Assemblierung von F1-Untereinheiten der Escherichia coli ATP-Synthase im Cytoplasma


Diplomarbeit, 2011
92 Seiten, Note: 2

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Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1. Aufbau der ATP-Synthase
1.2. Die Untereinheiten der FoF1-ATP-Synthase
1.3. Die Assemblierung der ATP-Synthase
1.4. Zielsetzung der Arbeit

2 Material und Methoden
2.1. Stämme, Plasmide und Primer
2.2. Medien und Anzuchtsbedingungen
2.2.1. Zellanzucht in Luria Bertani-Vollmedium
2.2.2. Zellanzucht in TYPGN-Medium
2.2.3. Zellanzucht in Tanaka Minimalmedium
2.2.4. Fermentation
2.2.5. Präparation von Dauerkulturen
2.2.6. Komplementationstest
2.3. Molekularbiologische Methoden
2.3.1. Polymerase-Kettenreaktion
2.3.2. Konstruktion neuer Plasmide
2.3.3. Präparation von Plasmid-DNA
2.3.4. Restriktion von Plasmid-DNA
2.3.5. Agarose-Gelelektrophorese
2.3.6. Gel-Extraktion
2.3.7. Ligation
2.3.8. Herstellung kompetenter Zellen mittels CaCl2,
2.3.9. Transformation durch Hitzeschock
2.3.10. Elektrokompetente Zellen
2.3.11. Transformation durch Elektroporation
2.3.12. Konstruktion der Deletionsmutante DP2
2.3.13. Konstruktion der „knock-out“ Mutante DP1
2.4. Biochemische Methoden
2.4.1. Präparative Methoden
2.4.1.1. Präparation von invertierten Membranvesikeln und der Cytoplasma- Fraktion
2.4.1.2. Präparation von F1-freien Membranvesikeln
2.4.1.3. Präparation von Wildtyp-F1 aus SK1/pBWU13
2.4.1.4. Ablösung der F1-Komplexe von DK8/pBH7.1-Membranvesikeln
2.4.1.5. Reinigung von F1-Komplexen mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie.
2.4.1.6. Reinigung von δ und ε mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie
2.4.1.7. Rückbindung von F1 an F1-freie Membranvesikel
2.4.2. Analytische Methoden
2.4.2.1. BCA-Proteinbestimmung
2.4.2.2. ATPase-Aktivitätsmessung
2.4.2.3. ATPase-getriebene Protonentranslokation durch ACMA-Fluoreszenz
2.4.2.4. SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese
2.4.2.5. C oomassie-Färbung
2.4.2.6. Immunoblotanalyse
2.4.2.7. Analyse von Proteinen durch Massenspektrometrie

3 Ergebnisse
3.1. Charakterisierung der c -defizienten Mutanten
3.1.1. Funktionelle Charakterisierung der Mutante DK8/pBWU13.∆c-His
3.1.2. “Knock-out“ der F1-Untereinheit c
3.1.3. Funktionelle Charakterisierung der Mutante DP1
3.1.4. Rückbindung der aus dem Cytoplasma gereinigten F1-Komplexe an F1-freie Membran
3.1.5. Präparation von Wildtyp-F1
3.2. Untersuchungen zur Defizienz von δ
3.2.1. Ablösung des F1-Komplexes von DK8/pBH7.1
3.2.2. Expressionssteigerung von δ
3.2.2.1. Konstruktion von pCDFduet-atpH
3.2.2.2. Ermittlung der erforderlichen IPTG-Konzentration
3.3. Reinigen der Untereinheiten δ und ε
3.3.1. Reinigung von δ
3.3.2. Reinigung von ε

4 Diskussion
4.1. Charakterisierung der c -defizienten Mutanten
4.2. Untersuchungen zur Defizienz von δ

5 Zusammenfassung

6 Literaturverzeichnis

Jeder sieht im anderen nur so viel, als er selbst auch ist.

Arthur Schopenhauer

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei all jenen Menschen bedanken, die mir diese Arbeit ermöglicht haben und mir mit Rat und Tat zur Seite standen. Daher gilt zunächst großer Dank Dr. Gabriele Deckers-Hebestreit für die Ermöglichung dieser Arbeit, für die überaus gute Betreuung und die anregenden Gespräche. Besonderer Dank gebührt Brigitte Herkenhoff, die jedem und jederzeit hilfsbereit sowie unterstützend zur Seite stand und immer wieder ein nettes Wort übrig hatte. Des Weiteren möchte mich für das gute Arbeitsklima in der Arbeitsgruppe bedanken, im Speziellen bei Diana, die mir viel Freude bereitet hat.

Ich möchte diese Arbeit meinem im April verstorbenen Vater widmen, meiner Mama und meinem Bruder Adel. Auch meine biologischen Eltern möchte ich an dieser Stelle erwähnen, die niemals vergessen sind. Ich danke meinem Freund Sascha für all das Gute was er in mein Leben bringt und meinen Mädels Nadine, Kathrin und Melanie, weil ich mich immer auf sie verlassen kann. Auf jeden Fall möchte ich noch Lars sehr danken, dass er in meiner stärksten Krankheitsphase immer wieder auf mich aufgepasst hat und ich nur deshalb manche Abende durchstehen konnte.

Im Speziellen möchte ich unbedingt noch Wieland und der Familie Hemesath danken, die mir ermöglicht haben, das Studi um zu Ende führen zu können.

Abkürzungsverzeichnis

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1 Einleitung

1.1 Aufbau der FOF1-ATP-Synthase

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Abb. 1: Aufbau der FoF1-ATP-Synthase von E. coli (Weber & Senior, 2003)

Die ATP-Synthase ist ein hochkonserviertes Enzym und ein Schlüsselenzym in der zellulären Energieumwandlung. Sie wird zu den ATPasen vom F-Typ gezählt und gehört zu den kleinsten Nanomotoren überhaupt. Sie besitzt zwei strukturelle Bereiche: zum einen die F1-Untereinheit, wobei der Index 1 sich auf den ersten Faktor bezieht, der als essentiell beschrieben wurde und zum anderen die Fo-Untereinheit, wobei o ursprünglich für Oligomycin-empfindlich steht. Die FoF1-ATP- Synthase ist in ähnlicher Struktur in der inneren Membran von Mitochondrien, in der Thylakoidmembran von Chloroplasten und bei Eubakterien zu finden und besitzt ein Molekulargewicht von 550-650 kDa (Capaldi & Aggeler, 2002). Bei Bakterien ist sie innerhalb der Cytoplasmamembran lokalisiert, wobei der F1-Teil in Richtung des Cytoplasmas ausgerichtet ist. Bei Escherichia coli besteht der protonentransportierende, membranintegrale Fo-Teil aus den Untereinheiten a, b und c, die mit einer Stöchiometrie von 1:2:10 vorliegen (Capaldi & Aggeler, 2002). Das Molekulargewicht des Fo-Komplexes beträgt 148kDa. Der hydrophile periphere F1-Teil besteht aus den Untereinheiten α, β, γ, δ und ε und liegt mit einer Stöchiometrie von 3:3:1:1:1 vor (Abb.1). Das Molekulargewicht des F1- Bereiches beträgt 382kDa. Diese beiden Subkomplexe, Fo und F1, können mittels diverser Waschschritte in Puffer mit geringer Salz- konzentration und einem Chelatbildner, der die vorhandenen zweiwertigen Kationen abfängt, leicht voneinander getrennt werden. Nativ liegt Fo und F1 bei der ATP-Synthase aber in gekoppeltem Zustand vor, wobei diese Kopplung innerhalb des Enzyms durch zwei Strukturen sichergestellt wird. Zum einen handelt es sich hierbei um den „pheripheral stalk“, der sich aus den Untereinheiten δ und b zusammensetzt und zum anderen um den „central stalk“ der aus den Abb. 1: Aufbau der FoF1-ATP-Synthase von E. coli Untereinheiten γ und ε besteht (Capaldi & (Weber & Senior, 2003) Aggeler, 2002). Funktionell lässt sich die ATP-Synthase ebenfalls in zwei Sektoren unterteilen. Dabei handelt es sich um die Statordomäne, die aus den Untereinheiten α3β3δ ab 2 besteht und die Rotordomäne, die aus den Untereinheiten γε c 10 gebildet wird (Junge et al., 2009). Die Rotordomäne wird durch den Protonenfluss angetrieben, welcher durch das elektrochemische Protonenpotential der Membran ermöglicht wird. Aufgebaut wird der elektrochemische Protonengradient (pmf) aus dem Membranpotential und dem pH-Gradienten durch eine Reihe von membranintegralen Transportsystemen der Atmungskette unter Ausnutzung des vektoriellen Transports von Elektronen innerhalb der Membran, wobei sukzessive Protonen nach außen transportiert werden (Abb. 2). Nach dem chemiosmotischen Modell von Peter Mitchell wird der Protonengradient in ATP umgesetzt und zwar abhängig von der protonenmotorischen Kraft.

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Abb. 2: zyklischer Ionentransport von Komplexen der oxidativen Phosphorylierung

(Dimroth et al., 2006)

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Abb. 3: Struktur von ATP (Invitrogen)

Dabei fließen die Protonen durch einen Protonenkanal in die Zelle zurück. Dieser Kanal ist Teil der ATP-Synthase, die durch den Fluss angetrieben wird, das elektrochemische Protonenpotential der Membran in energiereiche Phosphosäureanhydridbindung umsetzt und aus Adenosindiphosphat (ADP) und anorganischem Phosphat, Adenosintriphosphat (ATP) synthetisiert. Dabei ist ATP die universelle chemische Energieform und besteht aus der Base Adenin, dem Monosaccharid Ribose und drei Phosphatresten (Abb. 3) und kann abgesehen von der oxidativen Phosphorylierung zum anderen auch mittels Substratkettenphosphorylierung gebildet werden. Bei der Substratkettenphosphorylierung wird ATP aus phosphorylierten organischen Verbindungen unabhängig von der ATP-Synthase gebildet, wobei der energiereich gebundene Abb. 3: Struktur von ATP (Invitrogen) Phosphatrest der organischen Verbindung auf ADP übertragen wird. Durch die Hydrolyse der endständigen Phosphatsäureanhydridbindung des ATP kann die gespeicherte Energie der Zelle verfügbar gemacht werden.

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Dabei wird unter Standardbedingungen eine Energie von etwa -30,5 kJ . mol-1 frei und kann so für energetisch ungünstige Reaktionen benutzt werden, welche an die ATP-Hydrolyse gekoppelt sind. Schätzungsweise werden im Menschen pro Tag 40kg ATP umgesetzt.

Neben der Synthese von ATP ist die ATP-Synthase auch dazu in der Lage als ATPase zu fungieren und ATP zu hydrolysieren. Infolgedessen wird dann gleichzeitig ein Protonengradient aufgebaut. Der Zustand der ATP-Hydrolyse findet bei Bakterien beispielsweise unter anaeroben Bedingungen statt, um so das Membranpotential aufrecht zu erhalten. Bei der bakteriellen ATP-Synthase ist die ATPase- Aktivität von inhibierendem Mg-ADP, dem transmembranen elektrochemischen Gradienten sowie von Konformationsänderungen in ε abhängig (von Ballmoos et al., 2008). Bei Anwesenheit von ATP liegt ε in der „closed“ Konformation vor, bei welcher sowohl Synthese als auch Hydrolyse von ATP möglich ist. Steigende ADP- bzw. niedrige ATP-Konzentrationen führen zum „open“- Zustand, der eine Rotation der γ Untereinheit in Hydrolyse-Richtung inhibiert (Yagi et al., 2007; von Ballmoos et al., 2008).

1.2 Untereinheiten der FoF1-ATP-Synthase

Wie zuvor erwähnt besteht die ATP-Synthase von E. coli aus acht Untereinheiten, deren codierenden Gene in einem Operon vorliegen. Das atp -Operon befindet sich bei ca. 84min auf dem Chromosom in der Nähe des Replikationsursprungs oriC (Gay & Walker, 1981) und besitzt eine Größe von 6,8kb. Es codiert die Gene atpIBEFHAGDC, welche so angeordnet sind, dass angesehen von atpI, als erstes die Gene für den Fo-Teil transkribiert werden und anschließend die Gene für den F1-Teil der ATP- Synthase. Darüber hinaus besitzt das Operon drei verschiedene Promotoren unterschiedlicher Stärke. Der stärkste von ihnen liegt 73bp stromaufwärts des Gens atpI, die anderen beiden schwächeren innerhalb dieses Gens (von Meyenburg et al., 1982). Die Transkriptionstermination des Operons erfolgt ungefähr 50bp stromabwärts des atpG Gens (Nielsen et al., 1984). Da die Stöchiometrie der Untereinheiten innerhalb der ATP-Synthase stark variieren, müssen dementsprechend die Untereinheiten ungleich stark synthetisiert werden. Das wird durch translationelle Kopplung zwischen den einzelnen Cistronen erreicht, sodass die Translation der Cistrone innerhalb der polycistronischen mRNA in unterschiedlichem Maß erfolgt.

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Abb. 4: atp-Operon von Escherichia Abb. 4: atp-Operon von Escherichia coli

Das Gen atpI codiert die Untereinheit i, dessen Funktion in Escherichia coli nach wie vor nicht eindeutig geklärt werden konnte. Es konnte aber nachgewiesen werden, dass das hydrophobe Protein nicht essentiell für die Funktionalität der ATP-Synthase in E. coli ist. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass bei Propionigenium modestum die Untereinheit i essentiell ist und mit ihrer chaperonähnlichen Funktion Anteil an einer erfolgreichen Assemblierung c -Ringes hat.

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Abb. 5: Anordnung der TMH 2-5 in einem Vier-Helix-Bündel (Schwem & Fillingame, 2006)

Die ebenfalls hydrophobe Untereinheit a, welche von atpB codiert wird, besitzt ein Molekulargewicht von 30kDa. Über die Struktur als auch den dreidimensionalen Aufbau ist jedoch wenig bekannt. Insgesamt besitzt sie fünf transmembranen α-Helices (TMH). Die Orientierung wurde mittels Cysteinsubstitutionen untersucht, wobei der C-Terminus zum Cytoplasma und der N-Terminus dem Periplasma zugewandt ist (Long et al., 1998; Valiyaveetil & Fillingame, 1998). Weitere Crosslinkstudien zeigten, dass die THM 2- 5 von a als 4-Helixbündel vorliegen, welche über hydrophile Schleifen miteinander verbunden sind (Schwem & Fillingame, 2006). Es bilden einem Vier Helix- -Bündel (Schwem & Fillingame, 2006) sich zwei cytoplasmatische Schleifen in den Regionen a K66- a H95 und a K169- a E196 sowie zwei periplasmatische Schleifen in den Regionen a V110- a E131 und a L229- a I246 aus (Björbaek et al., 1990; Lewis et al., 1990; Greie et al., 2001).

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Abb. 6: Anordnung der Untereinheit a (Moore et al., 2008)

Mit Hilfe von Mutagenesestudien konnte eine direkte Beteiligung von a am Protonenfluss über die Membran gezeigt werden und zwar anhand von zwei Halbkanälen. Dabei wurden die Aminosäuren der vierten transmembranen Helix identifiziert, welche für die Bildung des cytoplasmatischen Kanals wichtig sind. Besonders essentiell ist der hochkonservierte Aminosäurerest Arginin an der Position 210 in der vierten TMH, da jede Substitution dieser stark konservierten Aminosäure die Protonentranslokation beeinträchtigt (Vik et al., 1994). Der periplasmatische Halbkanal wird von den Aminosäuren der fünften Transmemebranhelix gebildet (Angevine & Fillingame, 2003; Schwem & Fillingame, 2006, Angevine et. al., 2007, Moore et al., 2008). Neuere Studien von Moore et al. (2008) lassen vermuten, dass eine pH-abhängige Konformationsänderung der TMH5 eine zentrale Rolle beim Protoneneintritt in den periplasmatischen Halbkanal spielt. Mit Hilfe von molekulargenetischer Cystein-Substitutionen in allen TMH wurde die Zugänglichkeit der hydrophilen Halbkanäle für wasserlösliche Substanzen wie Ag2+ und NEM untersucht. Crosslinkstudien konnten zudem eine Interaktion zwischen TMH4 von a und der TMH2 von c nachweisen. Dabei liegt das a R210 parallel zu c D61 (Fillingame et al., 2000) und interagieren über eine transiente Salzbrücke miteinander (Deckers- Hebestreit et al., 2000). Gleichzeitig interagiert a mit Aminosäuren der vierten und fünften TMH mit der „tether“-Domäne der Untereinheit b. Crosslinkstudien zeigten Wechselwirkungen von a V239 und a A242 mit b G9 (Brandt, 2007) sowie a V239 mit b L16, was sich auch als eine geeignetere ab - Interaktionsposition in den Studien erwies (Vorwerk, 2009). Untermauert werden konnte diese Erkenntnis der Interaktion noch durch Reinigung von a mittels His-tag, da dabei ein ab 2-Komplex gewonnen werden konnte. Dieser Komplex ist sogar stabil genug, um bei der Affinitätschromatographie in verschiedenen Detergenzien bestand zu haben (Stalz et al., 2003).

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Abb. 7: Aufbau des c -Monomers (Girvin et al., 1998)

Auch c, welche mit 8,3 kDa die kleinste Untereinheit der ATP-Synthase ist, ist eine stark hydrophobe Untereinheit und wird auch gerade wegen dieses extrem hydrophoben Charakters auch Proteolipid genannt, da es wie Phospholipide durch Chloroform/Methanol Extraktion gereinigt werden kann. Girvin et al. (1998) konnte die Struktur von c in einer Chloroform/Methanol/Wasser Lösung mit Hilfe der NMR- Spektroskopie bestimmen. Insgesamt besitzt die Untereinheit zwei transmembrane, antiparallel angeordnete α-Helices und bildet damit und einer dem Cytoplasma zugewandten „loop“-Region eine Haarnadelstruktur aus. Diese „loop“- Region besitzt im Gegensatz zu den α-Helices hydrophile Aminosäuren (Jones et al., 1998; Girvin et al., 1998). Die hydrophobe Struktur der α-Helices wird durch einen polaren Carboxylrest am Aspartat

61 innerhalb der zweiten Helix unterbrochen, wodurch eine Protonenbindestelle geformt wird (Fillingame & Dimitriev, 2002, Steed & Fillingame, 2009). Dies ist essentiell für den Protonentransport über die Membran. Grundsätzlich liegt c in oligomerer Form in FoF1-ATPasen vor, dabei variiert aber die Anzahl der Monomere von Organismus zu Organismus und besitzt eine Bandbreite von 8 bis 15 Monomeren. In Rinderherzmitochondrien kommen zum Beispiel 8 c -Monomere vor (Watt et al., 2010), 10 Monomere in Saccharomyces cerevisiae (Stock et al., 1999) sowie in E. coli (Ballhausen et al., 2009) und 11 c -Monomere in Ilyobacter tartaricus (Meier et al., 2005). Des Weiteren sind in Spinacea oleracea 14 dieser Monomere zu finden (Seelert et al., 2000) und in Spirulina platensis sogar 15 (Pogoryelov et al., 2005). Die Anzahl der c -Monomere ist abhängig vom Membranpotential sowie dem pH-Gradienten, wobei weniger Monomere dann energetisch günstiger sind, wenn das Membranpotential überwiegt und mehr Monomere, wenn der Protonengradient größer ist. Grundsätzlich lässt sich mittels Kristallstruktur und AFM sagen, dass die c -Monomere eine Ringstruktur bilden, bei der die Monomere so angeordnet vorliegen, dass jeweils die N-terminale Helix nach innen und die C-terminale Helix nach außen orientiert ist. Dadurch entsteht ein konzentrischer Ring. Der Innenraum des Rings ist höchstwahrscheinlich zur periplasmatischen Seite hin mit Phospholipiden gefüllt, um einen unkontrollierten Ionenfluss über die Membran zu verhindern (Watt et al., 2010).

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Abb. 8: Oligomere Ringstrukturen der c -Untereinheit von unterschiedlichen Organismen im Vergleich

A) Rinderherzmitochondrium (Watt et al., 2010) B) I. tartaricus (Meyer et al., 2005)

C) S. cerevisiae (Stock et al., 1999) D) S. oleracea (Seelert et al., 2000)

E) S. platensis (Pogoryelov et al., 2005)

Die 17,3kDa große amphiphile Untereinheit b der ATP-Synthase von Escherichia coli ist ebenfalls wie a und c in der Cytoplasmamembran verankert. Neben dem membranintegralen Teil besitzt sie außerdem eine große cytoplasmatische Domäne und liegt in dimerer Form im Enzymkomplex vor, wobei die Dimerisierung sowohl für die Funktionalität, als auch für die Assemblierung des Enzyms notwendig ist (Wood & Dunn, 2007). Insgesamt bestehen die Monomere jeweils aus 156 Aminosäuren und bilden wahrscheinlich durch superspiralisierte Anordnung ein Homodimer aus, welches sich von der periplasmatischen Seite der Cytoplasmamembran bis hin zur Spitze des F1-Komplexes erstreckt (Capaldi et al., 2000). Die Monomere der b -Untereinheit können durch zahlreiche Deletions- und Crosslinkstudien in vier funktionale Domänen eingeteilt werden. Es handelt sich hierbei um eine N- terminale transmembrane Domäne, welche aus den Aminosäureresten 1-24 der monomeren b -Untereinheit besteht, eine „tether“-Domäne mit den Resten 25-52, sowie eine Dimerisierungsdomäne (Reste 53-122) und eine C-terminale δ- Bindedomäne mit den restlichen Aminosäuren 123-156 (Dunn et a l., 2004). Der cytoplasmatisch gelegene Teil des Proteins ist hydrophil, abgesehen von einem kurzen hydrophoben Bereich am C-Terminalen Ende (Aminosäuren 124-132). Insgesamt kann außerdem mit Hilfe des Circulardichroismus (Greie et al., 2000) und analytischer Ultrazentrifugation ein α-helicaler Anteil im Gesamtprotein von 75% ausgemacht werden. Durch Deletionen in der b -Untereinheit bis zu 11 Aminosäuren sowie Insertionen bis zu 14 Aminosäuren kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei der b 2-Untereinheit um ein flexibles Konstrukt handelt, da das Enzym dadurch nicht in seiner Funktion beeinträchtigt ist (Sorgen et al., 1998; 1999).

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Abb. 9: Domänen der Untereinheit b

(modifiziert nach Dunn et a l., 2004)

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Abb. 10: Modellstruktur der δ-Binde- und Dimerisierungsdomäne von b 2

(Dunn et al., 2004)

Darüber hinaus wird die Vorstellung einer flexiblen Untereinheit dadurch unterstützt, dass das b -Dimer nicht aus zwei identischen Monomeren bestehen muss. Es können Heterodimere gebildet werden, die aus einem verkürzten als auch einem verlängerten Monomer bestehen (Grabar & Cain, 2003; 2004). Es wird davon ausgegangen, dass die b 2-Untereinheit mit ihrer Flexibilität als energiespeicherndes Element die Subkomplexe F1 und Fo verbindet und so für die elastische Kopplung bei der Protonentranslokation verantwortlich ist (Junge, 2001). Die Membrandomäne besteht aus einer α-Helix, wobei zwischen den Resten 23 und 26 eine Abänderung ihres Verlaufs um 23° stattfindet und ab Rest 27,28 ein weiterführender Verlauf mit einem Winkel von 20° bezogen auf die Anfangshelix. Die „tether“-Domäne verbindet die Transmembrandomäne sowie die Dimerisierungsdomäne und interagiert mit der Untereinheit a des Proteins. Die Kristallstruktur der Dimerisierungsdomäne im Bereich der Enden 62-122 am monomeren b konnte vollständig aufgeklärt werden. Es handelt sich hierbei um eine komplette α-helicale Struktur. Durch Disulfid-Crosslinkstudien konnte außerdem ein Versatz um ca. 5,5 Aminosäuren in diesem Bereich nachgewiesen werden, da durch die asymmetrische Anordnung das Dimer stabiler wird. Zudem ist es gelungen nachzuweisen, welches b -Monomer signifikant für die Interaktion mit δ ist und ist auch ein Indiz für die mögliche Asymmetrie. Dies gelang durch Einbau von Mutationen in die Nähe des C- Terminus der Untereinheit. Die Mutationen wurden entweder in das Monomer, welches durch „offset“-Crosslinks näher am N-Terminus positioniert ist (b N) oder in das C-terminal verschobene Monomer eingebaut (b C), um die jeweilige Auswirkung auf die F1-Bindung zu ermitteln. Bei Deletionen der letzten vier C-terminalen Aminosäuren des b N-Monomers lies dessen Bindung mit F1 nach. Im Gegensatz dazu waren die Auswirkungen der gleichen Deletionen bei b C gering. Ebenso verursachte BPM (Benzophenon-4-Maleimid), welches am C-Terminus von bN eingesetzt wurde eine Quervernetzung mit δ (Wood & Dunn, 2007). Daher ist die C-terminale δ-Bindedomäne essentiell für die Interaktion mit dem F1-Komplex. Zudem ist das Dimer mit dieser Bindedomäne stabiler und besitzt eine Schmelztemperatur, welche um 2-5°C höher ist, als die Konstrukte die bei 122 Aminosäuren enden (Del Rizzo et al., 2006) und ist vermutlich an der Stabilität des gesamten Proteins maßgeblich beteiligt. Da Mutationen in der δ-Bindedomäne kaum die Dimerisierung der b - Untereinheit beeinflussen, sich aber dabei der Sedimentationskoeffizient des Dimers ändert, gehen Dunn et al. (2004) davon aus, dass sich die C-terminale Region zurückfaltet. Dies geschieht vermutlich durch eine Biegung zwischen den Resten 139-141, wodurch ein antiparalleles „right-handed“ Bündel aus vier Helices entsteht. Diese Eigenschaft verleiht der Domäne eine globuläre Struktur, konnte aber in weiteren Studien bisher nicht verifiziert werden.

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Abb. 11: NMR-Struktur der N-terminalen Domäne von δ (Weber et al., 2003)

Die Untereinheit δ der F1-Domäne hat eine Größe von 19,6kDa und besteht aus 177 Aminosäureresten. Sie lässt sich in zwei Domänen einteilen, einem N-terminalen Bereich (Abb. 11) von Aminosäure 1 bis 105 und einen C-terminalen Bereich bestehend aus den Aminosäuren 106 bis 177. Lokalisiert ist δ in der Kronenregion des αβ-Hexamers und verbindet das Hexamer mit dem b -Dimer (Weber et al., 2003). Die N- terminalen Aminosäurereste bilden ein Bündel von sechs α- Helices (Wilkens et al., 1997). Insgesamt ist das Protein im C-terminalen Bereich hoch konserviert sowie in Helices 1 und 5, welche die Interaktionsbereiche zwischen δ und den N-terminalen Enden der α-Untereinheit darstellen. Diese Interaktion wurde quantitativ durch die Rückbindung von Wildtyp- und verändertem δ an δ-freies F1 anhand von Fluoreszenzsignalen (Weber et al., 2003; 2006), als auch durch NMR-Spektroskopie (Weber et al., 2003; Wilkens et al., 2005) untersucht. Gleichzeitig zeigten die Untersuchungen auch, dass wenn der cytoplasmatische Teil von b mit in die Studien einbezogen wird, die Bindeaffinität von δ an δ-freies F1 wesentlich erhöht wird. Dabei interagiert die C-terminale Domäne von δ mit der δ-Bindedomäne des b -Dimers (Swada et al., 1997; Weber et al., 2003; 2006).

Mit 14,7 kDa stellt ε die kleinste Untereinheit des F1 Subkomplexes dar. Die Struktur wurde mittels NMR-Spektroskopie aufgelöst und zeigt einen Aufbau aus zwei Domänen. Dabei ist die N-terminale Domäne aus zehn β-Faltblättern aufgebaut und der C-Terminus besteht aus einer Haarnadelstruktur, welche aus zwei antiparallelen α-Helices gebildet wird (Wilkens et al., 1995; Uhlin et al. 1997). Demgegenüber zeigte sich aber die C-terminale Domäne in Studien von Rodgers & Wilce (2000) in einer anderen Konformation. Die beiden α-Helices waren nicht haarnadelförmig, sondern voneinander separiert und umgaben die γ-Untereinheit. Dieses Ergebnis zeigt eine gewisse Flexibilität der ε-Untereinheit, welche auch durch Crosslink-Studien bestätigt werden konnte (Schulenberg et al. 1997). Durch die Flexibilät ist ε in der Lage eine Strecke 4nm zu überbrücken und somit fähig, sowohl mit der c -Untereinheit auf der cytoplasmatischen Seite der Membran, als auch mit dem αβ-Hexamer zu interagieren (Zhang & Fillingame, 1995; Aggeler & Capaldi, 1996; Schulenberg et al., 1997; Hermolin et al., 1999). Dies bedeutet, dass ε während des katalytischen Zyklus der ATP-Synthase in der Lage ist unterschiedliche Konformationen anzunehmen. In der „closed“-Konformation liegt die Untereinheit in kontrahierter Form vor und besitzt keinen Kontakt zum αβ-Hexamer (Abb. 13 A). Dabei beträgt der Abstand von εS108 zum „turn-helix-turn“-Motiv von β, die als DELSEED-Sequenz bezeichnet wird und für die Öffnung bzw. Verschluss der katalytischen Zentren in β verantwortlich ist, 50 Angström. Es kommt daher keine Interaktion zwischen ε und β zustande. In der „open“-Konformation ist ε langgestreckt (Abb. 13 B), der Abstand von εS108 zum DELSEED-Motiv beträgt nur noch 25 Angström (Buligyn et al., 2004). Neuere Studien von Yagi et al. (2007) konnten zeigen, dass ε darüber hinaus in der Lage ist ATP zu binden. Dabei bilden in Anwesenheit von ATP die beiden α-Helices der C-terminale Domäne die Haarnadelstruktur aus und unter Abwesenheit von ATP separieren sie sich wieder. Daher reagiert ε auf die ATP-Konzentration mit einer Arm-ähnlichen Bewegung und ist somit an der Regulation innerhalb der ATP-Synthase beteiligt.

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Abb. 12: Modell der „closed“- und „open“-Konformation von ε der ATP-Synthase ε = grün, γ = orange, α = dunkelblau, β = rot, c = hellblau/lila (Bulygin et al. 2004)

Die Untereinheit γ, welche mit ε in engem Kontakt steht (Abb. 13), bildet mit ihr ein 45nm langes Verbindungsstück zwischen Fo und F1 aus. Sie besitzt eine Größe von 31,4 kDa und erstreckt sich von der Innenseite der Cytoplasmamembran, wo sie Kontakt zur Untereinheit c hat, bis in das αβ- Hexamer hinein. Durch Abrahams et al. (1994) konnte erstmals ein Teil der Kristallstruktur von mitochondrialem γ bestimmt werden und anschließend bei 2,4 Angström vollständig aufgelöst werden (Gibbons et al., 2000). Durch Rodgers & Wilce (2000) konnte zur gleichen Zeit mit einer Auflösung von 2,1 Angström die zentrale Domäne im γε-Komplex aus E. coli identifiziert werden. Es zeigte sich, dass die N- und C-terminalen Bereiche von γ aus einem Paar von antiparallelen α-Helices besteht, die leicht umeinander gewunden sind und deren Termini sich 45 Angström in die Basis des αβ-Hexamers erstrecken (Hausrath et al., 1999; 2001). Es wird angenommen, dass die Asymmetrie der α-Helices für die unterschiedliche Bindeaffinität der katalytischen Bindetaschen von β von Bedeutung ist. Der mittlere Bereich von γ, unterhalb von α3β3, bildet ein Bündel aus fünf β-Faltblättern zwischen zwei α-Helices. Bei E. coli ist zudem noch ein weiteres β-Faltblatt, als auch zwei weitere α-Helices gefunden worden. Insgesamt lässt sich sagen, dass auch die Untereinheit γ einen gewissen Grad an Flexibilität aufweist und fungiert somit als elastisches Element bei der Kopplung zwischen der Rotation des c 10-Rings und der Konformationsänderung in den drei β-Untereinheiten (Menz et al., 2001). Weitere Studien zeigten außerdem, dass die N-terminale Region von γ alleine fähig ist, die Funktion von einem kompletten γ in der ATP-Synthase zu erfüllen, solange er an ε und damit an den Rotor gebunden ist. Daher ist kein direkter Kontakt von γ an den c 10-Ring für eine funktionelle ATP-Synthase notwendig (Mnatsakanyan et al., 2009).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 13: Vergleich der „coiled-coil“ Region von γ blau = E.coli; rot = mitochondrial

(Hausrath et al., 2001)

Das αβ-Hexamer besteht aus jeweils drei alternierend angeordneten α- und β-Untereinheiten, wobei α mit 55,3kDa die größte Untereinheit des F1- Komplexes ist. β besitzt eine atomare Masseneinheit von 50,2 kDa. Diese Untereinheiten machen ca. 80% des Gesamtgewichts von F1 aus (Walker et al., 1982; 1985). Mittig bildet das Hexamer einen zentralen Hohlraum, in den die α-Helices der Untereinheit γ hineinragen (Abrahams et al., 1994). Die Gensequenz von α und β zeigt eine hohe Homologie hinsichtlich ihrer Primärstruktur, sodass ihr Aufbau nahezu identisch ist. Die größten homologen Bereiche befinden sich im oberen N- terminalen β-Faltblatt der Untereinheiten.

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Abb. 14: Seitenansicht des αβ-Hexamers mit hineinragendem γ (Abrahams et al., 1994)

α = gelb, β = rot, γ = blau

Das Hexamer besitzt sechs Nukleotidbindetaschen, welche im Bereich der Spalten zwischen α und β angeordnet sind. Davon sind aber nur drei katalytisch aktiv, deren Zentren sich hauptsächlich in β befinden. Darüber hinaus sind auch einzelne Aminosäurereste der α-Untereinheit an der katalytischen Aktivität beteiligt. Die α- Untereinheit ist zwar ebenfalls in der Lage ein Nukleotid zu binden, dennoch ist sie katalytisch inaktiv (Greie et al., 2001). Die genaue Funktion der Bindetasche von α ist unbekannt. Es wird davon ausgegangen, dass der Enzymkomplex durch die Nukleotidbindung stabilisiert wird (Wise et al., 1983), jedoch konnte dies durch Untersuchungen bei Mutanten, die nicht zur Nukleotidbindung in α fähig waren, nicht verifiziert werden (Weber et al., 1995). Die N-terminalen Domänen von α und β bilden mittels β- Faltblätter eine fassartige Struktur aus, welche als Kronenregion bezeichnet wird. Im Gegensatz dazu bestehen die C-terminalen Domänen ausschließlich aus α-Helices. Zwischen beiden Regionen sind sowohl α-Helices, als auch β-Faltblätter vorhanden. Von diesen bilden neun α-Helices und neun β- Faltblätter die Nukleotidbindetaschen aus. Darüber hinaus geht das Hexamer Interaktionen mit γ ein, was zu verschiedenen Konformationszuständen unterschiedlicher Substratbindeaffinität in β führt (von Ballmoos et al., 2008).

1.3 Funktionsweise der FOF1-ATP-Synthase

Im Einzelnen wird die ATP-Synthese in den katalytischen β-Untereinheiten nach dem „binding change“-Mechanismus von Paul Boyer (1993) erzeugt. Bei diesem Mechanismus finden Konformationsänderungen in den drei β-Untereinheiten statt, die eine Bindung von ADP + Pi verursachen, die ATP-Synthese ermöglichen und anschließend zur Freisetzung des ATP-Moleküls führen. Diese Änderungen der β-Untereinheiten werden als „open“ (O), „tight“ (T) und „loose“ (L) bezeichnet (Capaldi & Aggeler, 2002), wobei auch im Ruhezustand jede β-Untereinheit jeweils eine dieser Konformationen mit unterschiedlicher Affinität für Nukleotide besitzt, was durch eine Asymmetrie von γ bedingt ist. Im O-Zustand ist die Bindetasche leer und es erfolgt im L-Zustand die Aufnahme von ADP und Pi, die eine schwache Bindung mit der Bindetasche eingehen. Im T-Zustand findet die eigentliche Generierung von ATP statt, während der nachfolgende O-Zustand dessen Freisetzung erlaubt. Die Änderungen in der Konformation werden durch Interaktionen mit der sich drehenden γ-Untereinheit verursacht. Die Drehung erfolgt in 120° Schritten, wobei jeweils ein ATP entlassen wird. Jeder dieser 120° Schritte lässt sich in weitere Subschritte einteilen. Bei der Bindung des ATP-Moleküls wird zuerst eine Rotation von γ um 80° ausgelöst und die Freisetzung bewirkt eine weitere Drehung um 40°. So liegen letztendlich nach einer Umdrehung von 360°, bei der insgesamt 3 ATP-Moleküle dissoziieren, die β-Untereinheiten wieder in ihrem Ausgangzustand vor (Greie et al., 2001). Die Hydrolyse von ATP erfolgt ebenfalls in 120° Schritten mit Subschritten von 40° und 80°, wobei die Dauer der Verweilzeit vor dem 80° Subschritt abhängig von der ATP-Konzentration ist (Pu & Karplus, 2008).

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Abb. 15: „binding-change -Mechanismus nach Boyer 2003

Die Energie für die Rotationsbewegung der Untereinheit γ entsteht durch den Protonentransport über die Membran. Daran ist zum einen die Untereinheit a des Stators und zum anderen die Rotorkomponente c 10 beteiligt. Die Untereinheit a fungiert hierbei als Vermittler beim Protonentransport, da sie zwei Halbkanäle besitzt, die nach dem „two-half-channel“-Modell funktionieren (Capaldi & Aggeler, 2002). Bei der ATP-Synthese findet der Protonentransport vom Periplasma zum Cytoplasma statt und entgegengesetzt bei der ATP-Hydrolyse. Nach dem „two-half- channel“Modell gelangen bei der ATP-Synthese die Protonen entsprechend der pmf aus dem Periplasma durch den ersten Halbkanal bis zur Mitte der Cytoplasmamembran. Durch das Proton wird die Carboxylgruppe des Aminsosäure-Restes Aspartat 61 der Untereinheit c in der Rotor/Stator- Interphase protoniert, wodurch es zum Ladungsausgleich kommt und die c -Untereinheit in die Lipidinterphase der Membran diffundieren kann. Außerdem kommt es durch nachfolgende Protonierungen weiterer Monomere der c - Untereinheit zur Rotation dieser. Das hat zur Folge, dass protoniertes Asp61 in räumliche Nähe zum zweiten Halbkanal der Untereinheit a gebracht wird. An diesem Halbkanal ist die Aminosäure Arginin 210 der Untereinheit a lokalisiert. a Arg210 ermöglicht die Deprotonierung des c Asp61. Gleichzeitig wird mit der nächsten „incoming binding site“ des c 10- Rings eine transiente Ionenbindung gebildet und das Abb. 16: Mechanismus der Protonentranslokation Proton gelangt über den zweiten Halbkanal von a ins (Weber & Senior, 2003) Cytoplasma. Bei dem Modell der Drehkrafterzeugung können auf diese Weise bei E. coli in einem Durchgang von 360° insgesamt zehn Protonen in zehn Schritten transloziert werden, da der c 10-Ring zehn „incoming binding sites“ besitzt, die jeweils ein Proton verlagern können. Diese Drehung des c -Ringes verursacht dann eine Drehung in γ und ε, die wiederrum eine Änderung der Konformation der katalytisch aktiven β-Untereinheiten zur Folge hat. Dabei wird dann das ATP synthetisiert.

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Abb. 16: Mechanismus der Protonentranslokation (Weber & Senior, 2003)

Da die Synthese von ATP bei E. coli in drei 120° Schritten abläuft, die die Protonentranslokation in zehn Schritten à 36° beinhaltet, bedeutet dies, dass pro Synthese eines ATP-Moleküls letztendlich 3,3 Protonen transportiert werden. Dementsprechend liegt ein Verhältnis von ATP zu H+ von 3:10 vor. Das Verhältnis kann von Organismus zu Organismus unterschiedlich sein, was durch die Stöchiometrie des c -Rings und der damit verbundenen Anzahl der „incoming binding sites“ verursacht wird. In den bisher untersuchten Organismen wurde eine variierende Anzahl an c - Untereinheiten von c 8 bis c 15 festgestellt. Daher muss je nach Organismus eine variable Anzahl an translozierten Protonen an die grundsätzliche 3-Schritt-Rotation des α3β3-Hexamers gekoppelt sein. Für diese Synchronisation der Protononentranslokation mit der ATP-Synthese werden zur Zeit zwei Modelle diskutiert: zum einen der „elastic-strain-Mechanismus“ und zum anderen der „stepping- Mechanismus“ (Capaldi & Aggeler, 2002). Der „stepping-Mechanismus“ besagt, dass jede Bewegung der c -Untereinheit separat mit einem Zwischenschritt der γε-Rotation verbunden ist und somit eine Teilreaktion der Synthese eines ATP-Moleküls darstellt. Stattdessen wird beim „elastic-strain- Mechanismus“ davon ausgegangen, dass die Energie jeder Bewegung der c -Untereinheiten, in den superspiralisierten, langen α-Helices der γ-Untereinheit sowie des b -Dimers gespeichert wird, bis sie in ausreichender Menge zur Verfügung steht, um γ und ε um 120° zu drehen und damit ein ATP- Molekül zu synthetisieren.

1.4 Assemblierung der ATP-Synthase

Der exakte Ablauf der Assemblierung der ATP-Synthase von Escherichia coli ist noch nicht ausreichend bekannt. Grundsätzlich ist es dazu notwendig, dass die drei Untereinheiten des Fo- Subkomplexes a, b und c in die Cytoplasmamembran inseriert und die übrigen fünf Untereinheiten des F1-Subkomplexes an diese peripher assoziiert werden. Dazu sind momentan zwei Modelle in Diskussion. Zum einen handelt es sich dabei um den „separate-sector assembly pathway“ und zum anderen den „integrated membran assembly pathway“. Das erste Modell besagt, dass die Subkomplexe Fo und F1 separat assemblieren und sich anschließend im letzten Schritt zu dem funktionsfähigen Komplex zusammenlagern (Brusilow, 1993). Das zweite Modell hat zur Grundlage, dass die schrittweise Assemblierung unabhängig von Fo und F1 abläuft (Cox & Gibson, 1987), wobei dieses Modell in der Form heute nicht mehr aktuell ist. Darauf basierend wurde das nachfolgende Arbeitsmodell (Abb. 16) entwickelt, wobei die Reihenfolge des sequentiellen Einbaus der

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Abb. 17: Assemblierungsmodell der ATP-Synthase von E. coli

Untereinheiten anhand bestehender Daten erhoben wurde und autark von den Subkomplexen erfolgt. Es konnte nachgewiesen werden, dass sich sowohl das b -Dimer (Becker, 2008), als auch der c 10-Ring separat in die Membran inserieren (Arechaga et al., 2002). Darüber hinaus zeigten Ballhausen et al. (2009) mittels Quervernetzungsstudien auf Membranvesikelebene, dass es sich dabei auch explizit um einen c 10-Ring handelt, der auch ohne weitere assemblierte Untereinheiten diese Stöchiometrie besitzt. Ebenso konnte durch Crosslinking für b gezeigt werden, dass es sich in dimerer Form in die Membran inseriert und ebenfalls in dieser Stöchiometrie auch ohne weitere Untereinheiten existiert (Becker, 2008). Beide Untereinheiten liegen aber separat in der Membran vor, da keinerlei Interaktion zwischen ihnen nachgewiesen werden konnte, solange keine weiteren Untereinheiten präsent sind. Der nachfolgende Schritt der Assemblierung konnte noch nicht ausreichend präzisiert werden. Es sind zwei verschiedene Varianten denkbar. Zum einen könnte sich γ zuerst an den c 10-Ring anlagern und dann erst daran α und β und zum anderen ist es auch möglich, dass sich γ, α und β im Cytoplasma zu einem Komplex teilassemblieren und erst dann an den c 10 -Ring binden. Für die letztere Version sprechen eher die Ergebnisse von Garrelfs (2008), die diese teilassemblierten Komplexe aus dem Cytoplasma reinigen konnte. Dies konnte durch Brandt (unveröffentlicht) ebenfalls bestätigt werden. Da aber beide mit Mutanten arbeiteten, deren Gene des atp -Operons auf einem Plasmid lokalisiert sind, muss noch abschließend geklärt werden, ob es sich nun um ein Artefakt der Überproduktion handelt oder ob dies auch auf der Ebene des Genoms der Fall ist. Nach der Assemblierung von α, β und γ an c erfolgt möglicherweise die Anlagerung von ε an den schon bestehenden Komplex. Dabei ist aber auch wiederum fraglich ob ε sich zuerst an γ im Cytoplasma anlagert. Durch die Assemblierung von δ wird schließlich das separate b -Dimer an den teilassemblierten Komplex gebunden. Untersuchungen von Bunge (2009) zeigten, dass wenn b - Defizienz vorhanden ist, δ nicht in der Lage ist am nativen Enzym zu assemblieren, was möglicherweise auf verstärkten proteolytischen Abbau zurückzuführen ist, da δ ohne b möglicherweise instabiler ist. Ob dabei nun δ zuerst an b 2 bindet oder an das αβ-Hexamer ist noch nicht bekannt. Genauso ist noch nicht ausreichend belegt, ob diese letzten Schritte de facto in der dargestellten Reihenfolge ablaufen. Um letzten Endes das vollständige und ATP-Synthese-fähige Enzym zu erhalten, muss noch die Untereinheit a eingebaut werden. Dass dies als finalen Schritt erfolgt, spricht dafür, dass selbst bei fehlendem a das teilassemblierte Enzym hohe Stabilität aufweist. Der Nachweis dafür gelang Ono et al. (2004) indem sie den Teilkomplex ohne a aus B. stearothermophilus PS3 in E. coli exprimierten und er gänzlich aufgereinigt werden konnte. In vitro konnte der Teilkomplex mit gesondert aufgereinigtem a zu einem funktionsfähigen Komplex in Liposomen rekonstituiert werden. Darüber hinaus konnten Hermolin & Fillingame schon 1995 zeigen, dass für den Einbau von a die Untereinheiten c und b notwendig sind. Auch Bunge (2009) konnte dies für b bestätigen, da bei b defizienten Mutanten a nicht in Lage ist am nativen Enzym zu assemblieren und auch nicht mehr in der Membran präsent ist. Gleichzeitig konnte auch durch Brockmann (2009) in vivo nachgewiesen werden, dass auch zeitlich versetzt exprimiertes a in das teilassemblierte Enzym eingebaut wird und das Enzym voll funktionsfähig ist. Auch wenn diese Erkenntnisse nicht vollständig ausreichen die Assemblierung von a als letzten Schritt zu verifizieren, sprechen dennoch noch weitere Aspekte dafür. Zum einen erscheint es nachvollziehbar, da erst durch a die Interphase zwischen a und c entsteht, wodurch die Protonentranslokation ermöglicht wird. Eine frühzeitige Protonentranslokation wäre für die Zelle energetisch ungünstig. Zum anderen konnte in Studien gezeigt werden, dass zwar a unabhängig von b und c in die Membran inseriert werden kann (Yi et al., 2004), aber dass diese dann auch sehr schnell von der ATP-anhängigen Metalloprotease FtsH abgebaut wird und so im separierten Zustand nicht stabil ist (Ito & Akiyama, 2005). Zudem zeigen die im Hintergrund ablaufenden Vorgänge, dass während der Insertion von c, b als auch a keine protonenmotorische Kraft erforderlich ist, abgesehen von der N-terminalen Region von a. Dabei wird c durch die Membraninsertase YidC unabhängig von der Sec-Translokase in die Membran inseriert. Die Insertion von b ist im Gegensatz dazu Sec abhängig und es ist überdies der Signalerkennungspartikel („signal recognition particle“, SRP) erforderlich (Yi et al., 2004). Für die Insertion von a ist sowohl SRP, die Sec-Translokase als auch YidC essentiell (Kol et al., 2009).

1.5 Zielsetzung der Arbeit

In der Arbeit von Garrelfs (2008) zeigte sich, dass im Cytoplasma einer Mutante mit einem „knock- out“ im Gen atpH sowie eines entsprechenden Wildtyps die Untereinheiten α, β, ε und teilweise γ durch Immunoblotanalysen detektiert werden konnten und gleichzeitig bei den Membranvesikeln der c -defizienten Mutante eine Abreicherung dieser Untereinheiten erfolgte (Abb.18). Daher sollte nun mit einem His6-tag an β untersucht werden inwieweit die Untereinheiten an β assoziiert vorliegen und infolgedessen aus dem Cytoplasma mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt werden können. In vorausgehenden Untersuchungen von Garrelfs (2008) als auch von Brandt (unveröffentlicht) zeigte sich, dass die Untereinheiten α, β, γ und ε mit dem β-His6-tag gereinigt werden konnten und sich dementsprechend möglicherweise während der Assemblierung der FoF1-ATP-Synthase als teilassemblierte Intermediate im Cytoplasma anreichern. Da beide dafür mit Mutanten auf plasmidcodierter Ebene arbeiteten, sollten nun ebenfalls die Eigenschaften bei einem Wildtyp und einer ∆ c -„knock-out“-Mutante auf chromosomaler Ebene untersucht werden, um so herauszufinden, ob es sich bei den Intermediaten um ein Resultat der Überproduktion handelt.

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Abb. 18: Detektion der FoF1-ATP-Synthase-Untereinheiten von E. coli beim Wildtyp und der c -defizienten Mutante (Garrelfs, 2008)

Im Speziellen sollte dazu die Methode von Datsenko und Wanner (2000) verwendet werden, um eine rpsL -Kan Resistenz-Kassette im atp -Operon mit entsprechender DNA zu ersetzen, welche drei Stoppcodons in atpH an den Positionen 13, 14 und 15 codiert, da vorhergehende „knock-out“ Mutanten mit nur einem Stoppcodon eine höhere Reversionsrate aufwiesen. Diese Codons bewirken einen Abbruch der Translation, sodass die Untereinheit c nicht translatiert wird. Da die Mutante mit dieser rpsL -Kan-Kassette erst bei sehr hohen Konzentrationen an Streptomycin ihre Streptomycin- Sensitivität zeigt, sollte des Weiteren eine Mutante konstruiert werden, deren rpsL -Kan- Resistenzkassette umgekehrt inseriert ist (Abb. 19B), im Vergleich zur Kassette dieser Mutante (Abb.19A). So kann womöglich die Bindeaffinität des P rpsL-kan zur RNA-Polymerase erhöht werden und die Kassette wird dementsprechend vermehrt abgelesen. Das ist eventuell darauf zurückzuführen, dass der Promotor des atp -Operons sich auf die Affinität des Promotors der Resistenz-Kassette auswirkt.

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Abb. 19: Anordnung der rpsL-Abb. 19: Anordnung der rpsL-Kan Resistenz-Kassette

Schließlich sollten die Eigenschaften des Wildtyps und der c -defizienten Mutante mittels Immunoblotanalysen sowie ATPase-Aktivitätsmessungen miteinander verglichen werden, da bei dem Wildtyp auf chromosomaler Ebene wenig teilassembliertes F1 erwartet wird, als bei der dementsprechenden ∆ c „knock-out“-Mutante. Bei dieser findet vermutlich eine Anreicherung der Intermediate statt, da diese nicht an c assemblieren können. Dennoch besitzt der Wildtyp eine höhere Aussagekraft, da es sich dabei um eine native Assemblierung handelt. Um eine Aussage über die Funktionalität der teilassemblierten F1-Komplexe erhalten zu können, sollte des Weiteren eine Rückbindung von Wildtyp-F1 an F1-freie Membranvesikel durchgeführt und somit ein Protokoll für Fluoreszenz-Messungen der ATP-getriebenen Protonentranslokation auf Basis von Garrelfs (2008) etabliert werden. Dazu sollten auch F1-freien Membranvesikel aus ML308-225 präpariert werden. Die Funktionalität der cytoplasmatischen Intermediate ist deshalb essentiell, da so gezeigt werden kann, ob sie in der Lage sind an den membranintegralen Fo-Teil des Enzyms zu binden und so seine native Aktivität wieder herzustellen.

In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte das Fehlen von δ in den Intermediaten untersucht werden. Bei der ∆c-Mutante von Garrelfs (2008) konnte δ in den gereinigten teilassemblierten Komplexen mittels Immunoblot nicht nachgewiesen werden. Die Abwesenheit von δ kann mehrere mögliche Ursachen haben. Sie kann zum einen auf einen sehr schnellen Abbau zurückgeführt werden, da δ als instabil gilt. Da Garrelfs (2008) zeigen konnte, dass der Abbau von δ durch Inhibition von termolysinartigen Proteasen sowie Aspartat-Proteasen vermindert wurde, wurde bei der Präparation Protease-Inhibitor-Mix der Firma Sigma verwendet. Zum anderen könnte darüber hinaus der His6-tag von β ein störender Faktor sein, der die Bindung von δ an den Komplex verhindert, da δ an die Kronenregion des αβ-Hexamers bindet, wo auch der His6-tag lokalisiert ist. Eine dritte Möglichkeit ist, dass sich δ zuerst an b assembliert, wie bei der Assemblierung der ATP-Synthase bei den entsprechenden Untereinheiten von S. cerevisiae gezeigt werden konnte (Straffon et al., 1998) und dann beide gemeinsam an das αβ-Hexamer. Dementsprechend findet dieser Vorgang nicht im Cytoplasma statt, sondern erst nachdem sich αβγ an den c 10 -Ring in der Membran assembliert hat. Dabei kann möglicherweise auch die Bindeaffinität zu b höher sein als zu der Kronenregion, da bei der F1-Ablösung vom Wildtyp δ häufig in der Membran verbleibt. Auch Untersuchungen von Weber et al. (2003) sprechen dafür, da sie zeigen konnten, dass sobald der cytoplasmatische Teil von b mit der δ-Bindedomäne in die Interaktionsstudien von δ mit einbezogen wird, die Bindeaffinität von δ an δ defizientes F1 verstärkt wird. Um die Abwesenheit von δ zu charakterisieren sollte die Synthese von AtpH verstärkt werden, um herauszufinden, ob die Defizienz durch Abbau verursacht wird und so dem entgegengewirkt werden kann. Dabei sollte ein System entwickelt werden, bei dem durch eine bestimmte Zugabe von IPTG die Expression von δ gesteuert wird. Eine weitere Variante ist, dass separat aufgereinigtes δ zu den teilassemblierten Komplexen hinzugefügt werden sollte, um festzustellen, ob das Fehlen von δ so im Komplex komplementiert werden kann. Daher sollte ein Reinigungsprotokoll auf der Basis von Untersuchungen von Bunge (2009) etabliert werden, bei dem atpH und atpC über ein pET-System exprimiert werden. Um schließlich herauszufinden, ob δ überhaupt bei abgelöstem F1 - bei Präsenz des His6-tags an β - vorhanden sein kann, sollte ein plasmidcodierter ATP-Synthase-Wildtyp verwendet werden, von dessen Membranvesikeln das F1 abgelöst und durch Immundetektion charakterisiert werden sollte.

2 Material und Methoden

2.1 Stämme, Plasmide und Primer

Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in den nachfolgenden Tabellen ersichtlich. In Tabelle 3 sind die während der Arbeit verwendeten Primer angegeben.

Tab. 1: Verwendete Bakterienstämme

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92 von 92 Seiten

Details

Titel
Assemblierung von F1-Untereinheiten der Escherichia coli ATP-Synthase im Cytoplasma
Hochschule
Universität Osnabrück
Note
2
Autor
Jahr
2011
Seiten
92
Katalognummer
V183692
ISBN (Buch)
9783656082521
Dateigröße
1880 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
assemblierung, f1-untereinheiten, escherichia, atp-synthase, cytoplasma
Arbeit zitieren
Daniela Prätorius (Autor), 2011, Assemblierung von F1-Untereinheiten der Escherichia coli ATP-Synthase im Cytoplasma, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/183692

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