2‘-Desoxyisoguanosin: Synthese, Desoxygenierung und Einbau in Oligonucleotide

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Problemstellung

3. Darstellung von 2'-Desoxyisoguanosin (1) und Derivaten
3.1. Bisherige Syntheseverfahren für 2'-Desoxyisoguanosin (1)
3.2. Eine zweistufige Synthese von 2'-Desoxyisoguanosin (1) ausgehend von 2'-Desoxyguanosin (3)
3.3. Darstellung von N6-Etheno-2'-desoxyisoguanosin (9)
3.4. Spektroskopische Untersuchungen an den 2'-Desoxynucleosiden
3.4.1. 13C-NMR Daten
3.4.2. Stabilität der N-glycosylischen Bindung von 2'-Desoxyisoguanosin (1) und seinen Derivaten

4. Darstellung von 2',3'-Didesoxyisoguanosin (2)
4.1. Desoxygenierung von 2-Chloradenosin oder 2-Chlor-2'-desoxyadenosin
4.2. Darstellung von 2-Chlor-2’,3'-didesoxyadenosin (20) durch Glycosylierung von 2,6-Dichlorpurin (23) mit 5-0-(1,1-dimethylethyl)-dimethylsilyl)-2,3- didesoxy-D-glycero-pentofuranose (21 )
4.3. Photochemische Umwandlung von 2-Chlor-2',3'-didesoxyadenosin (20) in 2',3'-Didesoxyisoguanosin (2)
4.4. Spektroskopische Untersuchungen an den 2',3'-Didesoxynucleosiden
4.4.1. 13C-NMR Daten
4.4.2. Desaminierung von 2’,3'-Didesoxyisoguanosin (2) und 2’-Desoxyisoguanosin (1) mit Adenosindesaminase

5. Synthese von d(iG-C)3 (32)
5.1. Schützgruppenstrategie und Synthese des 3'-Phosphonates
5.2. Festphasensynthese von d(iG-C)ß (32)
5.3. Eigenschaften von d(iG-C)3 (32)

6. Zusammenfassung

7. Experimenteller Teil

8. Abkürzungen und Nomenklatur

9. Literaturverzeichnis

1. Einleitung

2'-Desoxyisoguanosin (1) wurde kürzlich synthetisiert¹ und über sein Phosphonat mit Hilfe der Festphasensynthese in Oligonucleotide eingebaut². Die erste enzymatische Inkorporation von iG_dTP am DNA-Templat durch das Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I erfolgte gegenüber von dT und iC_d³. Diese Reaktion wurde auch an kürzeren Oligonucleotid-Templaten studiert und mit Hilfe der HPLC verfolgt⁴.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Beim iG_d (1) sind im Vergleich zum dG (3) die Oxo- und Aminogruppe miteinander vertauscht. Beide Nucleoside können mit dC über drei Wasserstoffbrücken basenpaaren. Durch die Inversion des Donor-Akzeptor-Musters sind die glyconischen Reste im iG_d-dC- Basenpaar zueinander gegenständig orientiert, woraus sich zwangsläufig eine parallele ' Anordnung der Stränge im Duplex ergibt.

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Die parallele Anordnung von Einzelsträngen wurde 1986 von Pattabiraman ⁵ für den Duplex (dA₆)°(dT₆) postuliert. Experimentell wurden parallele Duplexe von Jovin ⁶ an speziellen Sequenzen realisiert. Die Helix-Parameter wie Ganghöhe, Roll- und Tiltwinkel des parallelen und antiparallelen Duplexes sind weitgehend identisch. Sowohl ein paralleler wie auch ein antiparalleler DNA-Doppelstrang sollten bei der Basenpaarung von iG_d (1) möglich sein, denn es kann sowohl eine Watson-Crick- wie auch eine reverse Watson- Crick-Basenpaarung mit dT eingehen.

Durch DNA-Polymerasen und unter Verwendung eines Primers konnte der templatabhängige antiparallele Einbau von iG^TP nachgewiesen werden³. Interessant wäre in diesem Zusammenhang, ob das Triphosphat von 2',3'-Didesoxyisoguanosin (2) bei dieser polymerasekatalysierten DNA-Kettenverlängerung gegenüber von dT terminiert oder durch Falschbasenpaarung Kettenabbrüche an anderen Stellen hervorruft.

2. Problemstellung

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zunächst, eine kurze Synthese für 2’-Desoxyisoguanosin (1) zu entwickeln. Da die bisher beschriebenen Verfahren vielstufig sind und Glycosylierungen von heterocyclischen Basen erfordern, soll diese dadurch verkürzt werden, daß ein natürlicher DNA-Baustein als Ausgangssubstanz herangezogen wird.

Anschließend sollen Derivate von 2'-Desoxyisoguanosin (1) dargestellt werden; z.B. das Ethenoderivat 9, von dem erwartet wird, daß es wie das Ethenoadenosin (6) Fluoreszenz zeigt. Schließlich soll 2'-Desoxyisoguanosin (1) in sein 2',3'-Didesoxynucleosid überführt werden. Die 2',3'-Didesoxynucleoside der herkömmlichen DNA-Bausteine eigenen sich in Form ihrer Triphosphate als Terminatoren bei der enzymkatalysierten DNA-Synthese. Sie werden deshalb in der Sanger-Sequenzierung eingesetzt. Auch besitzen sie antivirale Eigenschaften speziell gegenüber Retroviren. Da unbekannt ist, wie sich 2',3 Didesoxyisoguanosin (2) in derartigen Systemen verhält, ist seine Synthese Gegenstand dieser Arbeit.

Kürzlich wurde der 2'-Desoxyisoguanosin-Phosphonatbaustein 30 synthetisiert und mit ihm durch Festphasensynthese selbstkomplementäre Oligonucleotide, die iGj und dT enthalten, dargestellt. Diese Untersuchungen sollen auf andere Oligonucleotide übertragen werden, die iGd und dC enthalten. In diesem Zusammenhang bleibt auch zu klären, ob entsprechende selbstkomplementäre Stränge basenpaaren, und wie stabil dann ein paralleler Duplex von d(iG-C>3 im Vergleich zu dem von d(G-C)3 ist.

3. Darstellung von 2'-Desoxyisoguanosin (1) und Derivaten

3.1. Bisherige Syntheseverfahren für 2'-Desoxyisoguanosin (1)

Für die Darstellung von 2'-Desoxyisoguanosin (1) sind bereits zwei Synthesewege bekannt¹. Die Glycosylierung von 5-Amino-4-cyano-imidazol mit 2-Desoxy-3,5-di-0-(p-toluoyl)- a-D-erythro-pentofuranosylchlorid³⁰ führt in 21 % Ausbeute zum N-l und in 45 % Ausbeute zum N-3-Nucleosid. Anschließende Reaktion mit Benzoylisocyanat und Ringschluß mit NH3 ergibt 1 (43 %) und das N-7-Regioisomer (63 %).

Dieser Syntheseweg führt zwar zu iG<¿ (1), jedoch nur in der Nebenreaktion.

Ebenfalls kann 1 durch Photosubstitution des 2-Substituenten von 2-Chlor-2'-desoxy - adenosin (16) in 52 % Ausbeute erhalten werden. Allerdings muß das Edukt 16 erst in einer mehrstufigen Synthese gewonnen werden. Die UV-Eigenabsorption der Komponenten verhindert zudem eine Reaktion in konzentrierter Lösung, was einer Darstellung im größeren Maßstab abträglich ist.

3.2. Eine zweistufige Synthese von 2'-Desoxyisoguanosin (1) ausgehend von 2'-Desoxyguanosin (3)

2'-Desoxyguanosin (3) kann auf verschiedenen Wegen in 2-Amino-2'-desoxyadenosin (5) umgewandelt werden, welches eine direkte Ausgangssubstanz für iG^ (1) darstellt. Das Adenosinderivat 5 wurde in der DNA eines Cyanophagen gefunden⁷ und bereits auf verschiedenen Wegen dargestellt:

1. Durch Glycosylierung von 6-Chlor-2-(acetylamino)-purin mit einer Halogenose⁸.
2. Durch Reaktion von 2'-Desoxyguanosin (3) mit Trifluoressigsäureanhydrid und Pyridin über ein 6-Pyridyl-Derivat; dieses wird mit NH3 in 6-Stellung nucleophil substituiert⁹. Diese Methoden lieferten schlechte Ausbeuten. Von Vorbrüggen¹⁰ wurde ein anderer Weg für Darstellung von 2-Aminoadenosin beschritten, der später von Robins¹¹ abgeändert wurde. Diese Methode wurde am labileren 2’-Desoxyguanosin (3) bisher noch nicht angewandt.

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2'-Desoxyguanosin (3) wurde zunächst mit einem Überschuß von Hexamethyldisilazan (HMDS) und Trimethylchlorsilan unterer Rückfluß persilyliert. Erst durch wiederholte Silylierung konnte ein vollständiger Umsatz erzielt werden. Das persilylierte Zwischenprodukt 4 wurde in Toluol/HMDS gelöst und mit Tris(trimethyl)silyltriflat versetzt.

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Nach Aufpressen von NH3 wurde in einem Autoklaven 48 h bei 145°C erhitzt. Die Substitution wird durch eine Lewissäure katalysiert. Danach erfolgt die Transsilylierung durch mehrstündiges Kochen in MeOH/H20. Einengen und Auskristallisieren ergab 2- Amino-2'-desoxyadenosin (5) als farblosen Feststoff in 71 % Ausbeute.

Die NMR- und UV-Daten von Verbindung 5 waren mit den Literaturangaben identisch ⁹. Einstrahlen auf Н-ľ ergab einen NOE von 1.2 % auf H-4', wodurch die ß-Konfiguration bewiesen wurde. Darüberhinaus wurde ein zusätzlicher NOE von 6.6 % auf dem cis- ständige H(ct) -2' beobachtet. Bei Sättigung von H-8 resultierte ein NOE von 2.5 % auf dem H(ß)-2'. Dies machte eine Zuordnung der beiden Protonen der 2'-Methylengruppe im ^H-NMR möglich.

Durch Diazotierung und Verkochung bei 50 °C wurde selektiv die 2-Aminogruppe von Verbindung 5 ausgetauscht. Die 6-Aminogruppe ist gegen den Angriff von salpetriger Säure inert, dies entspricht Befunden, die bereits 1951 von Davoll¹² gemacht wurden.

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Nach Abtrennen der Salze wurde 2’-Desoxyisoguanosin (1) in 59 % Ausbeute erhalten. Das über diesen Syntheseweg erhaltene 2'-Desoxyisoguanosin (1) zeigte identische NMR- und UV-Daten wie eine authentische Probe, die über die Photoreaktion von 2-Chlor-2'- desoxyadenosin (16) dargestellt wurde¹.

3.3. Darstellung von Nß-Etheno-2'-desoxyisoguanosin (9)

Tricyclische Nucleoside entstehen durch Reaktion der exocyclischen Aminogruppe der Basen mit Halogenaldehyden.

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N^-Ethenoadenosin (6) ist wegen seiner Fluoreszenz in biochemischen Reaktionen von Interesse¹³ ; es kann jedoch keine Watson-Crick-Basenpaarung eingehen¹⁴. Während Adenosin nur ein Ethenoderivat bilden kann, sind beim Guanosin zwei Isomere möglich. Guanosin reagiert mit Bromacetaldehyd¹⁵ exklusiv zum linearen l,N2-Ethenoguanosin (7a). Das anguläre N2-3-Ethenoguanosin (8a) ist aus O-6-alkylierten Guanosin-Derivaten zugänglich.

Prinzipiell ist dieser Weg auch für das anguläre Isomer 8b aus O-6-Alkyl- 2’- desoxyguanosin anwendbar, jedoch ist die Synthese von 8b wegen der geringen Stabilität von N-3 substituierten Purin-2'-desoxynucleosiden erschwert. Deshalb wurde 8b durch Barton-Desoxygenierung aus seinem Ribonucleosid dargestellt¹⁶.

Bei der Reaktion von 2'-Desoxyisoguanosin (1) mit Chloracetaldehyd kann wie beim Adenosin nur ein Ethenoisomer entstehen. Dieses kann wie 8b ein Basenpaar ausbilden.

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Durch Reaktion von 1 mit Chloracetaldehyd konnte N^-Etheno-2'-desoxyisoguanosin (9) in 39 % Ausbeute erhalten werden. Die Substanz weist im Vergleich zur Ausgangsverbindung zwei zusätzliche Protonen bei 7.90 und 7.48 ppm auf, zwischen denen keine Kopplung sichtbar ist. Die l^C-NMR-Signale sind sehr breit und zum Teil nicht nachweisbar.

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Wellenlänge [nm]

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Abb. 1: Anregungs- und Emissionsspektren von 9 in H2O

Bis auf die linearen isomere 7a und 7b zeigen alle abgebildeten Etheno-Derivate Fluoreszenz. Bei Verbindung 9 stimmt das Anregungsmaximum von 300 nm mit dem Absorptionsmaximum im UV-Spektrum überein. Die Emission von 9 erfolgt bei 420 nm. Die Lage des Emissionsmaximums von 9 ist mit dem des Ethenoadenosins (6) identisch¹⁷.

3.4. Spektroskopische Untersuchungen an den 2'-Desoxynucleosiden

3.4.1. 13C-NMR Daten

Die Zuordnung der 13C-NMR-Resonanzen erfolgte durch protonengekoppelte 13C-NMR- Spektren. Beim 2'-Desoxyisoguanosin (1) ist die Zuordnung für C-2, C-6 und C-4 tentativ. Ferner ist in DMSO das C-4 Signal nicht sichtbar¹. Hingegen erscheint C-4 bei den am Glycon substituierten Derivaten 11 und 27. Die Zuordnung der Chromophorsignale von 2- Amino-2'-desoxyadenosin (5) wurde vom Ribonucleosid übernommen¹¹.

Tab. 1: 13C-NMR-Verschiebung von 2-substituierten 6-Amino-purin-2'-desoxynucleosiden in [D6]DMSO bei 25°C; 8-Werte bezogen auf TMS.

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a) tentative Zuordnung b) zugeordnet durch 1H/13C-gekoppelte Spektren c) nicht sichtbar d) überlagert von DMSO

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Durch Silylierung von 1 wurde Verbindung 10 erhalten. Mit den 5’-silylierten Derivaten von Nucleosiden läßt sich das Basenpaarungsverhalten mittels NMR-Spektoskopie untersuchen¹⁹.

3.4.2. Stabilität der N-glycosylischen Bindung von 2'-Desoxyisoguanosin (1) und seinen Derivaten

In der Literatur ist belegt, daß die Stabilität der N-glycosylischen Bindung von ß-D- Ribonucleosiden über 2'-Desoxy-ß-D-ribonucleosiden zu den 2',3'-Didesoxy-ß-D- ribonucleosiden abnimmt²⁰. Die Hydrolyse kann entweder UV-spektrophotometrisch oder mittels HPLC verfolgt werden. Im folgenden wurde die Stabilität der dargestellten 2'- Desoxy- und 2',3'-Didesoxynucleoside in Salzsäure zunächst UV-spektroskopisch bestimmt.

Tab. 2: UV-spektroskopisch ermittelte Halbwertszeiten [min] von 2'-Desoxynucleosiden und 2',3'- Didesoxynucleosiden in Salzsäure bei 25 °C a) 236 nm b) 264 nm

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Wie zu erwarten, sind die 2'-Desoxynucleoside stabiler als die 2’,3'-Didesoxynucleoside. 2',3'-Didesoxyisoguanosin (2) ist in 0.1 M HCl deutlich labiler als ddG. Auch 2'- Desoxyisoguanosin (1) besitzt in 0.5 M Salzsäure eine um den Faktor 10 geringere Stabilität als 2'-Desoxyguanosin (3). Nachfolgend wurde die Stabilität von 1 im Vergleich zu 3 in 0.1 M HCl durch HPLC-Analyse bestimmt.

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Retentionszeit [min]

Abb. 2: HPLC-Profile von (a) ¡G^ (1) und dG (3) (b) nach 20 min in 0.1 M Salzsäure bei 253C (c) Mischung aus Isoguanin und Guanin. (Gradient IV, Flußrate 0.6 ml/min, 6 x 250 mm RP-18 LiChrosorb-Säule).

Nach 20 min Behandlung in 0.1 M Salzsäure waren beide Nucleoside teilweise hydrolysiert (Abb 2b). Hierbei depurimene iGj (1) schneller als dG (3). Bei dem zusätzlich gebildeten Produkt (Retentionszeit 6 min), handelte es sich um Isoguanin (isoGua) und Guanin (Gua), wie durch Abb. 2c belegt wird. Durch Integration der Peakflächen der HPLC- Chromatogramme, von denen hier nur Abb. 2b gezeigt wird, ließ sich eine Halbwertszeit für 2'-Desoxyisoguanosin (1) von 7.5 min bestimmen. Hierdurch konnte die Halbwertszeit der UV-spektrophotometrisch verfolgten Hydrolyse (Tab. 2) verifiziert werden. In früheren Messungen war iGj (1) stabiler als dG (3), was hiermit korrigiert werden muß.

4. Darstellung von 2,,3'-Didesoxyisoguanosin (2)

2'-Desoxyisoguanosin (1) aggregiert in Wasser und bildet Gele. In aprotischen Solvenzen zeigt es nur eine geringe Löslichkeit. Deshalb ist es günstig, bei der Darstellung von 2',3'- Didesoxyisoguanosin (2) so zu verfahren, daß man erst das 2‘,3'-Didesoxynucleosid einer Vorstufe darstellt, die eine unproblematisch zu handhabende Base enthält, die dann direkt in 2',3'-Didesoxyisoguanosin (2) umgewandelt werden kann.

Ein 2-Halogensubstituent läßt sich in 6-Aminopurinnucleosiden durch nucleophile Photosubstitution austauschen; wird die Reaktion in Wasser durchgeführt, so sind Isoguanosinderivate zugänglich^{1 23}. Als Ausgangssubstanz für die Darstellung von 2',3'-Didesoxyisoguanosin (2) wurde deshalb 2-Chlor-2',3'-didesoxyadenosin (20) gewählt. Zwei Synthesewege wurden zu seiner Darstellung beschritten:

1. Die Barton-Desoxygenierung ausgehend von 2-Chlor-2'-desoxyadenosin (16)

2. Die Glycosylierung von 2,6-Dichlorpurin (23) mit dem Didesoxyzucker 21, gefolgt von selektiver Substitution des 6-Chlorsubstituenten durch NH2.

4.1. Desoxygenierung von 2-Chloradenosin oder 2-Chlor-2'- desoxyadenosin (16)

Zur Darstellung von 2',3'-Didesoxynucleosiden kann sowohl von 2’-Desoxynucleosiden als auch von Ribonucleosiden ausgegangen werden. Rosowsky et al.²⁴ haben das cyclische Thiocarbonat von 2-Chloradenosin (11) im Sinne der Corey-Winter-Reaktion mit 1,3- Dimethyl-2-phenyl-l,3,2-diazaphospholidin²⁵ zu 2-Chlor-2',3'- didesoxydidehydroadenosin 12 umgesetzt. Hingegen führte die Reaktion von 11 mit BU3S11H nach Barton und Subramanian²⁶ zu den beiden Desoxynucleosiden 13 und 14 sowie dem methylenverbrückten Derivat 15.

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Das Gemisch der Desoxynucleoside 13 und 14 wurde erneut mit BU3S11H desoxygeniert und nach Detritylierung 2-Chlor-2’,3’-didesoxyadenosin (20) erhalten. Dieses ist jedoch auf diesem Weg schlecht zugänglich und wurde auch nur unzulänglich charakterisiert.

Zuerst sollte 20 durch Barton-Desoxygenierung²⁷ von 2-Chlor-2'-desoxyadenosin (16)²⁸ dargestellt werden. Letzteres wurde nach Kazimierczuk et al.²⁹ aus 2,6- Dichlorpurin (23) und 2-Desoxy-3,5-di-0-(p-toluoyl)-a-D-erythro-pentofuranosylchlorid³⁰ synthetisiert. Austausch des 6-Chlorsubstituenten durch NH2 führte nach Detoluoylierung zu 16 und seinem N-7-Regioisomer. Dieses wurde anschließend in Pyridin silyliert. Allerdings wurde das Reaktionsprodukt 17 beim Eindampfen durch Pyridiniumchlorid nahezu vollständig depuriniert. Neutralisiert man hingegen zuerst mit einer wäßr. NaHC03-Lösung und extrahiert das Produkt mit Dichlormethan, so konnte 17 in 83 % Ausbeute erhalten werden. Letzteres wurde durch Acylierung mit Phenoxythiocarbonylchlorid³¹ in Gegenwart von N,N-Dimethyl-4-aminopyridin als Base in den Thiokohlensäurediester 18 überführt. Dieser wurde mit BU3S11H in Toluol unter Zusatz von AIBN desoxygeniert, wodurch 19 in 63 % Ausbeute entstand.

[...]

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