Inhaltsverzeichnis

1  Methoden der Keimisolierung/Keimzahlbestimmung  3

1.1  Lebendz ahlung  3

1.1.1  Koloniez ahlung nach dem Oberfl achenausstrich  4

1.1.2  Koloniez ahlung nach dem Gussverfahren  4

1.2  Partikelz ahlung  6

2  Differenzierung von Bakterien  7

2.1  Morphologie  7

2.1.1  Bestimmung der Kolonie-Morphologie  7

2.1.2  Mikroskopische Bestimmung von Zellmorphologie und Be-  

weglichkeit   8

2.2  Die Bakterielle Zellwand  9

2.2.1  Gram-F arbung  10

2.2.2  Test auf extrahierbare DNA (KOH-Test)  13

2.3  Wachstum und Stoffwechsel von Bakterien  13

2.3.1  Aerobes/Anaerobes Wachstum  14

2.3.2  Test auf Cytochrom Oxidase  15

2.3.3  Katalase Test  15

3  Isolierung von Mikroorganismen  17

1

INHALTSVERZEICHNIS 2

3.1  Enterobakterien und Coliforme Keime  17

3.1.1  Nachweis coliformer Keime durch Anreicherung in doppelt  

konzentrierter  Laktose-Pepton Bouillon  18

3.1.2  Nachweis coliformer Keime durch Direktansatz auf VRB  

Agar   18

3.2  Sporenbildener  19

3.2.1  Endosporen aerober Sporenbildner  19

3.3  Schimmelpilze und Hefen  20

3.3.1  Isolierung von Schimmelpilzen und Hefen  20

3.4  Nachweis von Chlostridien  21

3.4.1  Nachweis von Chlostridien im Weinzierl-Test)  21

4  Identifizierungsmethoden f ur Mikroorganismen  23

4.1  Biochemische Identifizierung  23

4.1.1  Identifizierung von Gram-negativen (Entero) Bakterien  

mit  dem Testsystem BBL Enterotube II  23

4.2  Immunologische Identifizierung  24

5  Bakterielle Viren  26

5.1  Isolierung von Bakteriophagen aus der Umwelt  26

6  DNA-Transfertechniken  28

6.1  Transduktion von Bioluminiszenz durch den modifizierten Liste-  

ria  Bakteriophagen A511 : : luxAB  28

6.2  Transformation von E.coli mit pGreenTIR  30

6.3  Konjugation  31

7  Mikroorganismen als Modellorganismen  33

7.1  Mutation und Abt otung  33

8  Literatur  35

Kapitel 1

Methoden der Keimisolie-rung/Keimzahlbestimmung

Oftmals ist es n¨ otig, die Keimzahl einer gegebenen Probe zu bestimmen. Hierzu stehen verschiedene Verfahren zur Verf¨ ugung, die sich grob in Lebendz¨ ahlung und Partikelz¨ ahlung unterteilen lassen. Bei der Lebendzellzahlbestimmung wird davon ausgegangen, dass eine lebende Bakterienzelle zu einer z¨ ahlbaren Kolonie auswachsen kann; da dies nicht immer richtig ist (z.B. bei Bakterien, die als Aggregate vorliegen, wie zum Beispiel Sarcina), werden colony forming units (cfu) ermittelt, die kleiner oder gleich der tats¨ achlichen Zellzahl sein k¨ onnen. Typische Verfahren der direkten Lebendzellzahlbestimmung sind Gussplattenverfahren, Oberfl¨ achenverfahren, Glasperlenverfahren bzw. mikroskopische Z¨ ahlung fluoreszenzmarkierter Zellen. Bei der indirekten Lebendzellzahlbestimmung werden Verfahren wie Mikrokalorimetrie, Messung der metabolischen Aktivit¨ at pro Zeiteinheit (¨ uber ¨ Anderung der Medienzusammensetzung) oder Bestimmung der Einbaurate isotopenmarkierter Vorstufen wie 3H-Thymidin eingesetzt. Bei der Partikelz¨ ahlung besteht die Gefahr, dass tote Bakterien sowie Fremdpartikel mitgez¨ ahlt werden. Zu den direkten Verfahren geh¨ ort hier die mikroskopische Z¨ ahlung mit Hilfe geeigneter Z¨ ahlkammern, zytometrische Verfahren sowie elektronische Z¨ ahlung und Zellvolumenmessung. Indirekte Verfahren st¨ utzen sich auf die Messung der optischen Dichte im Photometer oder die Gewichtsbestimmung.

1.1 Lebendz¨ ahlung

Im Versuch sollte die Keimzahl einer Rohmilchprobe bestimmt werden. Hierf¨ ur wurden zwei unterschiedliche Verfahren, das Oberfl¨ achenausstrichverfahren so-

3

KAPITEL 1. METHODEN DER KEIMISOLIERUNG/KEIMZAHLBESTIMMUNG4

wie das Gussverfahren eingesetzt. Um ausz¨ ahlbare Platten zu erhalten, wurde eine Verd¨ unnungsreihe der zu untersuchenden Suspension mit den Verd¨ unnungsstufen -2 bis -5 angesetzt.

1.1.1 Koloniez¨ ahlung nach dem Oberfl¨ achenausstrich

Durchf¨ uhrung

Von den jeweiligen Verd¨ unnungen wurden jeweils 100µl m¨ oglichst gleichm¨ aßig auf Agarplatten ausgestrichen, die ¨ uber Nacht aerob bei 37 ^◦ C inkubiert wurden.

Nach der Inkubationsphase wurden die Platten ausgez¨ ahlt und die Zahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) ermittelt. Daten und Ergebnisse

Beim Ausz¨ ahlen werden eigentlich nur die Platten gewertet, auf denen zwischen 20 und 300 Kolonien gewachsen sind. Deswegen wurden hier nur die Platten der Verd¨ unnungen -2 und -3 gewertet, auch wenn die Koloniezahl bei Verd¨ unnung -2 etwas dar¨ uber hinaus geht.

1.1.2 Koloniez¨ ahlung nach dem Gussverfahren

Durchf¨ uhrung

Es wurden jeweils 1000µl der Verd¨ unnungsreihe in leere Petrischalen pipettiert und mit noch fl¨ ussigem Agar gemischt. Nach Erstarren des Agars wurden die so erhaltenen Platten aerob bei 37 ^◦ C ¨ uber Nacht inkubiert. Anschliessend wurden die Platten ausgez¨ ahlt. Daten und Ergebnisse

Beim Gussverfahren haben wir die Verd¨ unnungsstufen -4 und -5 ausgewertet.

KAPITEL 1. METHODEN DER KEIMISOLIERUNG/KEIMZAHLBESTIMMUNG5

Auswertung

Zur Berechnung der Koloniebildenden Einheiten wurde folgende Formel verwendet: Gewichtetes Mittel: · d n

1fa+0,1fb

n = Summe aller Kolonien auf den ausgez¨ ahlten Platten fa = Zahl der Platten der niedrigsten Verd¨ unnungsstufe, die zur Berechnung herangezogen wird

fb = Zahl der Platten der n¨ achsth¨ oheren Verd¨ unnungsstufe d = Faktor der niedrigsten ausgewerteten Verd¨ unnungsstufe Austrichverfahren

F¨ ur das Ausstrichverfahren ergab sich der Wert von 4, 2 · 10 ⁵ CbU/ml nach 24h: ^{372+485+32+34} · 10 ³ = 419, 54 · 10 ³ = 4, 2 · 10 5

^2+0,2 Gussverfahren

Beim Gussverfahren ergab sich ein Wert von 1, 43 ·10 ⁷ CbU/ml nach einem Tag: 144+14 1+0,1 · 10 ⁵ = 142, 63 · 10 ⁵ = 1, 43 · 10 ⁷ Diskussion

Wie deutlich zu erkennen ist, unterscheiden sich die beiden Verfahren hinsichtlich ihres Ergebnisses. W¨ ahrend sich beim Oberfl¨ achenausstrichverfahren ein Wert von 4, 2 · 10 ⁵ cfu/ml Suspension ergibt, liegt dieser beim Gussverfahren mit 1, 43 · 10 ⁷ cfu/ml Suspension deutlich h¨ oher. Allerdings wurden diese Platten bei 37 ^◦ C ¨ u.N. inkubiert (statt wie beim Oberfl¨ achenausstrichverfahren bei 30 ^◦ C ¨ u.N). Desweiteren unterscheiden sich beide Verfahren deutlich in der Koloniegr¨ oße. W¨ ahrend beim Oberfl¨ achenausstrichverfahren nach kurzer Inkubationszeit bereits deutliche und ausz¨ ahlbare Kononien festgestellt werden d¨ urften, war es mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, die mit dem bloßen Auge kaum erkennbaren Kolonien beim Gussverfahren auszuz¨ ahlen. Der h¨ ohere cfu-Wert im Gussverfahren deutet auf einen h¨ oheren Anteil an mikroaerophilen bzw. anaeroben Keimen in der Suspension hin. Diese wachsen bevorzugt beim Gussverfahren, da die Sauerstoffkonzentration im Agar deutlich geringer ist als beim Wachstum an der Oberfl¨ ache. Ein weiterer Grund f¨ ur die unterschiedlichen Werte ist auch bei den Arbeitsschritten an sich zu suchen: w¨ ahrend beim Gussverfahren die Temperatur des fl¨ ussigen Agars niedrig genug ist, um keine Bakterien abzut¨ oten, kann es beim Ausstreichen der Probe durchaus zum Absterben von Bakterien aufgrund zu hoher Temperatur des Drigalski-Spatels kommen.

KAPITEL 1. METHODEN DER KEIMISOLIERUNG/KEIMZAHLBESTIMMUNG6

1.2 Partikelz¨ ahlung

Ziel war es, die Keimzahl einer Suspension von Sacceromyces cerevisiae zu bestimmen, indem die Partikel direkt im Phasenkontrastmikroskop bei 40-facher Vergr¨ oßerung mit Hilfe einer Thoma-Z¨ ahlkammer ausgez¨ ahlt wurden. Die Bestimmung der Hefekonzentration erfolgt unter Einbezug des definierten Kammervolumens und der bekannten Zahl vorhandener Z¨ ahlquadrate. Um die statistische Sicherheit zu erh¨ ohen, wurden zwei Z¨ ahlungen durchgef¨ uhrt, bei denen jeweils 4 Gruppenquadrate (GQ) ausgez¨ ahlt wurden. Beim Z¨ ahlen wurde die Konvention befolgt, den linken sowie den oberen Rand in die Z¨ ahlung miteinzubeziehen. Daten und Ergebnisse

Aus dem ermittelten Durchschnittswert von 484 Keimen lies sich die Gesamtkeimzahl der ausgegebenen Zellsuspension bestimmen: 1, 952 · 10 ⁷ Zellen / ml

Der Referenzwert aller Gruppen wird im Mittel mit 2, 5 · 10 ⁷ Partikel/ml angegeben. Diskussion

Der Vorteil dieser Z¨ ahlmethode ist die rasche Verf¨ ugbarkeit des Ergebnisses, ohne eine l¨ angere Inkubationszeit. Jedoch ist keine Selektion auf bestimmte taxonomische Gruppen oder St¨ amme m¨ oglich. Ferner besteht nicht die M¨ oglichkeit bzw. es ist sehr schwierig tote Zellen von Lebenden oder anderen Partikeln zu differenzieren. Das von uns ermittelte Ergebnis entspricht in etwa dem Grup- penwert.

Kapitel 2

Differenzierung von

Bakterien

Im Praktikum wurden zur Differenzierung verschiedener Mikroorganismen folgende g¨ angige Testverfahren angewandt:

• Koloniemorphologie und Zellmorphologie

• Motilit¨ atsbetrachtung

• Gramf¨ arbung

• KOH - Test

• Sauerstoffeinfluss auf Wachstum

• Oxidase - Test

• Katalase - Test

2.1 Morphologie

2.1.1 Bestimmung der Kolonie-Morphologie

Wachsen Bakterien und Hefen unterg¨ unstigen Bedingungen auf Agarplatten, so bilden sie definierte Kolonien aus, die anhand einfacher Merkmale beschrieben bzw. identifiziert werden k¨ onnen. Folgende Merkmale werden zur Differenzierung herangezogen:

7

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 8

• Gr¨ oße

• Form

• Randverlauf

• Farbe

Daten und Ergebnisse Siehe Tabelle [1] Diskussion

Zwar ist durch die Koloniemorphologie eine grobe Differenzierung zwischen den Mikroorganismen m¨ oglich, jedoch sollte man dabei beachten, dass das Aussehen der Kolonien auch von den Bedingungen ihres Wachstums (Bebr¨ utungsdauer, -temperatur, usw.) abh¨ angt. So sind Kolonien z.B. nach zwei Tagen gr¨ oßer als nach einem oder sie w¨ urden bei h¨ oheren oder niedrigeren Temperaturen schneller wachsen. Allerdings ist es schwierig, zwischen Mikroorganismen nur anhand ihrer Koloniemorphologie zu differenzieren. So kann man abschließend feststellen, dass die Beschreibung der Koloniemorphologie nur ein erster Schritt bei der Identifizierung sein kann.

2.1.2 Mikroskopische Bestimmung von Zellmorphologie und Beweglichkeit

Zur weiteren Identifizierung wird die Zellmorphologie unter dem Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Hierbei lassen sich grob die zwei typischen Grundformen, Kokken und St¨ abchen, von Bakterienzellen unterscheiden. Kokken

Als Kokken bezeichnet man kugel- oder eif¨ ormige Bakterien. Sie k¨ onnen einzeln (Mikrokokken), in Zweierverb¨ anden (Diplokokken), in Ketten (Steptokokken) oder in gr¨ oßeren Aggregaten (Staphylokokken) auftreten. St¨ abchen

Man unterteilt in gram-positive und gram-negative St¨ abchen. Bei den Gramnagativen treten relativ kleine Formen auf, die meist regul¨ ar gebaut sind. Daneben treten auch gekr¨ ummte (Vibrio) bzw. verdrehte (Spirillen) St¨ abchen auf. Neben den gram-positiven, regul¨ aren Formen lassen sich auch coryneforme St¨ abchen unterscheiden. Kennzeichnend hierf¨ ur sind die unregelm¨ aßige Form und snapping devision.

Ein großer Teil der Bakterien ist in der Lage, sich gerichtet fortzubewegen. Bei den meist aktiv beweglichen Arten wird die Bewegung durch Rotation von Geißeln verursacht. Die Anordnung der Geißeln an der Zelle ist ein charakteris- tisches Merkmal und kann somit zur Klassifizierung verwendet werden.

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 9

Durchf¨ uhrung

Vor der Versuchsdurchf¨ uhrung muss das Phasenkontrastmikroskop gek¨ ohlert werden, um eine optimale Ausleuchtung und Kontrastierung zu erzielen. Zur Vorbereitung der Pr¨ aparate wird ein Tropfen Wasser auf einen Objekttr¨ ager aufgebracht. In diesen Tropfen wird mit einer sterilen Impf¨ ose das Probenmaterial eingebracht; im Anschluss daran wird der Tropfen mit einem Deckgl¨ aschen luftblasenfrei abgedeckt und unter dem Mikrokop untersucht. Daten und Ergebnisse Siehe Tabelle [2] Diskussion

Wie im Skript angedeutet kann einem die Unterscheidung zwischen sehr kurzen St¨ abchen und ovalen Kokken schwer fallen. Ansonsten waren die verschiedenen Formen der Mikroorganismen recht gut unterscheidbar. Auch das Auftreten der Zellen (einzeln, in Ketten, in Haufen) war erkennbar. Die Feststellung der jeweiligen Beweglichkeit der Mikroorganismen war jedoch um einiges schwieriger da man zwischen der Eigenbewegung der Zellen und einer Bewegung von außen unterscheiden muss. So k¨ onnten die jeweiligen Bewegungen der Zellen auch mit einer Str¨ omung unter dem Deckglas verwechselt werden. Eine Beweglichkeit konnte von uns nur f¨ ur E.coli gesichert festgestellt werden, da diese sich relativ schnell und vor allem in verschiedene Richtungen bewegt haben.

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 10

2.2 Die Bakterielle Zellwand

Die bakterielle Zellwand bewirkt Festigkeit und Form der Zellen. Bakterien besitzen eine nur ihnen eigene Wandstruktur, deren Festigkeitverleihende Komponenete das Peptidoglykan oder Murein ist. Die Mureingrundstruktur wie auch der weitere Zellwandaufbau sind bei den einzelnen Bakteriengruppen verschieden. Die Bakterien lassen sich in zwei Gruppen differenzieren: in die Grampositiven und die Gram-negativen. Die Differenzierung beruht auf der von Gram 1884 eingef¨ uhrten F¨ arbung. Die Unterschiede im Wandaufbau bewirken, dass beim F¨ arben mit Kristallviolett und anschliessender Jodfixierung ein Komplex entsteht, der bei den Gram-negativen mit Ethanol extrahierbar ist, bei den Gram-positiven jedoch nicht. Gram-negative Bakterien k¨ onnen bei einer Gegenf¨ arbung mit Safranin ebenfalls sichtbar gemacht werden. Die gram-positiven Bakterien haben einen vergleichsweise einfachen Wandaufbau; die Zellwand besteht aus einer mehrschichtigen Peptidoglykanstruktur, in die Teichons¨ auren eingelagert sind. Die gram-negativen Bakterien besitzen eine komplexere Wandstruktur; ¨ uber der einschichtigen Mureinschicht liegt eine zweite, ¨ außere Membran, die durch das enzymhaltige Periplasma von der Mureinschicht getrennt ist. Die ¨ außere Membran besteht zum Teil aus Lipopolysaccariden (LPS), die beim Menschen eine toxische Wirkung haben.

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 11

2.2.1 Gram-F¨ arbung

Durchf¨ uhrung

Die Bakterien werden auf dem Objekttr¨ ager durch Hitzeeinwirkung fixiert (1). In diesem Zustand sind sie mikroskopisch noch nicht (gut) sichtbar. Danach erfolgt eine F¨ arbung mir Kristallviolett (2), durch die alle vorhandenen Bakterien blau gef¨ arbt werden (n.b. es gibt Ausnahmen, die den Farbstoff nicht oder nur schlecht aufnehmen, z.B. Mykobakterien). Nach Beizung mit Jod-Kaliumjodid und Entf¨ arbung (Differenzierung) mit Alkohol halten nur die Bakterien mit

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 12

mehrschichtigem Murein den Farbstoff zur¨ uck, die mit einschichtigem Murein geben ihn wieder ab (3). Um auch diese Bakterien sichtbar zu machen, verwendet man eine Gegenf¨ arbung (Safranin, Fuchsin)(4).

Daten und Ergebnisse

F¨ ur diesen Versuch wurden Proben von Staphylococcus aureus, Arthrobacter nicotinae und Pseudomonas fluoreszens verwendet. Sowohl bei Staphylococcus aureus als auch bei Arthrobacter nicotinae ließ sich unter dem Mikroskop ein violett gef¨ arbter Rand erkennen. Die Pseudomonas fluoreszens waren jedoch rot gef¨ arbt.

Abbildung 2.4: Beispiel eines grampositiven Bakteriums

Abbildung 2.5: Beispiel eines gramnegativen Bakteriums

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 13

So ergibt sich folgendes Ergebnis:

• Staphyloccocus aureus : grampositiv

• Arthrobacter nicotinae : grampositiv

• Die Pseudomonas fluoreszens : gramnegativ

Die erhaltenen Ergebnisse der Gram-F¨ arbung stimmen mit den Literaturwerten uberein. Da die Gram-F¨ arbung jedoch nicht immer aussagekr¨ aftig, ist werden ¨

auch andere Untersuchungsmethoden, wie der nachfolgend beschriebene KOH-Test, verwendet.

2.2.2 Test auf extrahierbare DNA (KOH-Test)

Auch dieser Test macht sich die Unterschiede in den Zellw¨ anden von grampositiven und gramnegativen Bakterien zunutze. So kann dieser Test das Ergebnis der Gram-F¨ arbung absichern. Dieser Versuch beruht darauf, dass die Zellwand von gramnegativen Bakterien d¨ unner ist als die der grampositiven. Sie l¨ asst sich deswegen mit 3%iger Kalilauge hydrolysieren. Die Aufl¨ osung der Zellwand erkennt man daran, dass die DNA als schleimiger Faden erkennbar ist. Durchf¨ uhrung

F¨ ur die Durchf¨ uhrung dieses Versuchs wird ein kleiner Klumpen Bakterienmaterial mit einer Impf¨ ose in 3% Kalilauge einger¨ uhrt. Wenn man die Impf¨ ose anschließend nach oben zieht und schleimige F¨ aden sichtbar sind, so ist der Test positiv und das Bakterium gramnegativ. Daten und Ergebnisse

F¨ ur diesen Versuch wurden die gleichen Bakterien untersucht wie f¨ ur die Gram-F¨ arbung. Die Ergebnisse des KOH-Tests best¨ atigen die der Gram-F¨ arbung. So ist Pseudomonas fluoreszens aufgrund seiner Fadenbildung gramnegativ w¨ ahrend Staphylococcus aureus und Arthrobacter nicotinae grampositiv sind.

2.3 Wachstum und Stoffwechsel von Bakterien

Die Vermehrung der Bakterien verl¨ auft in verschiedenen Wachstumsphasen. Nach Beimpfung erfolgt in der Anlauf- oder lag-Phase eine Anpassung an das Milieu. Daran schließt sich die exponentielle Wachstumsphase der Zellpopulation, auch als log-Phase bezeichnet, an. Durch N¨ ahrstoffverbrauch und Anh¨ aufung hemmender Stoffwechselprodukte kommt es zur Verz¨ ogerung des Wachstums in der station¨ aren Phase. In Abh¨ angigkeit von Art, Medium und Umweltbedingun- gen setzt nach unterschiedlicher Dauer die Absterbephase ein. Das Wachstum

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 14

von Bakterien ist von diversen Umweltbedingungen abh¨ angig, zu denen auch der im Praktikum untersuchte Einfluss von Sauerstoff geh¨ ort.

2.3.1 Aerobes/Anaerobes Wachstum

Ziel des Versuches war es, die Sauerstofftoleranz bzw. - Abh¨ angigkeit von Bacillus subtilis, E. coli und Clostridium Sporogenes zu untersuchen. Durchf¨ uhrung

0,1 ml der Keimsuspension wurden mit 10 ml fl¨ ussigem Agar gemischt und in jeweils drei Reagenzgl¨ aser abgef¨ ullt. Der Sauerstoffgehalt sinkt dabei im Agar nach unten hin ab. W¨ ahrend je eines dieser R¨ ohrchen aerob und anaerob bebr¨ utet werden, wird im dritten R¨ ohrchen der normale Agar zus¨ atzlich mit Wasseragar ¨ uberschichtet Dies erm¨ oglicht einen zus¨ atzlichen Sauerstoffabschluss. Auch die ¨ uberschichteten R¨ ohrchen werden aerob bebr¨ utet. Daten und Ergebnisse Diskussion

Bacillus subtilis als eindeutig strikt aerobe Bakteriengattung kann nur in Anwesenheit von Sauerstoff wachsen, weshalb man bei dem ¨ uberschichteten, also

fakultativ anaeroben, bzw. dem anaerob bebr¨ uteten Ansatz keinerlei Tr¨ ubung feststellen kann, die auf Wachstum schliessen l¨ asst. Auch im unteren Bereich des aerob bebr¨ uteten R¨ ohrchens tritt keine Tr¨ ubung auf, es diffundiert nicht ausreichend Sauerstoff durch den Agar. Es ist hier aber ein deutliches Wachstum auf der Oberfl¨ ache zu erkennen.

E. coli dagegen ist fakultativ anaerob, das Bakterium w¨ achst in allen drei R¨ ohrchen bei unterschiedlichen Sauerstoffpartialdr¨ ucken, was durch eine deutlich erkennbare Gasbildung unterstrichen wird.

Chlostridium sporogenes wiederum zeigt sich wie erwartet als strikt anaerob. In den aerob inkubierten R¨ ohrchen ist kaum Wachstum und nur eine schwache Gasbildung festzustellen. Im anaerob bebr¨ uteten Zustand ist eine schwache Tr¨ ubung erkennbar - ein Wachstum hat stattgefunden. Schwaches Wachstum allerdings, da die Bakteriensuspension bei den Versuchsvorbereitungen wahrscheinlich dem Luftsauerstoff zu lange ausgesetzt war, und dieser Umstand aufgrund fehlenden Cytochrom-Systems, bzw. Detoxifizierungssystems f¨ ur Sauerstoff, zum Absterben des Bakteriums f¨ uhren kann. Deshalb ist es auch seltsam, das sich auch im aerob beschichteten und unbeschichteten R¨ ohrchen Gasbl¨ aschen gebildet haben. Zwar baut Chlostridium teilweise Aminos¨ auren ab, wobei gasf¨ ormige Produkte wie Ammoniak, CO2 oder Wasserstoff entstehen k¨ onnen. Die Sauerstoffkonzentration im Agar sollte jedoch ausreichen, um ein Chlostridienwachstum zu verhindern. Eine m¨ ogliche Erkl¨ arung w¨ are eine Kontamination mit gasbildenden Bakterien.

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 15

2.3.2 Test auf Cytochrom Oxidase

Die aeroben Bakterien k¨ onnen in zwei Gruppen unterteilt werden, solche die Cytochrom (Cyt) c besitzen und solche, die kein Cyt c besitzen. Cyt c ist ein Protein und ¨ ubertr¨ agt Elektronen auf das terminale Enzym der Elektronen-transportkette, Cytochrom c Oxidase. Beim Oxidase-Test wird auf das Vorhandensein des Cytochrom c Oxidase-Systems getestet. Der Farbstoff Tetramethylp-phenylendiamin (TMPD), der in seiner reduzierten Form farblos ist, wird bei Anwesenheit von Cyt c oxidiert und ¨ andert seine Farbe, er wird blau.

Durchf¨ uhrung

Ein kleiner Teil der ausgew¨ ahlten Kolonie von der Agarplatte wird auf ein TMPDgetr¨ anktes Filterpapier (Oxidase-Teststreifen) gerieben und die Farbbildung beobachtet. Daten und Ergebnisse

Wir haben Listeria innocua, Staphylococcus aureus und Pseudomonas fluoreszens getestet. L. innocua und S. aureus waren negativ, die Testfelder verf¨ arbten sich nicht. P. fluoreszens wurde eindeutig dunkelblau. Diskussion

Die erhaltenen Ergebnisse stimmen mit den auf der Anleitung zu den Teststreifen angegebenen Erwartungen ¨ uberein. Listeria innocua und Staphylococcus au-

reus besitzen demnach im Gegensatz zu P. fluoreszens keine katalytisch aktive Cytochrom-Oxidase.

2.3.3 Katalase Test

Beim aeroben Stoffwechsel entstehen unausweichlich reaktive Sauerstoff-Spezies, wie das Superoxid-Anion (O 2 ), Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) oder das Hydroxyl-Radikal (OH). Aerobe Organismen brauchen also auf der einen Seite O 2 f¨ ur die Atmung, auf der anderen Seite m¨ ussen sie mit der Reaktivit¨ at dieses Molek¨ uls fertig werden. Dazu haben viele Bakterien Schutzmechanismen, wie Detoxifizierungsmechanismen, entwickelt. H 2 O 2 kann durch enzymatische oder nicht-enzymatische Reaktionen entstehen. Das Enzym Katalase ¨ uberf¨ uhrt H 2 O 2

KAPITEL 2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN 16

durch Dismutation in O 2 und H 2 O: 2H 2 O 2 ⇒ 2H 2 O + O ² Durchf¨ uhrung

Wasserstoffperoxid (10%ige L¨ osung) wird auf eine Kolonie getropft und beobachtet, ob es zu einer Gasbildung (Sch¨ aumen) kommt. Daten und Ergebnisse

Wir haben Arthrobacter nicotianae, Staphylococcus aureus und Listeria innocua zur Untersuchung benutzt. Bei allen dreien war Bl¨ aschenbildung zu beobachten. Dies stimmt mit der Tatsache ¨ uberein, dass alle drei Sauerstoff zur

Energiegewinnung benutzen (Listeria aerob, Staphylococcus fakultativ anaerob, Arthrobacter aerob) und damit eine M¨ oglichkeit zur Entsorgung des Peroxids brauchen.

Kapitel 3

Isolierung von

Mikroorganismen

Zur Isolierung oder Anreicherung von Mikroorganismen bestimmter Gruppen aus Mischkulturen macht man sich unter anderem die jeweiligen Stoffwechseleigenschaften, Resistenzen oder andere spezifische Anpassungen zu Nutze. Bei den folgenden Versuchen wurden die verschiedenen selektiven Bedingungen durch den Einsatz spezieller N¨ ahrmedien mit geeigneten Zus¨ atzen sowie unterschiedlichen Inkubationstemperaturen geschaffen. Die Gesamtkeimzahl einer Probe wird auf dem nicht selektiven Vollmedium Plate Count-Agar (PC-Agar) bestimmt.

3.1 Enterobakterien und Coliforme Keime

Mit dem ¨ Uberbegriff Enterobakterien fasst man eine große Gruppe gramnegativer, st¨ abchenf¨ ormiger Bakterien zusammen, die sich durch einen fakultativ anaeroben Stoffwechsel auszeichnen. K¨ onnen sie zudem unter Gasbildung Lactose verg¨ aren, spricht man von coliformen Keimen, die als Indikator f¨ ur Hygiene und technische Sorgfalt dienen.

Der Nachweis coliformer Keime erfolgt durch Anreicherung in doppelt konzentierter Lactose-Pepton-Bouillon und durch Oberfl¨ achenausstrich auf Kristallviolett-Galle-Laktose-Agar (VRB-Agar). Bei Kontamination der Probe mit coliformen Keimen tritt in Laktose-Pepton-Bouillon Gasbildung (Nachweis: Durham-R¨ ohrchen) sowie Farbumschlag durch S¨ aurebildung auf. VRB-Agar hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien durch Gallensalze und Kristallviolett. Zudem sind die Kolonien coliformer Keime an einer violetten F¨ arbung und einem Hof von Gallensalzen zu erkennen.

17

KAPITEL 3. ISOLIERUNG VON MIKROORGANISMEN 18

Ziel der Versuche war die ¨ Uberpr¨ ufung einer Hackfleischprobe auf Kontamination mit coliformen Keimen mit Hilfe der Anreicherung in doppelt konzentrierter Laktose-Pepton Bouillon sowie durch Direktansatz auf VRB-Agar.

3.1.1 Nachweis coliformer Keime durch Anreicherung in doppelt konzentrierter Laktose-Pepton Bouillon

Durchf¨ uhrung

In diesem Versuch sollte ermittelt werden, ob die vorliegende Hackfleischprobe coliforme Keime enthielt und somit vielleicht eine F¨ akalkontamination vorlag. Die Hackfleischprobe wurde zun¨ achst im Stomacher homogenisiert und 10g in 90 mL PBS verd¨ unnt. Daraufhin wurde eine Verd¨ unnungsreihe bis -6 erstellt. 5 mL der Verd¨ unnungen wurden in 5 mL doppelt-konzentrierte Laktose-Pepton Bouillon in Reagenzgl¨ aser mit Durham R¨ ohrchen gegeben. Die R¨ ohrchen wurden 24 Stunden bei 37 ^◦ C bebr¨ utet. Bei Gasbildung im Durham R¨ ohrchen und einem Farbumschlag von violett nach gelb wird der Test als positiv bewertet. Daten und Ergebnisse

Alle angesetzen Verd¨ unnungsreihen konnten als positiv gewertet werden, da sowohl ein Farbumschlag von violett nach gelb als auch Gasbildung vorlag. Diskussion

Der durchgehende Farbumschlag sowie die teilweise sehr starke Gasbildung zeugen von einer deutlich messbaren Kontamination der Hackfleischprobe mit coli-formen Keimen. Angesichts der l¨ angeren Lagerung der Probe bei Raumtemperatur ist das Ergebnis nicht unbedingt außergew¨ ohnlich.

3.1.2 Nachweis coliformer Keime durch Direktansatz auf VRB Agar

Aus einer homogenisierten Hackfleischprobe (vgl. 3.1.1.) soll die Zahl der coliformen Keime ¨ uber den Selektivagar VRB in Relation zur Gesamtkeimzahl (PC) bestimmt werden. Die isolierten Enterobakterien werden in einem sp¨ ateren Versuch (4.1.) biochemisch identifiziert. Durchf¨ uhrung

Je 0,1 ml der Verd¨ unnungen -1 bis -6 werden auf selektivem VRB-Agar (Enterobakterien) und auf PC-Agar (Gesamtkeimzahl) ausgestrichen. Die Platten werden bei 37 ^◦ C bebr¨ utet und nach 24 bzw. 48h die Koloniezahl bestimmt. Daten und Ergebnisse

Der ermittelte Wert f¨ ur die Gesamtzellzahl betr¨ agt 1, 04 · 10 ⁸ Cfu/ml. Auf dem VRB-Agar wuchsen zwei verschiedene Kolonietypen unterschiedlicher Morpho- logie. Der Großteil waren rot-violette Kolonien. Einen maßgeblichen Anteil, ca.

KAPITEL 3. ISOLIERUNG VON MIKROORGANISMEN 19

20%, nahmen aber auch weiße Kolonien ein. Die Keimzahl der dort gewachsenen Kolonien betrug 5, 64 · 10 ⁶ cfu/ml. Diskussion

Es ist deutlich zu erkennen, dass die Koloniezahlen auf PC-Agar deutlich h¨ oher liegen als auf VRB-Agar. Dies zeigt, dass auf VRB-Agar nicht alle Bakterien wachsen k¨ onnen, sondern nur ein geringer Anteil dessen. Es wachsen zwar auch einige Schimmel und Hefen recht gut auf VRB-Agar, hierf¨ ur ist die Inkubationszeit jedoch zu kurz. Die Kolonien auf PC-Agar waren durchwegs weißlich bis transparent und somit nicht unterscheidbar, w¨ ahrend die auf VRB-Agar gewachsenen Kolonien deutlich in zwei Gruppen unterschieden werden konnten. Deutlich zu erkennen waren die violett gef¨ arbten Kolonien, der Farbumschlag weist auf lokale Ans¨ auerung des Agars und somit auf S¨ aurebildung durch Lactoseverg¨ arung hin. Im Gegensatz dazu weißliche Kolonien, bei denen kein Farbumschlag und somit auch keine S¨ aurebildung erfolgte; diese w¨ aren vermutlich als nicht coliforme Bakterien identifizierbar. Violett gef¨ arbte Kolonien ließen zudem teilweise einen Hof, gebildet durch ausgef¨ allte Gallensalze, erkennen. Eine der als coliform identifizierten, violett gef¨ arbten Kolonien, wurde anschliessend mit dem BBL Enterotube weiter untersucht.

3.2 Sporenbildener

3.2.1 Endosporen aerober Sporenbildner

Manche Bakterien, darunter auch Vertreter der Bacillus cereus-Gruppe, k¨ onnen Sporen ausbilden. Sporen haben einen sehr geringen Wassergehalt, daher k¨ onnen sie auch sehr hohe Temperaturen ¨ uberstehen. Aerobe Sporenbildner sind immer

gram-positive St¨ abchen. Da Endosporenbildner vor allem im Boden vorkommen, wird eine Bodenprobe auf aerobe Sporenbildner untersucht und diese isoliert. Durchf¨ uhrung

Die Bodenprobe wird in PBS verd¨ unnt und 10 Minuten bei 80 ^◦ C gehalten. Dadurch werden die Vegetativen Zellen abget¨ otet. Die Sporen bleiben aber, aufgrund ihrer hohen Hitzeresistenz, erhalten und k¨ onnen auf Agar wachsen. Somit d¨ urften alle sp¨ ater wachsenden Kolonien aus Endosporen entstanden sein. Zum Nachweis von Bacillus cereus werden die Verd¨ unnungsstufen -3 bis -6 auf dem selektiven N¨ ahrboden PEMBA ausgebracht. Zus¨ atzlich werden die Stufen -3 bis -7 auf den nicht-selektiven PC Agar aufplattiert. PEMBA steht f¨ ur Polymyxin-Eigelb-Mannit-Bromthymolblau-Agar. Das Polymyxin ist ein Antibiotikum gegen gramnegative Bakterien. Eine positive Eigelbreaktion zeichnet speziell die Bacillus cereus-Gruppe aus. Hierbei wird Lezithin zu 1,2-Diacylglycerid und Physphorylcholin hydrolysiert. Dies ergibt eine Eigelb-Pr¨ azipitation, die als Hof um die Kolonie erkennbar ist. Das Mannit wird

KAPITEL 3. ISOLIERUNG VON MIKROORGANISMEN 20

von B. cereus nicht verstoffwechselt. B. cereus betreibt statt dessen Proteolyse, was zu einer Alkalisierung des Mediums f¨ uhrt und durch einen Farbumschlag des Bromthymolblau zu t¨ urkis angezeigt wird. Daten und Ergebnisse

Nach 48 h wurde die von ausw¨ arts geholte und letztendlich ausgestrichene Bodenprobe ausgewertet: es war nichts gewachsen, weder auf PC noch auf PEMBA - Agar. M¨ oglicherweise waren die Bodenproben sporenfrei, vielleicht war auch der Verd¨ unnungsansatz falsch gew¨ ahlt. Jedenfalls wurde der Versuch mit ¨ Ande-

rungen wiederholt: diesmal wurde eine - neue - Bodenprobe von ausserhalb ohne vorherige Verd¨ unnung bzw. Vorbehandlung auf PEMBA-Agar ausgestrichen. Bereits nach einem Inkubationstag zeigten sich auf den Platten ineinander verwachsene hell- und dunkelgr¨ une Kolonien, teilweise mit weißen Schlieren an der Oberfl¨ ache. Diskussion

Die Kolonien waren leider nicht ausz¨ ahlbar, allerding erhielten wir so einen Eindruck davon, wie Sporenbildner auf PEMBA-Agar aussehen. Nach Auskunft unserer Betreuer handelt es sich bei den hellgr¨ unen Kolonien um Kolonien des Bacillus cereus. Die dunkelgr¨ unen mycelartigen Kolonien werden durch Bacillus mycoides hervorgerufen

3.3 Schimmelpilze und Hefen

Bei diesem Versuch werden Schimmel und Hefen aus einem Blauschimmelk¨ ase isoliert. Um Sporen und Keime zu erhalten, m¨ ussen diese aus dem K¨ ase gewonnen werden. Dazu wird der K¨ ase mit Citratpuffer aufgeschlossen. Schimmel und Hefen sind Eukaryonten und geh¨ oren zu der Gruppe der Pilze. Wie alle anderen Pilze sind auch Hefen und Schimmel weit verbreitet. Das besondere an ihnen ist, dass sie ganz im Gegensatz zu Bakterien auch bei einem pH-Wert von 3-4 uberleben und wachsen k¨ onnen. ¨

3.3.1 Isolierung von Schimmelpilzen und Hefen

Zur genauen Bestimmung der Hefen- und Schimmelzahl wird die Suspension auf YGCB-Agar (Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Bromphenolblau-Agar) ausgestrichen. YGCB-Agar wird deshalb verwendet, da Chloramphenicol als Breit-bandantibiotikum sowohl gegen gram-positive, als auch gram-negative Bakterien wirkt. Unter dem Oberbegriff Hefen sind mehrere Arten zusammengefasst, die jedoch unterschiedlich in der Umsetzung verschiedener Stoffe sind. Einer dieser Stoffe ist Bromphenolblau, der zur Differenzierung der unterschiedlichen Hefear- ten herangezogen wird. Die aus Blauschimmelk¨ ase und Citratpuffer bestehende

KAPITEL 3. ISOLIERUNG VON MIKROORGANISMEN 21

Suspension wurde im Stomacher homogenisiert. Danach wird eine Verd¨ unnungsreihe angelegt. Die Verd¨ unnungen -2 bis -5 werden auf YGCB-Agar ausplattiert. Die Platten werden danach f¨ ur 3-5 Tage bei 27 ^◦ C aerob bebr¨ utet. Daten und Ergebnisse

Die erste Ausz¨ ahlung fand nach 48 Stunden statt. Die Kolonien auf den Platten waren noch sehr klein, Hefe- und Schimmelkolonien waren klar zu trennen. Die Ausz¨ ahlung am ersten Tag (Verd¨ unnungsstufen -3/-4 waren ausz¨ ahlbar) ergab eine Gesamtkeimzahl von 2050 KbE/Probe und damit 102,5 KbE/g K¨ ase. Nach dem dritten Tag wurden erneut die Kolonien ausgez¨ ahlt, wobei nur eine geringe Zunahme der Kolonien zu verzeichnen war. Dabei wurde eine Gesamtkeimzahl von 2600 KbE/Probe und somit 130 KbE/g K¨ ase ermittelt, allerdings hatten sich die Schimmelkolonien schon so sehr ausgebreitet, dass z.T. nicht mehr alle Hefekolonien erkannt und gez¨ ahlt werden konnten. Am vierten Tag war daher keine weitere Ausz¨ ahlung mehr m¨ oglich, auch nicht bei der h¨ ochsten Verd¨ unnungsstufe. Diskussion

Dieser Versuch veranschaulicht, dass die Inkubationsdauer von der Art der Keime abh¨ angt. Will man die Gesamtkeimzahl ermitteln, so muss man die Inkubationsdauer so w¨ ahlen, dass alle Keime gen¨ ugend Zeit hatten sichtbare Kolonien zu bilden. Hier sind die Hefekulturen schneller als die Schimmelkolonien gewachsen, die nach 24 Stunden nur bei genauem Hinsehen zu erkennen waren. Ebenfalls h¨ angen die ermittelten Keimzahlen sehr von der Entnahmestelle der Probe ab. Sie ist somit nur als Anhaltspunkt und nicht als Absolutwert zu betrachten

3.4 Nachweis von Chlostridien

Chlostridien sind strikt anaerobe Bakterien, die vor allem im Boden vorkommen. Die Gattung Chlostridium wird nach Art des umgesetzten Substrats weiter unterteilt; es gibt Arten, die Kohlenhydrate als Substrat nutzen k¨ onnen, andere nutzen Aminos¨ auren, wieder andere k¨ onnen beide nutzen. Da dabei Gas entsteht, kann Gasbildung bei anaerober Inkubation nach Hitzedeaktivierung vegetativer Zellen als Indikator f¨ ur die potentielle Anwesenheit von sporenbildenden Chlostridien verwendet werden. Hinzu kommt, dass starkes Erhitzen die vorhandenen Sporen hitzeaktiviert.

3.4.1 Nachweis von Chlostridien im Weinzierl-Test)

Der Weinzierl-Test, bei dem die zu untersuchende Rohmilchprobe in mit Paraffin gef¨ ullte R¨ ohrchen gef¨ ullt wird, kann diese vorhergehenden Bedingungen erf¨ ullen.

KAPITEL 3. ISOLIERUNG VON MIKROORGANISMEN 22

Das R¨ ohrchen wird f¨ ur 15 min auf 85 ^◦ C erhitzt, wobei das Paraffin schmilzt, an die Oberfl¨ ache steigt und so einen luftdichten Verschluss bildet. Entsteht w¨ ahrend der Inkubation Gas unter dem Paraffinpfropfen, so deutet dies auf die Anwesenheit von Chlostridien hin. Ziel dieses Versuches ist es also, eine Umweltprobe, in unserem Fall Rohmilch, mit einfachen Mitteln auf Befall mit Chlostridium zu untersuchen. Durchf¨ uhrung

Von der zu untersuchenden Umweltprobe, in diesem Fall Rohmilch, wurde eine Verd¨ unnung bis -3 hergestellt. Je 5 ml dieser Verd¨ unnung wurden in Paraffin enthaltene Reagenzgl¨ aser gegeben und bei 85 ^◦ C f¨ ur 15 Minuten erhitzt. Anschliessend wurden die Proben bei 37 ^◦ C f¨ ur mehrere Tage inkubiert und fortlaufend die Gasbildung kontrolliert. Daten und Ergebnisse

In allen Reagenzgl¨ asern war letztendlich eine Gasbildung zu erkennen, wobei sie sich in der St¨ arke unterschied: Die Probe zeigte mittlere bis starke, die Verd¨ unnungen nur leichte bis wenige Gasbildung. Diskussion Das Ergebnis ist kein eindeutiger Beweis f¨ ur die Anwesenheit von Chlostridien, es kann sich auch um gas- und sporenbildende, fakultativ anaerobe Bacillus- Artenhandeln. Der Verdacht auf Chlostridien ist in jedem Fall best¨ atigt, um einen eindeutigen Nachweis zu erbringen, m¨ ussen andere Methoden angewendet werden.

Kapitel 4

Identifizierungsmethoden

f ¨ ur Mikroorganismen

Die taxonomische Identifizierung von Mikroorganismen erfolgt mittels genetischer, biochemischer oder immunologischer Methoden. Die beiden letzteren werden im Praktikum durchgef¨ uhrt.

4.1 Biochemische Identifizierung

Bei der biochemischen Identifizierung von Mikroorganismen macht man sich die art- und gattungsspezifischen Stoffwechseleigenschaften, die genetisch determiniert sind, zu nutze. Die Indikation erfolgt anhand von Farbstoffbildung oder Farbumschlag in geeigneten Medien.

4.1.1 Identifizierung von Gram-negativen (Entero) Bakterien mit dem Testsystem BBL Enterotube II

Ziel des Versuches ist die Identifizierung von gram-negativen Enterobakterien mit dem kommerziellen Testsystem BBL Enteotube II. Untersucht wurden die violetten Kolonien aus Versuch 3.1, die auf VRB-Agar gewachsen sind. Durchf¨ uhrung

Eine der erw¨ ahnten Einzelkolonien aus Versuch 3.1 wird mittels der Impfnadel des Testsystems aufgenommen und in alle Kammern des Enterotube eingebracht. Vorraussetzung f¨ ur die Identifizierung sind gram- und oxidase-negative Keime, darauf wurde vorher noch einmal getestet. Nach einer Inkubationszeit

23

KAPITEL 4. IDENTIFIZIERUNGSMETHODEN F ¨ UR MIKROORGANISMEN24

von 24h und Zugabe von Kovacs-Reagenz in die Indol-Kammer wurde das Ergebnis abgelesen, wobei jede Kammer einzeln auf eine Farb¨ anderung gepr¨ uft wurde. Die Einzelreaktionen werden in der Beschreibung des Testsystems detailliert beschrieben. Anhand der positiven Ergebnisse wurde ein f¨ unfstelliger Zahlencode, der den Organismus identifiziert, ermittelt. Auswertung

Die Identifizierung ergab folgende Ergebnisse f¨ ur die Einzelreaktionen und den f¨ unfstelligen Schl¨ usselcode:

Der ermittelte Bakterienstamm zeigt ein sinnvolles Ergebniss. Das identifizierte Bakterium hafnia alvei ist ein E.Coli-verwandter Mikroorganismus und eindeutig coliform. Ein von uns ermitteltes Vorkommen an Salmonellen in der Hackfleischprobe ist zwar unerfreulich, aber durchaus denkbar. Durch die nicht eindeutige F¨ arbung der Lysinkammer war jedoch keine genaue Auswertung m¨ oglich.

4.2 Immunologische Identifizierung

Mittels des Latex-Agglutinationstests soll ein isolierter staphylococcus Stamm aus der Mundschleimhaut n¨ aher charakterisiert werden. Der immunologische Nachweis erm¨ oglicht die spezifische Abgrenzung des gesuchten staphylococcus aureus von anderen St¨ ammen wie beispielsweise dem Kontrollstamm staphylococcus epidermis. Der Test auf staph. aureus basiert auf drei Reaktionen der mit Antik¨ orpern gecoateten Latexpartikel. Die Antik¨ orper binden bei Pr¨ asenz von Protein A auf der Bakterienh¨ ulle bzw. von Coagulase bzw. von Kapselpolysacchariden. Es entstehen sichtbare ” Klumpen“.

KAPITEL 4. IDENTIFIZIERUNGSMETHODEN F ¨ UR MIKROORGANISMEN25

Bei einem Mund- oder Nasenschleimhautabstrich entnommene Keime wurden im Versuch nach Inkubation auf Baird-Parker-Agarplatten mittels Latex-Agglutinationstest auf Staphylococcus aureus getestet. Durchf¨ uhrung

Man verreibt Material der fraglichen Kolonie mit einem Tropfen Plasma auf einem Objekttr¨ ager. Im positiven Fall tritt sehr schnell, meist schon w¨ ahrend des Verreibens, Klumpenbildung infolge Bindung von Fibrinogen an den Fibrino-genrezeptor der Keime ein. Zum Ausschluß einer ” Spontanagglutination“ wird

als negative Kontrolle physiolog. Kochsalzl¨ osung anstelle von Plasma mit etwas Keimmaterial verrieben. Diese Kontrolle muß eine homogene Tr¨ ubung zeigen.

Daten und Ergebnisse

Die Reaktion auf die Kontrollsubstanz verlief bei beiden Ans¨ atzen negativ. Eine m¨ ogliche Autoagglutination der Kolonien konnte somit ausgeschlossen werden. Der Kontrollstamm rief erwartungsgem¨ aß keine Reaktion mit dem Agenz hervor, wohl aber die Testkolonie. Es war eine eindeutige Verklumpung im angegebenen Zeitrahmen erkennbar. Diskussion

Anhand der Ergebnisse l¨ asst sich der isolierte Stamm anschaulich als Staphylococcus aureus einstufen. Teilweise tauchten schwarze Teilchen in den L¨ osungen auf, die aber auf Rußpartikel, die sich von der Impf¨ ose gel¨ ost hatten, zur¨ uckzuf¨ uhren waren und sich deutlich von der eindeutigen Verklumpungsreaktion unterscheiden ließen.

Kapitel 5

Bakterielle Viren

Bakteriophagen sind Viren, die ausschließlich Bakterien als Wirtszellen befallen und sich in diesen vermehren. Der Wirtsbereich eines Phagen ist sehr beschr¨ ankt, da auf Grund spezifischer Rezeptoren auf der Bakterienoberfl¨ ache jeder Phage nur bestimmte Bakterienspezies infizieren kann. Diese Phagenrezep-toren sind sogar innerhalb einer serologischen Gruppe einer Bakterienspecies unterschiedlicher Natur. Mit Hilfe der Bakteriophagen lassen sich die Serotypen der Bakterienspezies in weitere Untertypen unterteilen (Phagentypisierung, Lysotypie). Nach Infektion der Bakterienzellen mit einem Phagen findet innerhalb der Bakterien eine Synthese neuer Phagen statt und die Wirtszelle wird anschließend lysiert. Es entsteht dadurch im Bakterienrasen ein makroskopisch sichtbares Loch, ein sogenannter Plaque.

5.1 Isolierung von Bakteriophagen aus der Umwelt

Aus einer Wasserprobe werden Bakteriophagen isoliert. Diese werden mit Wirtsbakterien vermischt und danach ¨ uber die Anzahl der gebildeten Plaques, die Gesamtzahl der Bakteriophagen in der Probe berechnet. Durchf¨ uhrung

Die Wasserprobe war bereits steril filtriert, als wir sie bekommen haben. Anschließend wurden jeweils 0,1 ml der vorher bis -4 verd¨ unnten Proben mit 0,2 ml Wirtsbakterienl¨ osung in einem Reaktionsgef¨ aß gemischt und f¨ ur 15 min inkubiert. Dem Gemisch wurde dann Weichager zugegeben, gemischt und auf eine PC - Agarplatte gegossen. Nach Erkalten wurden die Platten ¨ uber Nacht bei

37 ^◦ C inkubiert. Am n¨ achsten Tag wurden die Phagen ausgez¨ ahlt und die Anzahl

26

KAPITEL 5. BAKTERIELLE VIREN 27

an den Wirt lysierende Phagen in der Probe berechnet. Daten und Ergebnisse

Es war nur eine Ausz¨ ahlung der Verd¨ unnung -4 m¨ oglich. Dort haben wir 1, 05 · 10 ⁷ PfU/ml festgestellt. Diskussion

In unserer Probe waren geeignete Phagen vorhanden. Wahrscheinlich ist die angenomme Anzahle der PfU/ml noch viel h¨ oher, denn es k¨ onnen w¨ ahrend des Versuchsablauf Fehler auftreten:

• Die Differenz k¨ onnte durch schlechtes Vermischen der Verd¨ unnungen bei verursacht werden.

• Bei den Proben k¨ onnte der Weichagar bei Zugabe der Phagen noch zu heiß gewesen sein, somit w¨ aren einige Bakterien und Phagen abgestorben.

Kapitel 6

DNA-Transfertechniken

Die Rekombination bei prokaryotischen Organismen findet durch die parasexuellen Vorg¨ ange Transduktion, Transformation und Konjugation statt. Dabei findet auf jeweils unterschiedliche Weise die ¨ Ubertragung von DNA auf einen Rezipienten statt.

6.1 Transduktion von Bioluminiszenz durch den

modifizierten Listeria Bakteriophagen A511 : : luxAB

Unter Transduktion versteht man die ¨ Ubertragung genetischen Materials auf

eine Rezipientenzelle durch Bakteriophagen. Eingesetzt wird der gentechnisch konstruierte Listeria - Phage A511::luxAB. Er zeichnet sich durch ein breites Lysespektrum aus. Zus¨ atzlich besitzt das Phagengenom die Luciferase-Gene lux A und lux B als Fusionsprodukt, die in einen Bereich starker Exprimierung eingef¨ uhrt worden sind. Im Verlauf der Phageninfektion kommt es zun¨ achst zur Transduktion des lux-AB-Gens und in der Folge zur Exprimierung der Luciferase. Das Enzym Luciferase katalysiert die im Skript wiederzufindende Bioluminiszenz-Reaktion der Oxidation eines langkettigen Aldehydes und eines Flavinmononukleotides. Bei der Reaktion wird Licht der Wellenl¨ ange 495 nm emittiert, was man sich f¨ ur den Nachweis der Transduktion im Luminometer zu Nutze macht. Ein Gemisch der Phagensuspension und der Bakterienkultur wird bei 20 ^◦ C inkubiert. Im Luminometer kommt es zur Injektion von Nonanal und anschließend zur Messung der ausgesandten Photonen. Durchf¨ uhrung

Auf 100 µl Phagenl¨ osung werden 1 ml frisch gezogener Listeria-Suspension ge-

28

KAPITEL 6. DNA-TRANSFERTECHNIKEN 29

geben und ¨ uber einen Zeitraum von 0-160 min alle 40 min die Zeitwerte aufgenommen. Die Inkubation erfolgt bei 20 ^◦ C. Die Messung der emittierten Lichtwellen wurde in einem Photomultiplier, der das Aldehyd Nonanal automatisch hinzuf¨ ugt, durchgef¨ uhrt. Daten und Ergebnisse

Diskussion Die Kurve im Diagramm entspricht unseren Erwartungen. Nachdem in den ersten 45 min kaum Ver¨ anderungen zu messen sind, kommt es ab diesem Zeitpunkt zun¨ achst zu einer exponentiellen Zunahme derLichtemission. Dann steigt die Lichtemission weiter an, w¨ achst jedoch nicht mehr exponentiell.

KAPITEL 6. DNA-TRANSFERTECHNIKEN 30

Der Grund f¨ ur die nur geringe ¨ Anderung der Biolumineszenz zu Beginn ist die

Latenzzeit der Phagen. Erst nach Ende der Latenzzeit ist eine richtige Erh¨ ohung der Biolumineszenz zu beobachten. Diese Zunahme steht in direktem Zusammenhang mit der Expression von Phagengenen. Der Befall der Bakterienzellen mit Phagen geschieht sehr schnell. Die Gene der Phagen werden jedoch zun¨ achst stark in ihrer St¨ uckzahl vermehrt bevor sie exprimiert werden, d.h. bevor u.a. Luciferase produziert wird. Liegt das fertige Enzym, also die Luciferase, vor, so steigt die Biolumineszenz stark an. Nach Ende der Latenzzeit werden zudem die infizierten Zellen lysiert und Phagen freigesetzt. Diese Phagen k¨ onnen weitere Zellen infizieren, wodurch es schließlich zu einem weiteren Anstieg der Biolumineszenz kommt.

Das Abflachen des Anstiegs ist wohl darauf zur¨ uckzuf¨ uhren, das bereits die Mehrzahl an Bakterien zerst¨ ort wurde, und daher nur wenige Bakterien neu infiziert werden k¨ onnen.

Ein Abfallen der Kurve w¨ urde erst bei einer deutlich l¨ angeren Messung sichtbar werden.

6.2 Transformation von E.coli mit pGreenTIR

Der Vektor pGreenTIR soll in CaCl2-kompetente E.coli transformiert werden. Der Expressionsvektor besteht aus einem pUC18 backbone und beinhaltet ein Ampicillin-Resistenzgen, sowie das gfp-Gen (gfp = green fluoreszenz protein). Die Fluoreszenz nach einer erfolgreichen Transformation kann unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Durchf¨ uhrung

200 µl eines CaCl2-kompetenten Glycerinstocks werden vorsichtig auf Eis aufgetaut, mit 1µl der gew¨ unschten Plasmid-DNA versetzt, vorsichtig gemischt und f¨ ur 30 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wird f¨ ur 90 sec. einem Temperaturschock von 42 ^◦ C ausgesetzt, 800 µl nicht selektives SOC-Medium hinzugef¨ ugt und zur Ausbildung der Antibiotikaresistenz bei 37 ^◦ C inkubiert. Nach 45 min Inkubation wird eine Verd¨ unnungsreihe bis 10 ⁻⁶ in 900 µl LB erstellt. Je 0,1 ml der Verd¨ unnungen 10 ⁻¹ und 10 ⁻² werden auf LBAmp bzw. 10 ⁻⁵ nd 10 ⁻⁶ auf LB ausgespatelt. Daten und Ergebnisse

Die LBAmp-Platten wurden im Dunkelraum unter UV-Licht betrachtet. Keine der Platten zeigte Fluoreszenzeigenschaften, es konnte daher keine Berechnung der Transformationsh¨ aufigkeit stattfinden. Diskussion

Es hat keine Transformation stattgefunden. Entweder waren die Zellen nicht kompetent, und haben somit den Vektor nicht aufnehmen k¨ onnen, oder aber es

KAPITEL 6. DNA-TRANSFERTECHNIKEN 31

waren einfach zu wenige, die aufgrund der Verd¨ unnung nicht auf der ausgestrichenen Platte ber¨ ucksichtigt wurden.

6.3 Konjugation

Der Versuch ist eine Kombination aus Konjugation und Transposon-Mutagenese. Zur Konjugation bef¨ ahigte Zellen besitzen Transfergene und k¨ onnen Kontakt zu anderen Zellen aufnehmen und DNA (im vorliegenden Fall das Plasmid pUT-Km2-lux) auf sie ¨ ubertragen. Die Konjugation ist die effizienteste Methode der DNA- ¨ Ubertragung. Das Plasmid pUT-Km2-lux besitzt jedoch keinen eigenen ORI, sondern ist zur Replikation auf die Existenz des -Gens angewiesen. Daf¨ ur besitzt es aber das Tn5-Transposon, das eine Integration des Plasmids in das Bakteriengenom des Wirtes erm¨ oglicht (Transposon-Mutagenese). Ferner tr¨ agt es eine Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin und die komplette lux-Einheit (A-E Untereinheiten vorhanden). Das luxAB-Gen besitzt keinen eigenen Promotor und ist daher nur bei einem Einbau nach einer Promotorsequenz in richtiger Leserichtung aktiv. Die CDE-Untereinheiten (bei der Transduktion nicht vorhanden vgl. 6.1.) codieren f¨ ur einen Fetts¨ aure-Reduktase-Komplex der die Synthese langkettiger Aldehyde bewirkt, die als Substrat f¨ ur die Luciferase zur Verf¨ ugung stehen. Durchf¨ uhrung

5 Kolonien Donorstamm (Km-Resistenz) werden mit ca. 20 Kolonien Akzeptorstamm (Tet-Resistenz) auf einem etwa Euro-großen Bereich einer PC-Agarplatte vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 6h bei 37 ^◦ C wird der entstandene Rasen aufgenommen und in 1 ml LB resuspendiert. 100 µl der unverd¨ unnten L¨ osung und 10 ⁻⁴ − 10 ⁻⁶ Verd¨ unnungen werden auf LB Tet/Kan ausplattiert und kultiviert. Der Zusatz beider Antibiotika gew¨ ahrleistet, das nur Zellen mit eingebautem Transposon bis zu station¨ aren Phase wachsen. Daten und Ergebnisse

Bei der Lumineszenzmessung ergab sich eine sehr starke Leuchtkraft einer Kolonie, von der ein Reinigungsausstrich angefertigt wurde. Eine erneute Messung des Einzelausstrichs zeigte gar eine subjektiv noch verst¨ arkte Luciferase-Aktivit¨ at. Diskussion

Die im Vergleich mit anderen Gruppen extrem hohe Luciferaseaktivit¨ at l¨ asst auf die Insertion der lux-Einheit nach einem starkem Promotor schließen. Die aufgenommene Lumineszenz ist jedoch auch abh¨ angig von der Dichte des Bewuchs. Bei zu dichtem Bewuchs fehlen N¨ ahrstoffe, dies resultiert in einer Abnahme der Lumienszenz . Ansonsten summiert sich die Lumineszenz benachbarter Kolonien. Eine Berechnung der Effizienz war, aufgrund der gew¨ ahlten Versuchspara- meter nicht m¨ oglich.

KAPITEL 6. DNA-TRANSFERTECHNIKEN 32

Abbildung 6.3: Leuchtende Bakterien auf einer Agarplatte

Kapitel 7

Mikroorganismen als

Modellorganismen

7.1 Mutation und Abt¨ otung

Wenn Mikroorganismen UV-Strahlung ausgesetzt werden, wird der Zellkern so ver¨ andert, dass eine Zellteilung unm¨ oglich wird, was folglich die Reproduktion verhindert oder die Zellen bei zu hoher Strahlendosis aufgrund der zahlreichen DNA-Defekte absterben l¨ asst. Im folgenden Versuch sollen die Auswirkung von UV-Strahlung anhand der zeitlich unterschiedlichen Bestrahlung von E. coli veranschaulicht werden. Durchf¨ uhrung

20 ml Bakteriensuspension wird mit doppelter Menge PBS vermischt, davon werden jeweils 1 ml in zwei Petrischalen gegeben. Nun werden die Bakterien mit UV-Licht bestrahlt, in unserem Fall f¨ ur 10, bzw. 17 sec. Anschliessend werden die davon erzeugten Verd¨ unnungreihen bis -5 entsprechend der Vorschrift ausplattiert. Nach Inkubation werden die Kolonien ausgez¨ ahlt. Daten und Ergebnisse

Es war keine der Platten ausz¨ ahlbar, es befanden sich zu viele Bakterienkolonien auf ihnen. Diskussion

Wir haben in unserem Versuch leider kein Ergebniss erzielen k¨ onnen, da so viele Bakterien gewachsen sind, das sie nicht mehr ausz¨ ahlbar waren. Der Grund daf¨ ur war der vergessene Deckel auf der Petrischale bei der UV-Bestrahlung. So haben die Bakterien anscheinend keinen Schaden genommen. In der Gruppe ist jedoch aufgefallen, das die Bakterien mit hoher UV-Bestrahlung wesentlich weniger

33

KAPITEL 7. MIKROORGANISMEN ALS MODELLORGANISMEN 34

gut gewachsen sind, als die, die nur kurz der Strahlung ausgesetzt waren. Das best¨ atigt die vorher get¨ atigten Erwartungen.

• Brock Mikrobiologie; Madigan, Martinko, Parker; Spektrum Akademischer Verlag; 2000

• Allgemeine Mikrobiologie; Schlegel; Georg Thieme Verlag; 1985; 6., ¨ uberarbeitete Auflage

• Mikrobiologisch-Biochemisches Praktikum; S¨ ußmuth, Ebersp¨ acher, Haag, Springer; Georg Thieme Verlag; 1999; 2. V¨ ollig ¨ uberarbeitete Auflage

Mikrobiologische ¨ • Skript zu den ” Ubungen“

35