Ziel des Versuches ist es, Lysozym aus zu isolieren und zu reinigen. Dafür wurde die Methode der Kationenaustauschchromatografie aufgrund des hohen isoelektrischen Punkts von Lysozym ausgewählt. Die erhaltenen Fraktionen der Chromatografie wurden auf den Proteingehalt und die Lysozymaktivität durch eine fotometrische Messung untersucht. Der Erfolg der Reinigung und Anreicherung durch eine SDSPage kontrolliert und bestätigt.
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
Einleitung
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Zielsetzung & Themen
Das primäre Ziel dieses Versuchs ist die Isolierung und Aufreinigung des Enzyms Lysozym aus Hühner-Eiklar mittels Kationenaustauschchromatografie, um anschließend die Reinheit und enzymatische Aktivität des Produkts zu charakterisieren.
- Isolierung von Lysozym aus Hühner-Eiklar
- Durchführung einer Kationenaustauschchromatografie
- Quantifizierung des Proteingehalts mittels Bradford-Methode
- Bestimmung der enzymatischen Aktivität durch fotometrische Messungen
- Qualitative Analyse durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page)
Auszug aus dem Buch
Einleitung
Lysozym ist ein Enzym, welches zu einem großen Anteil in dem Eiklar von Hühnereiern vorkommt. Der Anteil beträgt ca. 5-10% des Gesamtproteingehalts. Es gehört zur Familie der Muramidasen und katalysiert die hydrolytische Spaltung des Mureins in bakteriellen Zellwänden. Dabei wird die glykosidische Bindung von N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin gespalten. Lysozym ist auch ein Bestandteil von Körperflüssigkeiten wie Tränenflüssigkeit oder Speichel und ist ebenso in Pflanzen vorzufinden. Dort wirkt als Schutz vor bakteriellen Infektionen. Der isoelektrische Punkt (pI) liegt bei einem pH von ca. 11 und das Molekulargewicht beträgt 14,3 kDa. In Abb.1 ist die Struktur von Lysozym zu erkennen, wobei die positiven Reste lila hervorgehoben sind.
Lysozym wurde erstmals von E.P. Abraham 1939 isoliert, gereinigt und kristallisiert. In dem folgenden Versuch wurde Lysozym durch Ionenaustauscher Chromatografie isoliert und gereinigt und der Erfolg der Aufreinigung wurde durch eine Konzentrationsbestimmung und einen Aktivitätstest untersucht.
Die Ionenaustauschchromatografie beruht auf dem Prinzip der Adsorptionschromatografie. Lysozym liegt bei einem Arbeits-pH von 10 noch weitgehend protoniert vor, während die meisten anderen Enzyme ihren pI an diesem Punkt schon überschritten haben und deswegen keine positiven Ladungen mehr besitzen. Lysozym adsorbiert an Kationenaustauscher-Gruppen, während andere Proteine von der Säule gewaschen werden.
Zusammenfassung der Kapitel
Zusammenfassung: Das Kapitel gibt einen Überblick über die Zielsetzung, die angewandten Methoden sowie die Ergebnisse der Lysozym-Reinigung inklusive Ausbeute und Anreicherungsfaktor.
Einleitung: Dieses Kapitel erläutert die biologische Funktion und Eigenschaften von Lysozym sowie das grundlegende Prinzip der verwendeten Ionenaustauschchromatografie.
Materialien und Methoden: Hier werden die theoretischen Grundlagen der verwendeten Verfahren – Ionenaustauschchromatografie, Bradford-Methode, Enzymaktivitätsmessung und SDS-Page – detailliert beschrieben.
Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert die experimentellen Daten in Form von Diagrammen und Tabellen zur Proteinbestimmung, Enzymaktivität und SDS-Page-Analyse.
Diskussion: In diesem Kapitel werden die Ergebnisse bewertet, mögliche Fehlerquellen bei der Proteinbestimmung und Messung analysiert und der Erfolg der Aufreinigung interpretiert.
Schlüsselwörter
Lysozym, Hühner-Eiklar, Kationenaustauschchromatografie, Proteinreinigung, Bradford-Methode, Enzymaktivität, SDS-Page, Elektrophorese, isoelektrischer Punkt, Muramidasen, Adsorptionschromatografie, Proteinaufreinigung, Laborpraktikum, Molekulargewicht, Fotometrie
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit?
Die Arbeit dokumentiert das Protokoll zur erfolgreichen Isolierung und Aufreinigung des Enzyms Lysozym aus Hühner-Eiklar.
Welche zentralen Themenfelder werden bearbeitet?
Zentrale Themen sind die biochemische Trennung mittels Ionenaustauschchromatografie, die quantitative Proteinbestimmung und die qualitative Charakterisierung durch Elektrophorese.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Ziel ist die Anreicherung von Lysozym aus einem Proteingemisch und die Überprüfung des Erfolgs anhand von Aktivitätstests und SDS-Page-Analysen.
Welche wissenschaftliche Methode wird eingesetzt?
Die Arbeit nutzt schwerpunktmäßig die Kationenaustauschchromatografie, ergänzt durch die Bradford-Methode und die SDS-Page nach Laemmli.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Im Hauptteil werden der Versuchsaufbau, die Kalibrierung der Messgeräte, die detaillierte Darstellung der Messergebnisse sowie deren statistische Auswertung präsentiert.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Untersuchung?
Die Arbeit lässt sich am besten mit Begriffen wie Lysozym, Ionenaustauschchromatografie, Proteinreinigung, SDS-Page und Enzymaktivität beschreiben.
Warum wurde für die Reinigung des Lysozyms eine Kationenaustauschchromatografie gewählt?
Die Methode wurde aufgrund des hohen isoelektrischen Punktes von Lysozym (pI ca. 11) gewählt, wodurch es bei einem Arbeits-pH von 10 positiv geladen ist und an die negativ geladene Säulenmatrix binden kann.
Wie wurde die Reinheit des isolierten Lysozyms nachgewiesen?
Die Reinheit wurde durch eine SDS-Page nach Laemmli kontrolliert, wobei das Eluat im Vergleich zu anderen Fraktionen nur eine deutliche Bande auf der Höhe des erwarteten Molekulargewichts zeigte.
Wie lässt sich die Diskrepanz in der Gesamtaktivität des Eluats erklären?
Die Autorin führt die rechnerisch unmögliche Zunahme der Gesamtaktivität im Eluat auf einen Messfehler bei der Extinktionsmessung während des Aktivitätstests zurück.
- Arbeit zitieren
- Anonym (Autor:in), 2016, Reinigung von Lysozym durch Ionenaustauschchromatografie, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/370413
