RNA-Interferenzen: Ablauf, Mechanismen und Resultate

RNAi-Methoden und ihre Grenzen


Seminararbeit, 2006
33 Seiten, Note: 1,0

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Entdeckung und Historie

3. RNA-Interferenzen: Ablauf, Mechanismen und Resultate
3.1. siRNA
3.2. Spezielle siRNA- und Genrepressions-Formen
3.3. miRNA (und shRNA)
3.4. Weitere sRNA-Formen

4. RNAi - Methoden und ihre Grenzen

5. Ansatzpunkte zur Therapie mit RNAi

6. Diskussion

7. Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

Anhang

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 : RNAi bei C.elegans (Mello et al. 2004 )

Abb. 2 : Eukaryoten mit RNAi (Agrawal et al. 2003)

Abb. 3 : Ablauf der RNA-Interferenz (sitsom.tripod.com/enlarge.html)

Abb. 4 : Domain-Organisation von RNAi-Faktoren (Kim 2005)

Abb. 5: Untereinheiten des Dicer (www.sciencedaily.com/releases/2006/01/060114151229.htm)

Abb. 6: Untereinheiten des Argonaute (www.bioon.com/biology/advance/biostructure/200409/78181.html)

Abb. 7 : mögliche Wege der siRNA –Prozessierung (www.scar.utoronto.ca/~riggs/BGYD23/CELL107-415.pdf)

Abb. 8: Wege der Genrepression (Kim 2005)

Abb. 9 : shRNA –Prozessierung (Mello et al. 2004)

Abb. 10 : shRNA –Prozessierung (Kim 2005)

Abb. 11: In vivo Demonstration von RNAi-Therapieerfolgen bei Nagern (Shankar et al. 2005)

1. Einleitung

RNA-Interferenz ist, in den 80er Jahren völlig unerwartet entdeckt, ein recht junges Gebiet der Wissenschaft, dem aber zunehmend große Bedeutung beigemessen wird. Sie wurde in den letzten Jahren nicht nur in Pflanzen, sondern auch in vielen Tieren und sogar menschlichen Zellen beobachtet. RNAi spielt eine entscheidende Rolle in der Regulation der Genexpression und dient darüber hinaus vor allem dem Schutz der Zelle vor viralen Angriffen und schädigenden Gen-Modifikationen. (www.hhmi.org/biointeractive/rna/rnai/index.html)

RNAi ermöglicht es gezielt bestimmte Gene auszuschalten. Die Entdeckung dieses Mechanismus eröffnet ein weites Feld für die Gen-Entschlüsselung und vor allem die Behandlung einer großen Zahl von Krankheiten. Insbesondere stehen im Focus der Forschung virale und entzündliche Krankheiten sowie Krebs. Das RNAi zugesprochene Potenzial weckt großes Interesse sowohl in akademischen als auch industriellen Kreisen. Es bestehen bereits große Firmen und Datenbanken, die das Leistungsvermögen der RNAi archivieren und erforschen. Daher wird wohl auch in der nächsten Zeit mit weiteren spannende Ergebnissen in diesen Bereichen zu rechnen sein.

In dieser Arbeit soll ein Einblick gegeben werden in den aktuellen Stand der RNAi-Forschung und die Möglichkeiten, die sich dadurch eröffnen, speziell in Hinblick auf Therapieformen des Menschen.

Um Forschung und Resultate in ihrem Kontext besser einordnen zu können wird im zweiten Kapitel ein kurzer Einblick in die Historie und Entdeckung der RNAi gegeben.

Im Weiteren werden in Kapitel 3 Ablauf und Mechanismen der RNAi erklärt und die unterschiedlichen, beteiligten RNA-Arten, wie siRNA und miRNA aufgeschlüsselt.

In Kapitel 4 wird auf die Methodik und Handhabung der RNAi in der Praxis eingegangen. Problematiken und Lösungsansätze werden kurz angesprochen und führen weiter in die erfolgreiche Anwendung.

Die Therapie ist Thema des fünften Kapitels. Hier werden exemplarisch einige Therapieerfolge in wichtigen Bereichen, wie Virusbekämpfung, vorgestellt um eine Bild von den aktuellen und evt. zukünftigen Möglichkeiten zu geben.

Die Diskussion im sechsten Kapitel setzt sich kritisch mit der Beurteilung der RNAi auseinander und betrachtet ihr Potenzial.

Abschließend gibt Kapitel 7 eine kurze Bestandsaufnahme des Bisherigen und beschließt diese Arbeit.

2. Entdeckung und Historie

1986 versuchte eine Forschergruppe um den Biologen Richard Jorgensen Petunien mit besonders kräftig dunkel-violetten Petalen zu züchten (Napoli et al. 1990). Hierzu fügten sie Gene für ein pigment-steigerndes Enzym (Chimeric Chalcone Synthase Gene) in das Pflanzengenom ein. Für die Forscher sehr überraschend wuchs den behandelten Pflanzen statt der dunkel-violetten eine Blüte, die ganz oder bereichsweise gar kein Pigment besaß. Um diesem scheinbaren Widerspruch auf den Grund zu gehen, maßen die Forscher die Menge an enzymkodierender mRNA in der Zelle und fanden sie stark erniedrigt im Vergleich mit der schwach-violetten Ausgangspflanze. Sowohl die endo- als auch die transgenen mRNAs wurden also vermindert, wie in Versuchen mit isolierten Zellkernen unterstützend gezeigt werden konnte (Van Blokland et al. 1994).

Die darauf folgende schrittweise Entschlüsselung der RNA-Interferenz führte zu unterschiedlicher Benennung desselben Mechanismus. In Pflanzen etablierte sich neben der von Napoli verwendeten Bezeichnung „Co-Suppression“ auch das „posttranskriptionale Gene Silencing“ (PTGS) (Ingelbrecht et al. 1994). Während diese Vorgänge in Pilzen, z.B. beobachtet in Neurospora crassa (Cogoni et al. 1996), „quelling“ genannt wurden. Der Begriff der RNAi, der im Tierreich aber auch für den Menschen gebraucht wird, wurde vor allem durch Fire und Mitarbeiter geprägt (Fire et al. 1998). Diese Forschergruppe zeigte als eine der ersten in Caenorhabditis elegans, dass dsRNA als Auslöser für Gensilencing fungieren kann (S. Abb. 1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Eine weitere wichtige Einsicht in den Mechanismus der RNAi gelang 1999 Hamilton und Baulcombe, die das Produkt des RNA-Abbaus als 25nt langes dsRNA-Stück identifizierten (Hamilton und Baulcombe 1999). Unabhängig davon zeigten Elbashir et al., dass 21-23 nt lange synthetische RNA den Abbau homologer mRNA auch in Säugern auslösen kann. (Elbashir et al. 2001).

In vielen folgenden Versuchen, z.B. mit Drosophila (Yang et al. 2000; Hammond et al. 2000), wurde inzwischen die Ubiquität der Interferenz-Mechanismen in der belebten Natur gezeigt (S. Abb.2):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2 : Eukaryoten mit RNAi (AGRAWAL et al. 2003)

3. RNA-Interferenzen: Ablauf, Mechanismen und Resultate

RNA-Interferenz bezeichnet das sequenzspezifische Stilllegen der Genexpression, welche durch dsRNA ausgelöst wird. Aus dieser dsRNA geschnittene ssRNA-Fragmente dürfen eine bestimmte Länge von ca. 20 - 30 bp nicht überschreiten weswegen sie auch smallRNA (sRNA) genannt werden. Hauptsächlich zählen hierzu die small interfering RNA (siRNA) mit ihren Untergruppen sowie die micro RNA (miRNA). Die siRNA wird aus langer, endogener oder exogener ds-RNA geschnitten, während miRNA aus hairpin-Vorstufen gebildet wird. Außerdem wurden in den letzten Jahren weitere sRNA-Spezies gefunden, die jedoch bis dato noch nicht genügend bekannt sind um sie zu klassifizieren.

Das Hemmen der Genexpression kann auf vielfältige Weise ablaufen. Nicht nur die Wege dahin sind mit den unterschiedlichen sRNA-Formen verschieden. Je nach Umgebungsbedingungen wird die Genexpression auch auf unterschiedliche Weise verhindert. Bis lang geht man von mindestens vier verschiedenen Mechanismen aus:

1. mRNA-Schnitt (und Abbau)
2. Translations-Repression
3. Transkriptions-Repression durch DNA-Modifizierung
4. Transkriptions-Repression durch DNA-Eliminierung

Außerdem beschränken sich RNAi-Signale nicht nur auf die betreffende Zelle sondern können sowohl horizontal wie vertikal weitergegeben werden. D.h. sowohl zwischen Zellen untereinander als auch durch die Keimbahn können Silencing-Signale übertragen werden (Fire et al. 1998).

Die RNA-Formen und Modelle von denen momentan ausgegangen wird, sollen im Folgenden vorgestellt werden.

3.1. siRNA

SiRNA entsteht aus dsRNA, die entweder als Fremd-RNA eingebracht oder direkt in der Zelle gebildet wird.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3 : Ablauf der RNA-Interferenz (sitsom.tripod.com/enlarge.html)

Sie muss homolog zur zu hemmenden Zielsequenz sein um im Weiteren die Genexpression hemmen zu können.

An die lange dsRNA dockt die RNA-spezifische Endonuklease Dicer mit der PAZ-Untereinheit an. Das Dicer-Enzym besteht aus hauptsächlich aus vier Domänen: einer aminoterminalen Helicase-Domäne, zwei RNAse III-Motiven, einer dsRNA-bindenden Domäne, sowie einer PAZ-Domäne (Agrawal et al. 2003, Kim 2005). Außerdem werden Metallionen (Mn bzw. Mg, lila in Abb. 6C) katalytische Eigenschaften zu geschrieben (Blaszczyk et al. 2001).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3 : Ablauf der RNA-Interferenz (sitsom.tripod.com/enlarge.html)

Dicer ist wie eine Doppel-Axt geformt (S. Abb. 5): die beiden RNA-bindenden Module formen die Schneiden, während die mRNA den Griff und PAZ das Griffende bilden. (http://pubs.acs.org/cen/news/84/i03/8403notw1.html). Der Abstand zwischen PAZ und RNase III-Domäne beträgt ca. 25 bp, die Länge die auch die Dicer-Produkte haben. Demnach geht man davon aus, dass die Länge der siRNA von der Länge des „Axt-Griffes“ abhängt.

Die RNase III-Domäne des Dicer spaltet unter ATP-Verbrauch die dsRNA 20 – 25 bp lange Moleküle mit je zwei Nukleotiden Überhang in 3’ Richtung und 5’Phosphat bzw. 3’Hydroxyl-Ende (Elbashir et al. 2001). Diese kurzen aus der ursprünglichen RNA rausgeschnittenen Stücke werden als siRNA bezeichnet. Die ATP-bindende Domäne ist nicht in allen Lebewesen mit Dicer assoziiert, beispielsweise aber bei Drosophila (Agrawal et al. 2003). Dementsprechend gibt es in der Natur mehrere Dicer-Homologa (Kim 2005).

An den Nukleotid-Überhang der geschnittenen dsRNA-Stücke, an den zuvor bereits die PAZ-Untereinheit des Dicer gebunden hat, dockt mit dem 3’-Ende nun auch die PAZ-Untereinheit eines Proteins der Argonauten-Famile, hier bezeichnet als Ago. Hinzu kommen noch weitere Proteine, die zusammen mit Ago den RNA-induced silencing complex (RISC) bilden (Hammond et al. 2001).

[...]

Ende der Leseprobe aus 33 Seiten

Details

Titel
RNA-Interferenzen: Ablauf, Mechanismen und Resultate
Untertitel
RNAi-Methoden und ihre Grenzen
Hochschule
Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn  (Abteilung Biochemie des Instituts für Tierwissenschaften)
Note
1,0
Autor
Jahr
2006
Seiten
33
Katalognummer
V151891
ISBN (eBook)
9783640638208
ISBN (Buch)
9783640638192
Dateigröße
2107 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
siRNA, miRNA, sRNA, shRNA, RISC, DICER, splicing, Therapie, Genexpression
Arbeit zitieren
Anne Pytlik (Autor), 2006, RNA-Interferenzen: Ablauf, Mechanismen und Resultate, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/151891

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