestellten Einschränkungen der dN/dS- Methoden, lässt sich anhand der Ergebnisse der Untersuchung kodierender Sequenzbereiche der Kandidatengene des Cisplatinexperiments festhalten, dass kein einziges Gen eine positive Selektion aufweist. Das bedeutet, der kodierende Sequenzbereich der Kandidatengene ist konservierenden evolutiven Kräften ausgesetzt.

Bei den dargestellten Problematiken der verschiedenen Testmethoden erscheint es sinnvoll, nicht nur eine Methode anzuwenden, um zu Aussagen über die Selektion bestimmter Sequenzbereiche zu gelangen: „With the increased availability of both comparative genomic data and SNP data, we exspect to see many future studies that take advantage of the availability of both types of data“ (Nielsen, 2005).

Um die durch den o.g. dN/dS-Methode erarbeiteten Ergebnisse zu ergänzen wird in dieser Arbeit eine auf SNP-Daten basierende Methode (Voight, 2006) verwendet: der Haplotter.

4.2.1.1 Die Haplotter-Untersuchung

Der Vergleich humaner mit Schimpansensequenzen ermöglicht Erkenntnisse über den Allelstatus: anzestral oder abgeleitet (The Chimpanzee Sequence and Analysis Consortium, 2005).

Mit der Haplotter-Untersuchung kann rezente, positive Selektion an einem Lokus detektiert werden und zwar ohne Sequenzen anderer Arten zu alignieren.

Er vergleicht verschiedene Niveaus des Linkage disequilibirum (LD; deutsch: Kopplungsungleichgewicht) die ein positiv selektioniertes Allel umgeben, mit dem Hintergrundallel derselben Position (Haplotter Guide, 2006).

Das LD ist die nicht-zufällige Assoziierung von Allelen an 2 oder mehreren Loci. Es beschreibt Allelenkombinationen, welche häufiger oder weniger häufig in einer Population auftreten als erwartet. Das LD lässt sich also anhand der Differenz von beobachteter zur erwarteter Allelenfrequenz quantifizieren (Kiefel, 2005).

Das Verhältnis von Haplotypen zum Allelenhintergrund wird als „integrated haplotype score“ (iHS-Wert) ausgedrückt (Voight, 2006).

Dabei gilt: ein iHS-Wert von > 2 wird als Nachweis für eine positive Selektion des betrachteten Lokus interpretiert.

Die Haplotter-Untersuchung basiert auf der Analyse von SNP-Daten (Single Nucleotide Polymorphisms) aus der Phase 1 des internationalen, humanen HapMap-Projektes. Die Daten enthielten ca. 800.000 SNP´s in 309 unverwandten Individuen, die in drei Gruppen unterteilt wurden: East Asian (Japaner und Han- Chinesen), Nord- und Westeuropäer und Yoruba (= subsaharische Population). Diese Daten werden miteinander verglichen (Voight, 2006).

Bei schnell evolvierenden Genen könnte auch eine entsprechende Evolution zwischen Schimpansen und Menschen denkbar sein, da hier ein evolutiver Abstand von 4-6 Mio Jahren besteht. Die Ergebnisse der dN/dS-Methode und der Haplotter-Methode könnten sich ergänzen, bzw. bestätigen. Zumindest aber ist der Haplotter-Test ein weiteres Indiz für selektive Ereignisse im humanen Genom und somit eine zusätzliche wertvolle Informationsquelle (Voight, 2006).

Die Haplotter-Untersuchung hatte zum Ergebnis, dass nur ein Kandidatengen positiv selektioniert war: TNKS. Alle anderen Gene sind, auch mit dieser, rein auf den Menschen bezogenen Methode, als konserviert zu betrachten.

Die Haplotter-Ergebnisse verwundern nicht, ausser im Fall des Gens TNKS.

Legt man die oben beschriebene Überlegung zu Grunde, so sollte TNKS, welches nach der Haplotter-Methode positiv selektioniert ist, erst recht nach der dN/dS-Untersuchung positiv selektioniert sein. Das ist aber nicht der Fall.

Eine eingehendere Betrachtung zeigt, dass die unterschiedlichen Ergebnisse offenbar nur durch den Intron-Bereich des Gens verursacht werden. Denn während die dN/dS-Untersuchung nur die ORF-Region beurteilt, analysiert der Haplotter das ganze Gen. Und ergab die strukturelle Untersuchung für TNKS weder im ORF-, noch in den UTR-, noch in den putativen Promotorbereichen auffällige Divergenzen zwischen der menschlichen und der Schimpansensequenz, konnte im Intronbereich eine Nukleotiddivergenz von 72,41% festgestellt werden. Diese Zahl ist um so beeinduckender, als die Längendivergenz nur 2,6% beträgt, die Introns also fast gleichlang sind.

TNKS ist ein auf Chromosom 8 lokalisiertes Gen, das bei der Erhaltung von Telomeren-Längen eine wichtige Rolle spielt. Telomeren, repetitive DNA-Sequenzen am Ende eines Chromosoms, werden in den meisten Geweben bei jeder Zellteilung ein wenig kürzer und gelten durch diesen Prozess als entscheidende Faktoren der Zellalterung. Im Unterschied zu den meisten anderen werden in einigen Zelltypen, unter anderem in Tumorzellen, die Telomeren-Längen durch das Enzym Telomerase wiederhergestellt. Damit die Telomerase diese Arbeit verrichten kann, muss erst ein anderes Protein entfernt werden (TRF1), das der Telomerase den Zugang blockiert. Dies geschieht durch das Protein Tankyrase, welches durch das Gen TNKS kodiert wird (Pennisi 1998, Smith et al. 1998, OMIM *603303). TNKS wird dadurch zu einem interessanten Ziel für Krebstherapeutika (Seimiya, 2005).

Im Cisplatinexperiment konnte eine Hochregulierung von TNKS bei Pan schon eine Stunde nach Cisplatinschädigung und eine Herunterregulierung 5 Stunden nach Cisplatinschädigung beobachtet werden. Bei Homo wurde keine auffällige Regulierung von TNKS zu keinem Zeitpunkt gefunden. Offenbar scheint es im Rahmen des DNA-Reparaturprozesses Unterschiede auf Transkriptionsebene zu geben, die bei der Telomerenlängen-Erhaltung eine bedeutende Rolle spielen können.

Nur mit der dN/dS-Methode betrachtet würde TNKS als negativ selektioniert gelten (dN/dS = 0,167) und so im Rahmen des Cisplatinexperimentes als unauffällig gelten. An dieser Stelle wird eine weitere Schwäche der dN/dS- Methode sichtbar: sie bildet die wirklichen Selektionsereignisse innerhalb eines Gens nicht nur in den kodierenden Exonbereichen ungenau ab, sondern kann auch für das gesamte Gen keine spezifischen Aussagen bezüglich lokaler, selektiver Ereignisse machen.

Abschließend lässt sich festhalten, dass die im Labor gefundenen Unterschiede zwischen menschlichen und Schimpansenzellen, bezüglich DNA- Reparaturarbeit und Gen-Expression, durch Selektionsereignisse in den kodierenden Bereichen der Kandidatengene nicht erklärbar sind.

Diese Ergebnisse führten zu einem zweiten Ansatz: wenn die Unterschiede nicht durch Selektion in den kodierenden Bereichen erklärbar sind, gibt es vielleicht regulatorische Sequenzbereiche, welche Selektionsereignisse aufweisen.

4.2.2 Regulatorische Bereiche

4.2.2.1 Putative Promoterbereiche

Der putative Promoterbereich wurde als Kandidat für die Steuerung differenzieller Expression gesehen. Diese Erwartung konnte, zumindest im Cisplatinexperiment, nicht bestätigt werden.

Allerdings haben neuere Untersuchungen gezeigt, dass klassische TATA-Box Promoter nur eine Minderheit unter allen sonstigen Promotern darstellen und dazu noch eine, die ohnehin mit hoch konservierten, gewebsspezifischen Genen assoziiert wird (Carninci, 2006). Ein Umstand, der durch die Ergebnisse des Cisplatinexperiments bestätigt wird, zumindest wenn man davon ausgeht, dass sich in den putativen Promoterbereichen auch TATA- Box Promoter befinden.

Promoter können offenbar jedoch überall sein, auch in den Exons und auch im 3´- UTR- Bereich der Gene. Alternativer Promotergebrauch, also der Gebrauch von zwei oder mehreren Promotern, ist entgegen früheren Schätzungen (18 – 20%) offenbar bei 58% der proteinkodierenden, transkriptionalen Einheiten zu beobachten (Carninci, 2006).

Diese alternativen Promoter würden durch die verwandte Methode nicht detektiert werden. Ein valider Vergleich der Promoter von Genen, oder besser, protein-kodierenden, transkriptionalen Einheiten zwischen Mensch und Schimpanse, kann nur dann angestellt werden, wenn die Promoter von Schimpanse analog zu den Arbeiten von Carninci und Kollegen (2006) im Labor analysiert werden. Und weiterhin müsste bei diesen Ergebnissen auch immer beachtet werden, dass Promotergebrauch sehr häufig gewebsspezifisch ist. Damit würden Ergebnisse von Analysen die, wie in unserem Fall lymphoblastoide Zellen als Untersuchungsgegenstand haben, nicht ohne weiteres auf andere Gewebstypen übertragbar sein.

Abschließend lässt sich folgendes festhalten: die putativen Promoterbereiche 5´-upstream der Kandidatengene sind bis auf eine Ausnahme (DNAJA3) zwischen Mensch und Schimpanse konserviert. Andere Promoterbereiche können auf Grund der fehlenden Daten der Schimpansensequenz zurzeit nicht bioinformatisch untersucht werden.

DNAJA3 das auch hTid-1 genannt wird, kodiert (durch alternatives RNA-Splicing) für zwei Proteine TidL und TidS. TidL begünstigt die Apoptose, den programmierten Zelltod, während TidS ihn unterdrückt (Edwards, Münger, 2004). DNAJA3 fungiert somit als wichtiger Regulator für den Zelltod.

Das Gen ist in den meisten Bereichen zwischen Mensch und Schimpanse hochkonserviert (dN/dS = 0; iHS > 2; 3’ –UTR = 1,61% Divergenz; 5’-UTR = 3,33% Divergenz), ausser im Intron- (85,9% Divergenz) und im putativen Promoterbereich (12,3% Divergenz). Möglicherweise könnte die hohe Divergenz im Intronbereich einen grundsätzlichen Unterschied in der Expression dieses Gens, analog zu TNKS, zwischen Homo und Pan bedeuten. Der Unterschied im putativen Promoterbereich könnte mit Unterschieden der verschiedenen Splicingvarianten zusammenhängen.

Bei den Expressionsanalysen des Cisplatinexperimentes ist DNAJA3 nur bei Homo, sechs Stunden nach der Cisplatinapplikation, (hoch-) reguliert. Diese Hochregulierung, vorausgesetzt sie findet sich auch auf Proteinebene wieder, führt die Zelle vermutlich der Apoptose zu, denn eine fehlende Expression bewirkt einen Schutz vor Apoptose: „Here, we show that cells essentially lacking expression of hTID1 proteins are protected from cell death in response to multiple stimuli, including cisplatin.“ (Edwards, Münger, 2004).

4.2.2.2 5´-UTR und 3´-UTR-Bereiche

Den 5´-UTR und 3´-UTR-Bereichen werden regulatorische Eigenschaften für die ihnen zugehörigen Gene unterstellt.

Als die jeweilig terminalen Exons „links“ und „rechts“ der entsprechenden Gensequenz, werden die 5´- und 3´-untranslatierten Bereiche mit in die mRNA kopiert. Dort helfen sie, ähnlich wie die 5´-Cap und der 3´-poly-A-tail, die mRNA an die Ribosomen zu binden und zu stabilisieren (Strachan & Read, 1999).

Der 5’- UTR ist überwiegend bei der Regulation der Initiation der Transkription beteiligt und offenbar Ziel einer positiven Selektion (Hellmann, 2003). Jedoch zeigen jüngere Arbeiten, dass die regulatorische Bedeutung des 3’-UTR mindestens ebenso hoch eingeschätzt werden kann. 3’-UTR´s sind in die Regulation auf verschiedensten Ebenen involviert: in der Prä-mRNA-Ebene (3’-End-Formation und Polyadenylierung), in der reifen mRNA-Ebene (Stabilität/Degradation, Export, Translationseffizienz) und als Ziele von miRNA´s (Chen, 2006).

Die Ergebnisse der Untersuchung der Kandidatengene des Cisplatinexperimentes lassen auch diesen Umstand erkennen. In den UTR´s positiv selektionierte (>5% Divergenz) Kandidatengene, waren zu einem höheren Anteil zu beobachten als bei der Betrachtung putativer Promoterbereiche. In 9 Genen (= 29%) konnte eine positive Selektion entweder im 3´-UTR oder im 5´-UTR, in einem davon (XRCC3) sogar in beiden Bereichen gezeigt werden.

Unterschiede in den UTR-Strukturen sollten auch unterschiedliche Regulationsereignisse zur Folge haben.

Es lässt sich auf Grund dieser Resultate also folgende Aussage treffen: Wenn sich unterschiedliche Regulation durch UTR-Bereiche in Sequenzunterschieden wiederfinden lässt, könnte die differentielle Regulation von 9 Kandidatengenen mit den gefundenen Unterschieden in eben diesen Bereichen zusammen-hängen. Es ist kein spezifisches Muster zu erkennen in dem Sinne, dass eine bestimmte Art Gene über den 3`-UTR bzw. 5’-UTR reguliert werden würden. Es fällt aber auf, dass von den genannten neun Genen acht in der späten Reparaturantwort (Homo: 6h; Pan: 5h) reguliert sind und nur eines (TOP3B) in der frühen. Biologisch ist dieses Ergebnis nicht signifikant. Dennoch erlaubt die oben genannte Beobachtung die Frage, ob zeitliche Abläufe von Gen-Expressionen bevorzugt durch UTR-Bereiche reguliert werden.

4.2.2.3 Intronbereiche

Der Vergleich intronischer Sequenzen der Kandidatengene zwischen Schimpanse und Mensch zeigt einen deutlichen Trend: 21 von 31 untersuchten Genen (= 67,7%) zeigten eine Sequenzdivergenz von über 5%. Ein Zusammenhang von kurzen bzw. langen Introns mit bestimmten Reparaturzeitpunkten konnte nicht erkannt werden. Die anfängliche Erwartung, dass Gene mit kurzen Introns bei der ersten, schnellen Reparaturantwort nach einer Stunde übermäßig vertreten wären und Gene mit längeren Introns eher bei der späteren Reparatur, hat sich also nicht bestätigt.

Auch konnte kein artspezifisches Muster im Längenunterschied erkannt werden: mal sind die Schimpansen- Introns länger, mal die Mensch-Introns.

4.2.4.4 Betrachtung aller Bereiche

Fügt man alle Bereiche zu einer ja/nein Matrix zusammen, wie im Teil „Ergebnisse“ dargestellt, lassen sich einige interessante Beobachtungen machen. Besonders interessant ist die Miteinbeziehung der ORF-Bereiche in die Divergenzbetrachtung (Tab. 4.1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab. 4.1: Differentiell exprimierte Gene d. Cisplatinexperimentes mit ORF-Divergenz > 5%

Angenommen, selektive Ereignisse variieren regional. Würde zum Beispiel ein UTR-Bereich eine hohe und ein angrenzender Exon-Bereich eine geringe Sequezdivergenz aufweisen. Dann könnte dies eine, rein auf die durchschnittliche Sequenzdivergenz bezogene Betrachtung in Frage stellen.

Es müssten also die örtlichen Durchschitte der Divergenz in die Gesamtbeurteilung mit einbezogen werden. Diese Vorgehensweise wird auch schon an verschiedener Stelle gemacht. So wurden zum Beispiel von Khaitovich und Kollegen (2005) die vierfach degenerierten Positionen (engl.: „4fold degenerated sites“), deren Veränderung keinerlei Auswirkung auf die Kodierung einer Aminosäure hat, als angenommenes, neutrales Maß des lokalen Selektiondrucks verwendet. Benachbarte Strukturen wurden dann mittels dieses Maßes bewertet.

Im Cisplatinexperiment wurde von der Berechnung der 4fd degenerated sites als Maß lokalen Selektionsdrucks abgesehen, da ein Vorversuch zeigte, dass MEGA 3.0, ein internationaler Standard zur Auswertung von Sequenzdaten, immer wieder veränderte Werte produzierte- bei exakt gleicher Dateneingabe !

Durch eine andere Vorgehensweise, nach dem Prinzip Ähnliches mit Ähnlichem zu vergleichen, wurden für die kodierenden Sequenzen die Divergenzen analog zu den regulatorischen Bereichen berechnet (Programm: BioEdit, Tool: Sequence identity).

Die Ergebnisse des Cisplatinexperimentes zeigen, das es klare regionale Unterschiede in der Divergenzrate gibt. Die meisten Gene zeigen ein eher zu erwartendes Bild dergestalt, dass regulatorische Bereiche stärker divergieren als kodierende. Dennoch zeigen Ausnahmen wie UBE2V1 dass auch der umgekehrte Fall eintreffen kann. Hier weist der kodierende Bereich eine mehr als doppelt so hohe Sequenzdivergenz als die angrenzenden regulatorischen Bereiche auf.

Mit anderen Worten, wenn innerhalb eines Gens auf Grund selektiver Drücke, zum Beispiel im kodierenden Bereich, starke Sequenzdivergenzen zwischen Schimpanse und Mensch zu beobachten sind (die sich naturgemäß nicht notwendigerweise auf die Kodierung von Aminosäuren auswirken müssen), bedeutet das nicht automatisch, dass in den unmittelbar benachbarten Strukturen, z.B. Introns, ebenfalls eine starke Sequenzdivergenz zu erwarten ist.

Ein Problem grundsätzlicher Art stellt die Auswahl der betrachteten, regulatorischen Bereiche dar. Da es zunehmend deutlicher wird, dass ein Großteil der Regulation nicht nur über die DNA-Ebene läuft, sondern auch über das Niveau der RNA-Gen gesteuerten, regulatorischen RNA´s und über das Niveau epigenetischer Regulation (Methylierung, Histon-Code etc.), muss eine Untersuchung, die nur eines dieser Regulationsniveaus in Betracht zieht, naturgemäß unvollständig bleiben. Was die bioinformatische Arbeit angeht, wurden auch mittlerweile erste Schritte unternommen, Software zu entwickeln, die bisher durch die bestehenden Programme nicht detektierbare Sequenzmuster findet. Die Programme können putative RNA-Gene vorhersagen, wie das Programm RNAz (Washietl, 2005) oder zum Beispiel Methylierungsmuster in bestimmten Geweben, wie der HDMFinder (Das, 2006).

Eine, nach bisherigen Kenntnissen, vollständige Betrachtung müsste alle drei Regulationsebenen in Betracht ziehen und die daraus resultierenden Ergebnisse eventuell im Labor validieren.

4.3 Die Planungsstrategie des Cisplatinexperimentes

Die Grundüberlegung des Cisplatinexperimentes war es, ob sich für die unterschiedliche Empfänglichkeit für Tumorerkrankungen zwischen dem Menschen und seinem engsten Verwandten, dem Schimpansen, eine Erklärung auf molekulargenetischer Ebene finden lässt. Als grundlegendem Mechanismus, von dessen einwandfreiem Funktionieren die Zelle abhängig ist und dessen Störung zu Tumorerkrankungen führen kann, wurde die DNA- Reparatur als Untersuchungsgegenstand ausgewählt.

Von diesem Ansatz ausgehend, wurde als Agens für eine definierbare DNA- Schädigung Cisplatin verwandt und die daraus hervorgehenden Reparaturantworten der Zelle für Mensch und Schimpanse beobachtet und ausgewertet.

Den Erwartungen entsprechend konnten Unterschiede beobachtet werden und zu deren Erklärung wurde im wesentlichen der Mechanismus der Genregulation auf bioinformatischer Ebene untersucht.

Die erzielten Ergebnisse aus diesem, sehr breit gefächerten Ansatz waren nur zum Teil verwertbar und zufriedenstellend und mussten Fragen offen lassen.

Wie in der Diskussion schon anklang, lagen die Ursachen vieler dieser Probleme zum einen in der Strukturierung des Experiments und zum anderen in der neuartigen Herausforderung, die eine komparative Analyse komplexer, zellulärer Vorgänge zwischen zwei so eng miteinander verwandten Arten wie Mensch und Schimpanse mit sich bringt.

Eine experimentelle Planung ähnlich gelagerter Untersuchungen sollte daher in Zukunft schon im Vorfeld versuchen, auf Basis einer gründlichen Recherche aller Parameter, realisierbare und durch die gewählte Methodik beantwortbare Fragestellungen zu formulieren.

Um darzulegen was das bedeutet, soll versucht werden, das Cisplatinexperiment zu restrukturieren.

4.3.1 Restrukturierung des Cisplatinexperiments

Die Restrukturierung soll anhand einer Planungsmatrix vorgenommen werden, wie sie ähnlich auch in anderen wissenschaftlichen und in wirtschaftlichen Bereichen eingesetzt wird, einem sogenannten Logical Framework Approach (LFA).

Ein LFA soll helfen, die Gedankengänge zu formulieren und dergestalt zueinander in Bezug zu setzen, dass eine innere Planungslogik entsteht. Die konsequente Anwendung dieser Technik hilft dabei, Planungsfehler und unlogische Zusammenhänge schon während der Planungsphase aufzudecken. Der Vorteil davon ist das Sparen von Mühe, Zeit und Geld, was durch die hier vorgenommene Restrukturierung des Cisplatinexperimentes herausgearbeitet werden soll. Ein LFA soll aber nicht starr sein, sondern als Vorgabe und Kontrolle (sog. „Monitoring“) dienen und trotzdem flexibel handhabbar sein.

Als Arbeitsgrundlage ist der LFA grundsätzlich für alle Non-Profit-Projekte geeignet, da er deren Spezifika genau abbildet. Daher kann auf die derzeit aktuellste Variante „Introduction to the Logical Framework Approach (LFA)

for GEF-financed projects“ der Deutschen Stiftung für internationale Entwicklung, als Leitfaden verwiesen werden.

Im Folgenden wird die Restrukturierung des Cisplatinexperimentes unter zur Hilfenahme eines LFA´s dargestellt (Abb. 4.1) und die Vorteile dieser Vorgehensweise diskutiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4.1: Logframe-Planung für das Cisplatinexperiment

Da in den meisten Projekten zur praktischen Durchführung und Überwachung eine detaillierte Darstellung und Planung kleinster Schritte notwendig ist, wird der Projektplanungs- Logframe auf verschiedene Sub-Logframes und sog. „Activity schedules“ ausgeweitet. Diese sind dann als endgültige Arbeitsanweisungen, Termin- und auch eventuell Kostenplanungen auf Anwenderebene heruntergebrochen (Abb. 4.2 u. 4.3).

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Abb. 4.2: Komponentenplanung: Qualität und Quantität der DNA-Schädigung und -Reparatur

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Abb. 4.3: Komponentenplanung: Strukturelle Eigenschaften regulierter Gene

4.3.2 Die Vorteile einer Logframe- Planung

Wenn man die oben versuchte Projektplanung für das Cisplatinexperiment zu Grunde legt, kann man die berechtigte Frage stellen, wo der Unterschied gewesen wäre, hätte man diese Vorgehensweise vor Beginn des Experimentes gewählt.

An dieser Stelle soll nun die Überprüfung der Projektplanungsmatrix (Abb. 4.1) vorgenommen werden, und nur der Projektplanungsmatrix, da diese schon ausreicht um die Vorteile einer Logframe-Planung aufzuzeigen.

Ebene 1

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Abb. 4.4

Eine Analyse der ersten Ebene („Overall Objective“, Abb. 4.4) des Logframes zeigt, dass die Grundkonzeption des Cisplatinexperimentes logisch aufgebaut, gut durchdacht und kohärent ist. Die Aussagen die man dazu mit den Logframe- typischen Wenn/Dann- Verknüpfungen machen kann, lauten:

„Wenn die Ergebnisse aus dem Cisplatinprojekt und Daten aus Publikationen Unterschiede in den DNA- Reparaturmechanismen aufzeigen, so ist das eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche Tumorempfänglichkeit zwischen Menschen und Schimpansen.“

Ebene 2

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Abb. 4.5

Ebene zwei („Project Objective“, Abb. 4.5) besagt zunächst folgendes:

„Vorausgesetzt es gibt Unterschiede in der DNA- Reparatur, sind diese durch entsprechende Untersuchungen der Reparaturleistung, Expression und der Sequenzstruktur der regulierten Gene bekannt und benennbar.“

Man kann an dieser Stelle einwenden, ob eine Strukturuntersuchung der Kandidatengene ausreicht, um Aussagen zu Unterschieden in der DNA- Reparatur zu machen. Denn folgende Punkte müssten zur Generierung einer vollständigen Aussage abgedeckt sein: 1. die Struktur der regulierten Gene von Homo; 2. die Struktur der regulierten Gene von Pan; 3. die Struktur der anderen, nicht regulierten Gene von Homo; 4. die Struktur der anderen, nicht regulierten Gene von Pan (Diese Betrachtung gilt nur für die ca. 150 Gene des Repair-Chips).

Man könnte also bereits in Ebene zwei einwenden, ob die Herangehensweise, nur die regulieren Gene zu untersuchen, vollständig genug ist, um zu aussagekräftigen Ergebnisse zu kommen, welche eine unterschiedliche DNA- Reparatur erklären helfen sollen.

Ebene 3

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Abb. 4.6

In der dritten Ebene („Results“, Abb. 4.6) wird als erstes Ziel angegeben, dass Qualität und Quantität der DNA-Schädigung bekannt sein sollen. Dieses Ergebnis kann weder durch die verwandten Datenquellen noch durch die angegebenen Indikatoren, auch bei valider und signifikanter Datenlage erzielt werden, denn dafür ist keine spezielle Methode vorgesehen (Im laufenden Experiment wurde deswegen, wie in Kapitel 3.1.1.2 beschrieben, im Nachhinein die GE-gekoppelte ICP-MS eingeführt).

Als zweites wird verlangt, dass die Qualität und Quantität der DNA- Reparatur bekannt ist. Dieses Ziel soll durch die Verwendung der Daten aus dem Membrane Dot- Blot erreicht werden. Unterschiedliche Peaks (Indikatoren) würden unterschiedliche Reparaturquantität zwischen Homo und Pan nachweisen. Die Daten können außerdem eine Aussage über die Qualität der DNA- Reparatur liefern. Dieses Ziel ist erreichbar.

Als drittes Ziel wurde formuliert, dass die absolute und relative Gen-Expression bekannt sei. Die absolute Expression wurde als notwendig erachtet, da es zur Beurteilung der Regulationsunterschiede zwischen H. sapiens und P. troglodytes während der DNA- Reparatur wichtig ist zu wissen, ob es grundsätzliche Niveauunterschiede gibt und in welcher Höhe sich diese bewegen. Aus den vorgegebenen Datenquellen (Microarray) und Indikatoren (Kandidatengene) lassen sich nur Aussagen zur relativen Expression machen, nicht aber zur absoluten Expression. Das unter 3. formulierte Ziel kann so nicht erreicht werden.

Als viertes Ziel ist die strukturelle Aufklärung der regulierten Gene gefordert. Diese soll mit Sequenzdivergenzen und dN/dS- Berechnungen dargestellt werden. Dieses Ziel kann unter den geforderten Voraussetzungen (valide und signifikante Daten) erreicht werden.

Die Ebene vier, also die Aktivitäten, die zur Erreichung der Ziele unternommen werden sollen, braucht schon an dieser Stelle nicht weiter analysiert zu werden, da bereits die Betrachtung von Ebene 3 gezeigt hat, dass von vier Zielen die zur Erreichung des Projektziels Voraussetzung waren, zwei nicht erreicht werden können.

Bei den exemplarisch vorgestellten Komponentenplanungen kann man auf die gleiche Art und Weise weiter verfahren und wird feststellen, dass noch mehr Experiment- immanente Problemstellungen aufgedeckt werden. Diese werden hier nicht weiter ausgearbeitet, da die Darstellung einer Logframe- Planung nur deren Gestaltung und Vorteile aufzeigen sollte.

Sicher braucht es einige Zeit, um eine wie oben dargestellte Planungsmatrix zu entwerfen. Es sind dazu Gruppengespräche in der Form von zum Beispiel Brainstormings notwendig, die am geeignetsten von einem Moderator geleitet werden. Zudem müssen im Vorfeld Recherchen über Methoden, Kosten, Personal, Verfügbarkeiten, Zeitebenen und vieles mehr angestellt werden. Bis eine Grundplanungsmatix steht und diese bis auf die Ebene der „Activity schedules“ heruntergearbeitet ist, können schon ein paar Tage bis Wochen vergehen. Allerdings ist diese Zeit gut investiert, denn die Logframeplanung ermöglicht die Überprüfung der Projektlogik, stellt sicher, dass möglichst alle internen und externen Faktoren beachtet wurden und ermöglicht ein „Monitoring“, also eine Überwachung des Projektverlaufes. Dabei versteht sie sich keineswegs als starre Schablone, sondern kann im Rahmen der Projektüberwachung jederzeit überprüft und im gegebenem Fall korrigiert werden.

Im Rahmen des Cisplatinexperimentes hätte eine Anwendung dieser Technik möglicherweise inhärente Fehler beseitigt oder besser: nicht zielführende Methoden einer Korrektur unterzogen.

4.4 Zusammenfassung

Laborarbeit

1. Grundsätzlich muss die Verwendung von lymhoblastoiden Zellen für das Cisplatinexperiment in Frage gestellt werden
2. Es konnte ein früher und ein später Reparaturschwerpunkt auf eine cisplatininduzierte DNA-Schädigung bei beiden Arten beobachtet werden. Die frühe Reparatur erfolgte nach einer Stunde, die späte Reparatur beim Schimpansen nach 5 Stunden, beim Menschen nach 6 Stunden.
3. Die Reparaturleistung lässt sich nicht ermitteln, da die Schadenshöhe unbekannt ist.
4. Es konnte kein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Regulierungsmuster und dem Reparaturmuster gefunden werden.
5. Microarrays sind qualitative Analysemethoden. Die quantitative Expression ist daher nicht bekannt. Aus diesem Grund lässt sich über das DNA Repair-spezifische Regulierungsniveau keine Aussage machen.
6. Durch Punkt 5 (unbekannte quantitative Expression) und Punkt 3 (unbekannte Reparaturleistung) lässt sich der „Preis“ der DNA-Reparatur nicht bestimmen.

Bioinformatischen Sequenzanalyse

1. Die Annotation des Schimpansen ist für präzise Sequenzuntersuchungen im Schimpanse/Mensch- Vergleich noch zu schwach, die Sequenzqualität stellenweise zu gering.

2. Die im Labor gefundenen Unterschiede bezüglich Reparaturarbeit und Expression sind durch Selektionsereignisse der kodierenden Bereiche der Kandidatengene nicht erklärbar, da alle Kandidatengene in den (protein-) kodierenden Bereichen konserviert sind

3. Von allen untersuchten Genen (n=31) zeigten 7 Gene in keinem der untersuchten kodierenden und nicht-kodierenden Bereiche eine positive Selektion. Die festgestellte differenzielle Regulation lässt sich also für diese Gene auf Basis der vorliegenden Untersuchung nicht erklären

4. Alle anderen 24 differentiell regulierten Gene zeigten positive Selektion in mindestens einem der untersuchten Bereiche (14 Gene in einem der untersuchten Bereiche, 10 Gene in 2 oder mehr Bereichen)

5. Es gibt bei den nicht-kodierenden Bereichen, mit putativ regulatorischer Bedeutung unter den untersuchten Kandidatengenen eine Hierarchie:

a. den geringsten Anteil an einer möglichen Regulierung haben putative 5’-upstream-Promoterbereiche. Es gibt nur ein Gen (DNAJA3), dass in diesem Bereich positiv selektioniert ist.
b. es folgen die UTR´s mit je 5 positiv selektionierten Genen
c. die mit Abstand meisten Gene sind in den Intronbereichen positiv selektioniert.

6. Es gibt unterschiedlich strake Divergenzen benachbarter Strukturen

7. Der Vergleich intronischer Sequenzen der Kandidatengene zwischen Schimpanse und Mensch zeigt einen deutlichen Trend: 21 von 31 untersuchten Genen (= 67,7%) zeigten eine Sequenzdivergenz von über 5%. Ein Zusammenhang von kurzen bzw. langen Introns mit bestimmten Reparaturzeitpunkten konnte nicht erkannt werden.

8. Es scheint es im Rahmen des DNA-Reparaturprozesses Unterschiede auf Transkriptionsebene zu geben, die bei der Telomerenlängen-Erhaltung eine bedeutende Rolle spielen können (Regulierung von TNKS bei Pan; keine Regulierung von TNKS bei Homo).

9. Die positive Selektion im Promoterbereich von DNAJA3 könnte mit den beiden, für die Apoptose wichtigen, Splicingvarianten dieses Gens zusammenhängen

10. Es gibt neun Gene, die über die UTR-Bereiche reguliert sind. Davon sind acht in der späten Reparaturantwort (Homo: 6h; Pan: 5h) reguliert und nur eines (TOP3B) in der frühen.

Die Planungsstragtegie

1. Die Probleme bei der Auswertung der Ergebnisse sind zum Teil der Planungsstragtegie geschuldet
2. Durch eine Logframe-Planung hätten einige Probleme in der Planungs-strategie des Cisplatinexperimentes schon im Vorfeld bemerkt werden können

5. Ausblick

Das Cisplatinexperiment, dessen Intention es war durch die Untersuchung der DNA-Reparatur Unterschiede in der Tumorempfänglichkeit zwischen Homo und Pan zu erklären, konnte zeigen, dass es eine frühe und eine späte Reparaturantwort auf eine DNA-Schädigung durch Cisplatin gibt. Die spätere Antwort ist bei Pan etwa eine Stunde früher als bei Homo. Über qualitative und quantitative Eigenschaften der DNA-Schädigung können bis dato nur indirekte Aussagen gemacht werden. Dieses Manko zu beseitigen bietet sich zukünftig die GE-gekoppelte ICP-MS an, die bereits erste Ergebnisse zeigen konnte.

Um zu Aussagen über das absolute Regulierungsniveau zu kommen, müssten künftig Methoden der quantitativen Transkriptomanlayse etabliert werden.

Die Sequenzstrukturen der 31 regulierten Gene wurden bioinformatisch untersucht. Dabei wurde in kodierende (ORF) und putativ regulatorische Bereiche (Introns, 3’- u. 5’-UTR´s, putative Promoterbereiche) unterschieden.

Durch die Implementierung zusätzlicher Techniken und eine Restrukturierung der experimentellen Herangehensweise, kann das Cisplatinexperiment sicher wertvolle Ergebnisse zum DNA-Repair von Mensch und Schimpanse liefern und dadurch zu einem besseren Verständnis der unterschiedlichen Krebsempfänglichkeit beider Arten beitragen.

Die Ergebnisse für DNAJA3 (mögliche Bedeutung des putativen Promoterbereiches für das RNA-Splicing) und TNKS (Unterschiede bei der Telomerenerhaltung) weisen auf die Bedeutung einzelner Strukturen innerhalb eines Gens für unterschiedliche Regulation hin. Sie zeigen zudem, besonders im Falle von TNKS, dass eine Selektionsanalyse zukünftig von einer reinen dN/dS-Betrachtung, bzw. von der Analyse einzig und allein des ORF´s, absehen sollte.

Bei der hier angestellten Betrachtung des DNA-Repairs darf auch nicht außer Acht gelassen werden, dass die hier gefundenen Ergebnisse sich nur auf im Cisplatinexperiment differenziell exprimierte, DNA-Repair-Gene beziehen. Das bedeutet, wir wissen nicht, ob die Ergebnisse typisch für Repair-Gene sind oder allgemeine Gültigkeit besitzen. Um zu einem vollständigeren Bild zu gelangen, müssten mindestens die Strukturen einer statistisch relevanten Anzahl an Genen der wichtigsten GO-Cluster untersucht werden.

Interessant wäre es auch in Zukunft noch epigenetische Gen- Regulationsmechanismen im Cisplatinexperiment zu untersuchen, da deren Bedeutung immer stärker erkannt wird. So könnte man durch genomische und epigenomische, also quasi komplementäre, Informationen zu einem wesentlich geschlossenerem Bild über die Regulation des DNA- Repairs gelangen.

Der Logical Framework Approach kann, wie gezeigt werden konnte, erfolgreich an Fragestellungen wissenschaftlicher Projektplanung angepasst werden.

Durch die Verwendung eines solchen Planungswerkzeuges hätte das Cisplatinexperiment wahrscheinlich eine bessere Performance haben können.

Der Logical Framework Approach kann als Instrument eines künftigen wissenschaftlichen Projektes zu dessen Planung, Durchführung und Überwachung sinnvoll eingesetzt werden. Die Flexibilität dieser Methode lässt es zudem zu, dass auch im laufenden Experiment auf unvorhergesehene Variablen eingegangen werden kann.

7. Literatur

Adams, M. et.al. Drosophila BLM in double strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science 299, 265 – 270 (2003).

Allison, D. et al. Microarray data analysis: from disarray to consolidation and consensus. Nature Reviews Genetics 7, 55 – 65 (2006).

Arndt, M. Synthese und Testung von antitumoraktiven Porphyrin-Platin(II)- Komplexen. Diplomarbeit, Regensburg (1996).

Beneke, S. Chemische Karzinogenese und ihre Mechanismen. Veranstaltung Biomedizin II, Uni Konstanz (2005).

Benjamini, Y. , Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodologycal) 57, 289 – 300 (1995).

Blettner, M. cDNA-Microarrays – Strategien zur Bewältigung der Datenflut. Deutsches Ärzteblatt 102, Ausgabe 6, A356 - A360 (2005)

Brem, R. Hall, J. XRCC1 is required for DNA single-strand break repair in human cells. Nucleic Acids Research 33, 2512 - 2520 (2005).

Britten, R. J. Divergence between samples of chimpanzee and human DNA sequences is counting 5%, counting inDels. PNAS 99, no 21, 13633 – 13636 (2002).

Brüchert, W. Bettmer, J. Online coupling of gel-electrophoresis and inductively coupled plasma-sector field spectrometry for the determination of dsDNA fragments. Analytical Chemistry 77, 5072 - 5075 (2005).

Budman, J. Chu, G. Processing of DNA for nonhomologous end-joining by cell-free extract. The EMBO Journal 24, 849 – 860 (2005).

Buneß, A. Steilkurs in praktischer Mikroarray-Analyse. DKFZ Heidelberg (2006).

Campbell, M. Public Access for Teaching Genomics, Proteomics, and Bioinformatics. Cell Biol Educ 2 (2), 98 – 111 (2003).

Carninci, P. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nature Genetics 38, 626 - 635 (2006).

Castillo- Davis, C. et al. Selection for short introns in highly expressed genes. Nature Genetics 31, 415 - 418 (2002).

Cellectis Sa. Double-Strand Break Repair (2006). CELLECTIS SA, Ce 102 route de Noisy - F-93235 Romainville Cedex. http://www.cellectis.com/dsbr.html

Chamary, J. et al. Hearing silence: non-neutral evolution at synonymous sites in mammals. Nature reviews genetics 7, 98 - 108 (2006).

Chen, J. et al. A Systematic Analysis of Disease-Associated Variants in the 3’- Regulatory Regions of Human Protein Coding Genes I: General Principles and Overview. Human Genetics 120, 1 – 21 (2006).

The Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium. Initial sequence of the chimpanzee genome and comparison with the human genome; Nature 437, 69 - 87 (2005).

Clauß, G., Finze, F., Partzsch, L. Statistik für Soziologen, Pädagogen, Psychologen und Mediziner. Verlag Harri Deutsch, Frankfurt am Main (1995).

Cooper, P. K. et al. Recognition of RNA polymerase II and transcription bubbles by XPG, CSB, and TFIIH: insights for transcription-coupled repair and Cockayne Syndrome. Molecular Cell 20, 187 – 198 (2005).

Culotta, E. Chimp genome catalogs differences with humans. Science 309, no. 5740, 1468 – 1469 (2005).

Das, R. et al. Computational prediction of methylation status in human genomic sequences. PNAS 103 , no. 28 10713 – 10716 (2006).

Deutsche Stiftung für internationale Entwicklung. Introduction to the Logical Framework Approach (LFA) for GEF-financed projects (2000)

Dieterich, C. Comparative Sequence analysis and association mining in gene regulation. Dissertation, ID: 273182.0, MPI für molekulare Genetik (2004).

Edelbrock, M. et al. Recognition and binding of mismatch repair proteins at an oncogenic hot spot. BMC Molecular Biology 6 (2005).

Edwards, K. Münger, K. Depletion of physiological levels of the human TID1 protein renders cancer cell lines resistant to apoptosis mediated by multiple exogenous stimuli. Oncogene 23, 8419 – 8431 (2004).

Ellegren, H. Evolution: Natural Selection in the Evolution of humans and chimps. Current biology 15, no. 22, 919 - 922 (2005).

Fedorova, L., Fedorov, A. Puzzles of the human genome: why do we need our introns? Current Genomics 6, 589 – 595 (2005).

Friedl, A.A. DNA Doppelstrangreparatur mittels Endverknüpfung und die Entstehung strahleninduzierter Chromosomenaberrationen. Schriftenreihe Reaktorsicherheit und Strahlenschutz. Bundesministerium für Umwelt (2003).

Friedrich, R. Die Entstehung von Tumoren. Vorlesung SS 2005 (Fassung vom 14. Februar 2005). Universitätsklinikum Gießen (2005).

the Gene Ontology. http://www.geneontology.org/

Gibbs, W.W. DNA ist nicht alles. Spektrum der Wissenschaft, Dossier 1/06, 58-65 (2006)

Goldsmith Z., Dhanasekaran N. The microrevolution: applications and impacts of microarraytechnology on molecular biology and medicine (review). International journal of molecular medicine 13, 483 – 495 (2004)

Haaf, T. et al. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 92(6), 2298–2302 (1995)

Haaf, T. et al. Sequestration of Mammalian Rad51-Recombination Protein into Micronuclei. Cell Biol. 144, 11-20 (1999)

Haibe-Kains, B. Microarray Technology and Analysis, Kursunterlagen. Université Libre de Bruxelles. http://www.ulb.ac.be/di/map/bhaibeka/bioinfo_courses/microarray_tech_hkb.pdf

Hankeln, T. et al. Grundlagen und Anwendungen der Microarry-Technologie, Kursmaterial (2006).

Haplotter Guide. http://hg-wen.uchicago.edu/selection/instruction.html

Hardison, R. Comparative Genomics. PLOS Biology 2, Vol. 1, 156 - 160 (2003).

Hellmann, I. et al. Selection on human genes as revealed by comparisons to chimpanzee cDNA. Genome research 13, 831 - 837 (2003).

Hollricher, K., Adam-Radmanic, B. Special Genomanalyse. Laborjournal 11, 46 - 49 (2005).

Huberman, J. DNA- Repair Lectures. http://asajj.roswellpark.org/huberman/ DNA_Repair/DNA_Repair.htm (2006).

Huang, H. et al. DNA-DNA Interstrand Crosslinking by cis -Diamminedichlorplatinum (II). Bioorganic & Medicinal Chemistry 3, no. 6, 659 – 669 (1995).

Hurst, L. The Ka/Ks ratio: diagnosing the form of sequence evolution. Trends in genetics 18, no.9 486 - 487 (2002).

Institut für Energie und Umweltschutz IUTA e.V.; www.iuta.de/Verfahrenstechnik/Umweltmedizin/monitoring2.htm (2006).

Johnson Matthey. JMB Overview, Platin November 2004 (2004).

Khaitovich, P. et al. Parallel patterns of evolution in the genomes and transcriptomes of humans and chimpanzees. Science 309, 1850 - 1854 (2005).

Kiefel, V. HLA und Transplantation. http://www.tmed.med.uni-rostock.de/hla.pdf (2005).

Kimball, J. Kimball´s Biology Pages- DNA-Repair (2006). http://home.comcast.net/~john.kimball1/BiologyPages/D/DNArepair.html

Liu, Y., West, S. Distinct functions of BRCA1 and BRCA2 in double-strand break repair. Breast Cancer Res. 4, 9 - 13 (2002).

Kimball, J., DNA-Repair. Kimball´s biology pages.; http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNArepair.html (2006)

Lunter, G. et al. Genome-Wide Identification of Human Functional DNA Using a Neutral InDel Model. PLOS Computational Biology 1, Vol. 2, 2 – 12 (2006).

Meese, E. Gen-Expressionsanalyse mit DNA-Microarrays (DNA-Chiptechnologie), Praktikumsunterlagen. Institut Für Humangenetik, Universität des Saarlandes (2006).

Max Planck Institut für biophysikalische Chemie. Pressemitteilung, 26.01.2006. http://www.mpibpc.mpg.de/groups/pr/PR/2006/06_03/

Merten, T. Der Chemielaborant: Teil 3 Organische Chemie. Schroedel, Hannover (1985).

Mullenders, LHF. , Stary, A. , Sarasin, A. Nucleotide excision repair. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology (2005). http://AtlasGeneticsOncology.org/Deep/ExcisRepairID20014.html

National Cancer Institute. 100 Years of Advances Against Cancer - 1970s (updated: 11/30/2006) http://www.nci.nih.gov/newscenter/1970

NCBI. Science Primer. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/

Nielsen, R. Statistical tests of selective neutrality in the age of genomics. Heredity 86, 641 - 647 (2001).

Nilsen, H., Krokan, H. Base excision repair in a network of defence and tolerance. Carcinogenesis 22, no. 7, 987 - 998 (2001).

Nielsen, R. et al. A scan for positively selected genes in the genomes of humans and chimpanzees. PLOS Biology 3, Issue 6, 976 - 985 (2005).

OMIM. Bloom syndrome, #210900. National Center for Biotechnology Information (NCBI), Online Mendelian Inheritance of Man (OMIM) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=210900 (2006).

OMIM. *603303. TRF1-Interacting, Ankyrin-Realted ADP-Ribose Polymerase; TNKS

Orelli, B., Bishop, D. BRCA2 and homologous recombination. Breast Cancer Research 3, 294 - 298 (2001).

Pál, C. An integrated view of protein evolution. Nature reviews genetics 7, 337 - 348 (2006).

Passarge, E. Taschenatlas der Genetik. Thieme, Stuttgart (2004).

Pennisi, E. Cell Biology: A Possible New Partner for Telomerase. Science 20, Vol. 282 no. 5393, 1395-1397 (1998).

Pickering, B. , Willis, A. The implications of structured 5’ untranslated regions of translation and disease. Seminars in Cell and Developmental Biology 16, 39 – 47 (2005).

Puente, X. et al. Comparative analysis of cancer genes in the human and chimpanzee genomes. BMC Genomics 7:15, doi: 10.1186/1471-2164-7-15. (2006)

Rädle, J., Klotz, G. Forschungsprojekte: Diagnostik des hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinoms (HNPCC) und Mismatch Reparatur. Universitätsklinikum des Saarlandes, Innere Medizin. http://www.uniklinikum-saarland.de/de/einrichtungen/kliniken_institute/ gastroenterologie/forschung_lehre/forschung/hnpcc (2005).

Riedl, T. et al. The comings and goings of nucleotide excision repair factors on damaged DNA. The EMBO Journal 22, 5293 – 5303 (2003).

Roche Medizin 3. Urban & Schwarzenberg, München (1993).

Sakharkar, M. et al. Distributions of Exons and Introns in the human genome. In silico Biology 4, 387 - 393 (2004).

Seymiya, H. Tankyrase 1 as a target for telomere-directed molecular cancer therapeutics. Cancer Cell 7, Iss. 1, 25-37 (2005).

Shin, D. et al. Structure and function of the double-strand break repair machinery. DNA Repair 3, 863 – 873 (2004).

Smith, S. et al. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science 282: 1484-1487 (1998).

Strachan, T., Read, A. Human molecular genetics 2. Wiley´s, New York (1999).

Taudien, S. et al. Should the draft chimpanzee sequence be finished ? Trends in Genetics 22, no 3, 122 – 125 (2006).

Tresch A., Huber W. Normalization Methods, Kursunterlagen. DKFZ Heidelberg (2005).

Umweltbundesamt. Bundesblätter-Gesundheitsforschung-Gesundheitsschutz. 46, 448 - 450 (2003).

Vinogradov, A. E. “Genome Design” model: evidence from conserved intronic sequence in human-mouse comparison. Genome Research 16, 347 – 354 (2006).

Voight, B. A map of recent positive selection in the human genome. PLOS biology 4, Issue 3, 446 – 458 (2006).

Washietl S., Hofacker I.L., Stadler P.F. Fast and reliable prediction of noncoding RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 2454 – 2459 (2005).

Weis, E. Vergleich der Genexpression für kognitive Fähigkeiten und DNA-Reparatur innerhalb der Primaten mit Hilfe der Microarraytechnologie. Diplomarbeit (2004)

Zhu, L. et al. Chromosomal Mapping of the Tankyrase Gene in Human and Mouse. Genomics 57, 320 – 321 (1999).

Die vorliegende Arbeit wurde im Institut für Anthropologie der Johannes Gutenberg -Universität Mainz und im Institut für Humangenetik der Universitätsklinik der Johannes Gutenberg-Universität Mainz unter der Leitung von Prof. Dr. Hans Zischler und Prof. Dr. Thomas Haaf durchgeführt.

Betreut wurde die Arbeit von Frau Dr. Danuta Galetzka und Herrn Dr. Holger Herlyn.

Mein besonderer Dank gilt:

- Herrn Prof. Dr. Hans Zischler, der mir die Arbeit am Institut für Anthropologie ermöglicht hat
- Herrn Prof. Dr. Thomas Haaf, der mir die Arbeit am Institut für Humangenetik ermöglicht hat
- Frau Dr. Danuta Galetzka, für die gute Betreuung, die Inspiration und Ermutigung
- Herrn Dr. Holger Herlyn, der mich mit unendlicher Geduld auf dem Weg der bioinformatischen Datenverarbeitung begleitet hat
- Meiner Frau Pia und meiner Tochter Emma für ihr Verständnis für all die gestohlenen Stunden

Schriftliche Versicherung

(gemäß § 15 (5) Ordnung für die Magisterprüfung der Fachbereiche 02, 05, 07, 09 und 10 vom 11. Oktober 1999, in der jeweils gültigen Fassung)

Hiermit versichere ich, Eberhard Schneider, dass ich die Magisterhausarbeit selbstständig, ohne fremde Hilfe verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Die Stellen der Arbeit, die dem Wortlaut oder dem Sinn nach anderen Werken entnommen wurden, sind unter Angabe der Quellen der Entlehnung kenntlich gemacht. Die Arbeit ist noch nicht veröffentlicht oder in gleicher oder andere Form an irgendeiner Stelle als Prüfungsleistung vorgelegt worden.

Ort, Datum Eberhard Schneider