Inhalt

Abk  ürzungen  4

1  Einleitung  5

1.1  Allgemeine Aspekte zur Überexpression von Metaboliten  5

1.2  Essigsäurebakterien, Gluconobacter oxydans  6

1.3  Alkohol Dehydrogenase mit PQQ als Coenzym  8

1.4  Das Ethanol oxidierende System in Gluconobacter oxydans ATCC 621H  9

1.5  Aufgabestellung  11

2  Material und Methoden  12

2.1  Verwendete Mikroorganismen und Vektoren  12

2.1.1  Verwendete Mikroorganismen  12

2.1.2  Verwendete Vektoren  12

2.2  Kultivierung der Stämme  13

2.3  Lagerung der Stämme  16

2.4  Allgemeine genetische Arbeiten  16

2.4.1  Isolierung genomischer DNA aus Gluconobacter oxydans  16

2.4.2  Minipräparation der Plasmid-DNA  17

2.4.3  Konzentration Bestimmung der DNA  18

2.4.4  Polymerase Kettenreaktion (PCR)  18

2.4.5  Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA  21

2.5  Klonierungsmethoden  22

2.5.1  Restriktinsanalyse  22

2.5.2  Restriktion des PCR-Produkts, und des Plasmides pBBR1MCS5  23

1

2.5.3  Dephosphorylierung mit Alkalischer Phosphatase  23

2.5.4  Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem PCR-Purifikationskit  23

2.5.5  Ligation  24

2.6  Transformation  25

2.6.1  Herstellung Elektokompetenter Zellen von E. coli DH5α  25

2.6.2  Herstellung Elektokompetenter Zellen von Gluconobacter oxydans  26

2.6.3  Elektroporation  26

2.7  Identifizierung von Klonen mit rekombinanter DNA  27

2.8  Enzymexpression  27

2.8.1  Induktion bei E. coli  27

2.8.2  Enzymexpression bei Gluconobacter oxydans  28

2.9  Zellaufschluss mittels frensch Press  28

2.10  Bestimmung der spezifischen ADH-Aktivität  29

2.10.1  Enzymtest  29

2.10.2  Proteinkonzentrationsbestimmung  30

2.10.3  Berechnung der spezifischen ADH-Aktivität  32

3  Ergebnisse  33

3.1  Amplifizierung der Gene, ADH(A) und ADH(A) Cyt c(B)  33

3.2  Restriktion und Ligation  34

3.3  Transformation von E. coli und Gluconobacter oxydans  35

3.4  Untersuchung der ADH-Aktivität der E. coli DH5α Transformanten  39

3.5  Untersuchung der ADH-Aktivität bei Gluconobacter oxydans  42

2

3.5.1 Kultivierung des Gluconobacter oxydans Wiltyps und der Transformanten auf Natrium Gluconat+Glucose (0,5%) 42

3.5.2 Kultivierung des Gluconobacter oxydans Wiltyps und der Transformanten auf Natrium Gluconat+Ethanol (0,5%) 46

3.5.3 Kultivierung des Gluconobacter oxydans Wiltyps und der Transformanten auf Natrium Gluconat+Glucose (0,3%) 50

3.5.4 Kultivierung des Gluconobacter oxydans Wiltyps und der

3.5.5 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH auf

verschiedenen C-Quellen 56

3.5.6 Einfluss des Einfrierens auf Gluconobacter oxydans PTB9018 58

3.5.7 Einfluss der Pufferzusammensetzung auf die spezifische Aktivität der ADH 59

3.5.8 Wirkung des Cofaktors auf die spezifische Aktivität der ADH 61

3.6 Bestimmung der Km-Werte der ADH in Rohextrakten des Wildtyps und der Transformanten (PTB9016, PTB9018) für verschiedene Alkohole 62

4 Diskussion 65

4.1 Expression der ADH in E. coli 65

4.2 Expression der ADH in Gluconobacter oxydans 66

4.3 Einfluss des Einfrierens bei -80 °C auf die Transformanten PTB9018 68

4.4 Einfluss der Pufferzusammensetzung und des Cofaktors auf die spezifische Aktivität der ADH 69

4.5 Vergleich der Affinität der ADH zu verschiedenen Substraten 69

5 Ausblick 71

6 Zusammenfassung 72

Literatur 73 Danksagung 76

3

Abkürzungen

ADH Alkohol Dehydrogenase Ap Ampicilin AS Aminosäure bp Basenpaar Cf Cefoxitin Cm Chloramphenicol DCPIP 2, 6-Dichlorphenolindophenol E. c Escherichia coli EDTA Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure G. o Gluconobacter oxydans Gm Gentamycin h Stunde kb Kilobase KCN Kaliumcyanid kDa Kilodalton MCS Multiple Cloning Site MM Minimal-Medium MOPS 3-N-Morpholinpropansäure MQ zweifach destilliertes Wasser OD optische Dichte PMS Phenazinmethosulphat PQQ Pyrrolochinolinchinon rev Rückwärts rpm Rotation pro Minute SA spezifische Aktivität TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer V Volt v/v Volumen pro volumen vor Vorwärts w/v Gewicht pro Volumen WT Wildtyp

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1 Einleitung

1.1 Allgemeine Aspekte zur Überexpression von Metaboliten

In der Vergangenheit bediente man sich zum Zwecke der Alkohol-, Essigsäure-, Milchsäure- oder anderer Fermentationen der jeweils besten Mischkulturen, die in der Natur zu finden waren, und kultivierte diese Mikroorganismen unter den vermeintlich besten Bedingungen. Im Laufe der Zeit stieg jedoch der Bedarf an den unterschiedlichsten Produkten. Zahlreiche, durch Misserfolge, oder Fehler gemachte Erfahrungen machten es notwendig, das Forschen nach geeigneten und spezifischen produzierenden Mikroorganismen in immer größeren Umfeldern und Maßstäben zu betreiben.

Ein neues Kapitel für das Arbeiten mit Mikroorganismen eröffnete sich im letzten Jahrhundert. Mit den Möglichkeiten der Gentechnik wurden enorme Fortschritte auf den Gebieten der Biochemie, Mikrobiologie, Enzymologie und Enzymregulation gemacht. Ferner wurden die physiologischen Eigenschaften der verschiedenartigsten

Mikroorganismen aufgeklärt. All diese neuen Aspekte und Einblicke trugen maßgeblich zu unseren heutigen Erkenntnissen zur Produktion mikrobieller Metabolite bei.

Ein wesentliches Ziel der modernen Biotechnologie ist, die Produktivität von Mikroorganismen, bezüglich primärer (z.B. Essigsäure, Ethanol, Glycerin) und auch sekundärer (z.B. Enzyme, Hormone, Antikörper, Proteine) Stoffwechselprodukte, zu steigern. Dabei bedient man sich je nach gewünschtem Produkt physiologischer (Kulturverfahren) und genetischer (Mutagenesetechniken) Mittel.

Die meisten erfolgreichen, industriellen Prozesse zur Überproduktion diverser Verbindungen basieren darauf, dass Wildtyp-Stämme von Natur

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aus die gewünschten Stoffe bilden und unter bestimmten Bedingungen in die Lage versetzt werden können, diese zu überproduzieren. Ein wirkungsvolles Instrument zur weiteren Erhöhung von natürlich gebildeten primären oder sekundären Metaboliten liefert die Gentechnologie, unter Ausnutzung der Erkenntnisse aus Enzymologie und Enzymregulation. Um mittels Gentechnologie Stoffwechsselflüsse in bestimmte Richtungen umzulenken, sind Veränderungen an

entsprechenden Schlüsselenzymen erforderlich. In der Vergangenheit wurden bereits Gene manipuliert, z.B. durch gezielte Punktmutationen [1] und/oder die Gene wurden in Multicopy-Plasmiden bzw. Transposons vervielfältigt [2]. Diese Techniken wurden variiert und kombiniert um zu untersuchen, welche Auswirkungen diese Veränderungen auf den Stoffwechsel zeigen würden. Es wurde dabei u.a. gefunden, dass die Erhöhung einzelner Enzymaktivitäten kaum zu einer Erhöhung des Gesamtfluxes führt, wenn die Umsatzrate eines vorhergehenden bzw. nachfolgenden Reaktionsschrittes begrenzend ist [3].

1.2 Essigsäurebakterien , Gluconobacter oxydans

Die Essigsäurebakterien bilden eine Gruppe von gramnegativen, aeoroben, beweglichen Stäbchen, die unvollständige Oxidationen durchführen, was bei Alkoholen zur Akkumulation von organischen Säuren als Endprodukten führt. Mit Ethanol als Substrat wird Essigsäure produziert, daher die Bezeichnung dieser Bakterien. Eine weitere Eigenschaft der Essigsäurebakterien ist die relative hohe Toleranz gegenüber Säure, da die meisten Stämme in der Lage sind, bei pH-Werten unter 5 zu wachsen (optimaler pH für G.oxydans 5,5 bis 6,0). Die Säuretoleranz ist natürlich entscheidend für einen Mikroorganismus, der große Mengen an Säure produziert. Die Essigsäurebakterien bilden eine heterogene Gruppe, die sowohl peritriche als auch polar begeißelte Mikroorganismen einschließt.

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Die polar begeißelten Mikroorganismen sind in der Gattung Gluconobacter zusammengefasst, während die peritrichen Arten zu der Gattung Acetobacter gehören. Alle Essigsäurebakterien gehören phylogenetisch zu den Proteobacteria. Zusätzlich zur Begeißelung unterscheidet sich Acetobacter von Gluconobacter darin, dass die von ihm gebildete Essigsäure weiter zu CO 2 oxidiert wird. Dieser Unterschied geht auf das Vorhandensein eines vollständigen Citratzyklus zurück. Da Gluconobacter ein vollständiger Citratzyklus fehlt, ist er unfähig, Essigsäure zu oxidieren [4]. In der Natur kommt Gluconobacter in stark zuckerhaltigen Medien wie Blütennektar, Früchten und auch in Cidre, Wein vor, G.oxydans ist somit für die Biotechnologie sehr Interessant. Besondere Bedeutung haben hierbei Dehydrogenasen, die in der Lage sind nichtphosphorylierte Alkohole [5] und Aldehyde [6] zu oxidieren. Bei der Umsetzung von Ethanol zu Essigsäure, bei der Oxidation von D-Sorbit zu L-Sorbose für die industrielle Ascorbinsäuresynthese [7] und bei der Herstellung des Bräunungsmittels Dihydroxyaceton [8] aus Glycerin wird dieser Organismus eingesetzt [9].

Die meisten aeroben Mikroorganismen oxidieren die organischen Nährstoffe im Atmungsstoffwechsel zu Kohlendioxid und Wasser. Da der Kohlenstoff im Kohlendioxid in seiner höchsten Oxidationstufe vorliegt, spricht man von " vollständiger Oxidation " und grenzt diese Art der Atmung von der " unvollständigen Oxidation" ab, bei der die Substrate nur teilweise oxidiert werden und organische Verbindungen als Stoffwechselprodukte ausgeschieden werden. Die Bezeichnung " vollständige Oxidation " bedeutet nur, dass keine organischen Verbindungen ausgeschieden werden; sie bedeutet nicht, dass das gesamte aufgenomme Substrat endoxidiert wird. In jedem Fall

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wird ein beträchtlicher Teil der Substrate ( 40-70% ) assimiliert, das heißt zum Zellmaterial umgewandelt.

Zu den Endprodukten der "unvollständigen Oxidationen" zählen Essigsäure, Gluconsäure, Ketosäuren, Fumarsäure, Citronensäure, Milchsäure usw. Durch die unvollständige Oxidation wird der Wasserstoff von einem Substrat abgespalten und auch die Verwendung Gluconobacter zur Katalyse gewisser Stoffumwandlung zählen, die für den Organismus ohne Wert sind [10]. Der Sauerstoffbedarf während des Wachstums ist groß, und das Hauptproblem der Essigsäureherstellung ist eine ausreichende Belüftung des Mediums [11] [12].

Ein zusätzlicher Vorteil der Essigsäuren besteht in ihrer Fähigkeit, verschiedene Oxidationsreaktionen industriell interessanter Alkohole regio- und stereoselektiv durchzuführen (z.B. Vitamin C) [13].

1.3 Alkohol Dehydrogenase mit PQQ als Coenzym

Pyrrolochinolinchinon ( PQQ ), das essentielle Coenzym zahlreicher bakterieller Oxidoreduktasen, ist als prosthetische Gruppe weit verbreitet, insbesondere bei Alkohol- und Aldol-Dehydrogenasen, wie z.B. die Alkohol-Dehydrogenase und die Glucose-Dehydrogenase in

Gluconobacter. Neben PQQ, das nicht kovalent am Enzym gebunden ist, sind inzwischen weitere verwandte Chinone identifiziert worden, die alle aus Aminosäuren der Peptid-Kette abgeleitet sind [14]. Dazu gehören Tryptophantryptophylchinon (TTQ) [15], Topachinon (TPQ) [16], und Lysintyrosylchinon (LTQ) [17]. Enzyme mit PQQ als Coenzym werden als Quinoproteine, bzw. wenn sie Cyt c enthalten als Quinohemoenzyme bezeichnet [18].

Bei der Substratoxidation durch eine Quinoproteindehydrogenase, z.B.:

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CH 3 CHO + 2H ⁺ + 2 e ^- CH 3 CH 2 OH →

hat das Coenzyme PQQ die Funktion die Elektronen vom Substrat zu übernehmen. Dabei geht die oxidierte Form PQQ in die reduzierte Form PQQH 2 über.

Abb.1-1 Pyrrolochinolinchinon, (Methoxatin); Abk.: PQQ [19]

Die PQQ-abhängigen Alkohol Dehydrogenasen oxidieren Alkohole und die bei der Oxidation entstehenden Reduktionsäquivalente werden auf die Elektronentransportkette übertragen [20].

1.4 Das Ethanol-oxidierende System in Gluconobacter oxydans ATCC 621H

Gluconobacter oxydans ATCC 621H wächst aerob auf Glucose oder/und Ethanol. Ethanol wird durch eine lösliche heterotrimere, periplasmatische Quinohemoprotein-Ethanol-Dehydrogenase (ADH), die PQQ als Cofaktor enthält, zu Acetaldehyd oxidiert. Die ADH überträgt die Elektronen über ein lösliches periplasmatisches Cytochrom c auf ein Ubiquinon Q 10 . Ubiquinol Q 10 H 2 wird weiter durch Cytochrom o Oxidase oxidiert.

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Abb.1-2 Elektronentransport bei der PQQ- abhängigen membrangebundenen Alkohol Dehydrogenase von Gluconobacter oxydans [38].

Die genetische Organisation der am Alkohol-oxidierenden System beteiligten Gene:

Abb.1-3 Gen-Anordnung der Alkohol Dehydrogenase von Gluconobacter Oxydans.

Das Gen A mit 2,7 kb codiert für die größte Untereinheit: die Dehydrogenase (83 kDa). Das Gen B mit 1,7 kDa kodiert für die zweite Untereinheit: Cytochrom c (52,1 kDa). Die beiden Gene A+B bilden ein Operon und werden von einem Promotor gesteuert. Das Gen S ist ca. 352 kb von Gen B, entfernt. Dieses Gen (S 0,7 kb) kodiert für die kleinste Untereinheit (14kDa), die in dieser Arbeit nicht untersucht wurde.

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1.5 Aufgabestellung

Das Forschungsprojekt, in welches sich die vorliegende Arbeit eingliedert, beschäftigt sich mit der Untersuchung der PQQ-abhängigen Dehydrogenasen von G. oxydans. Dazu sollen die Gene A (ADH) und B (Cyt c) kloniert und zuerst in E. coli und danach in Gluconobacter oxydans ATCC 621H überexprimiert werden. Die Überproduktion der ADH, sowohl der Untereinheit A als auch der beiden Untereinheiten A+B zusammen mit Hilfe eines Multicopy-Vektors (pBBR1MCS5), soll zu einer starken Erhöhung der Alkohol-Dehydrogenase Aktivität führen. Die Enzymaktivität der transformierten Stämmen soll mit der Enzymaktivität des Wildtyps verglichen werden.

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.

2 Material und Methoden

2.1 Verwendete Mikroorganismen und Vektoren

2.1.1 Verwendete Mikroorganismen

Für die Klonierungsarbeiten wurden die Stämme E. coli DH5α und der Wildtyp Gluconobacter oxydans ATCC 621H verwendet.

Tab 2-1 Stämme mit relevanten genotypischen Merkmalen

2.1.2 Verwendete Vektoren

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

pUC18: ist 2,7 kb Klonierungsvektor mit Ampicillinresistanresistenz, der nur in E. coli repliziert werden kann.

pEC86: 11,75 kb ist verantwortlich für die Expression von Cytochrom c bei E. coli und besitzt die Resistenzgene Chloramphenicol und Tetracyclin.

pBBR1MCS5: ist 4768 bp Klonierungsvektor mit Gentamycinresitenz enthält 16 Klonierungssite mit Lac Zα Gene und ist in vivo und in vitro relativ stabil, er ist mobilisierbar, und er ist kompatibl mit anderen Plasmidgrupen [25].

pTB9006: Amp ^r , 2,7 kb PCR-Produkt des Gens ADH(A) kloniert zwischen EcoRΙ- und SalΙ-Schnittstellen in der Richtung von LacZ Promotor von pUC18. [Es wurde von Fr. Viola Khodaverdi Afaghi durchgeführt] pTB9016: ist 7,375 kb Gm ^r ; 2,663 kb PCR Produkt des Gens ADH(A) kloniert zwischen XbaΙ-SalΙ Schnittstellen von pBBR1MCS5. pTB9018: ist 8,912 kb,Gm ^r ; 4,2 kb PCR Produkt der Gene ADH(A)+ Cytc(B) kloniert zwischen XbaΙ-SalΙ-Schnittstellen von pBBR1MCS5. Nach der Transformation, werden die Transformanten (allerdings mit großem P so wie die entsprechenden Plasmide) benannt.

2.2 Kultivierung der Stämme

Gluconobacter oxydans ATCC 621H und E. coli DH5α wurden in Nährmedien kultiviert, die bei 121 °C 20 min im Autoklaven sterilisiert wurden. Gluconobacter wurde bei 30 °C als Vorkultur auf Mannitol Medium und als Hauptkultur Natrium Gluconat (Base-Medium) mit verschiedenen Kohlenstoffquellen kultiviert. Natrium Gluconat Medium mit Glucose 0,5 % bzw. Glucose 0,3 % wurde nur 6 min 121 °C autoklaviert, Ethanol wird 0.5%ig (v/v) hinzugefügt.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

E. coli wurde in Luria Bertani (LB)-Medium kultiviert und in Minimal Medium M9 mit Ethanol (0,1%) als einzige C-Quelle induziert. Antibiotika wurden in den entsprechenden Konzentrationen zugegeben

Tab 2-3 Verwendete Antibiotika und ihre Wirkmechanismus [26]

Zusammensetzung des LB-Mediums pro Liter:

10 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl pH = 7 einstellen; autoklavieren.

Die Zusammensetzung der Stammlösungen des Minimalmediums (M9-Medium) sind Tab 2-4 dargestellt.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Tab 2-4 Stammlösungen des Minimalmediums (M9-Medium)

MM-Salzlösungen wurden getrennt autoklaviert, die Thiamindichlorid-Lösung wurde extra sterilfiltriert.

Zusammensetzung des Mannitol-Mediums pro Liter:

10 g/l Mannitol 5 g/l Hefeextrakt 3g/l Trypton pH = 6 einstellen, autoklavieren.

Zusammensetzung des Natrium Gluconat-Mediums pro Liter: 20 g/l Natrium Gluconat 3 g/l Glycerol 3 g/l Hefeextrakt 2 g/l Peptone

pH = 6 einstellen, autoklavieren, dieses Medium wurde Medium M genannt.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Medium M + 0,5 % Glucose = Medium A

Medium M + 0,5 % Ethanol = Medium B Medium M + 0,3 % Glucose = Medium C Medium M + 0,5 % Glucose + 0,5 % Ethanol = Medium D

2.3 Lagerung der Stämme

G. oxydans wurde in Mannitol-Medium, E. coli wird in LB-Medium mit 50% (v/v) Glycerol gelagert. Hierfür wurde 800 µl Kultur mit 800 µl Mannitol (für G. oxydans), oder 800 µl LB-Medium (für E. coli) in einem 2 ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt. Nach 15-minütiger Inkubation wurden die Stämme bei -80 °C gelagert.

Um die Zellen von G. oxydans kurzfristig frisch aufzubewahren, wurde ein Teil der positiven transformierten Kolonien auf Mannitol-Agar ausplattiert (für ca. 2-3 Wochen).

2.4 Allgemeine Genetische Arbeiten

2.4.1 Isolierung genomischer DNA aus Gluconobacter oxydans

Die Isolierung genomischer DNA erfolgte mit dem Kit „DNeasy Tissue Kit (50)” der Firma Qiagen.

G. oxydans wurde in 30 ml Mannitol Medium als Vorkultur (30 °C) gezüchtet, nach 24 h wurden die Zellen bei 5500xg zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 20 ml Natrium Glucomat Medium + Glucose 0,5 % resuspendiert und bei 30 °C unter Schütteln bis zur OD 620nm = 0,3-0,4 kultiviert.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Die Zellen wurden 5 min bei 10000 x g zentrifugiert, das Pellet wurde in 5 ml autoklaviertem Wasser aufgenommen und auf 1,5 ml aufgeteilt (jeweils 500 µl Suspension). Die Zellen wurden 2 min bei 10000 x g zentrifugiert, und in 180 µl ATL-Puffer aufgenommen, zu dieser Suspension wurde 20 µl Proteinase K zugegeben und bei 55 °C inkubiert (gelegentlich leicht vortexen).Diese Lösung wurde mit 200 µl AL-Puffer vermischt und bei 70 °C 10 min inkubiert. Nach der Zugabe von 200 µl 100 %ige Ethanol Lösung, wurde der gesamte Mix auf die beladene „Spin” Säule aufgetragen, welche in einem Sammelgefäß positioniert worden war, und bei 8000xg 1 min zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die Säule mit 500 µl AW1-Puffer versetzt. Es folgte eine weitere Zentrifugation bei 6000 g für 1 Minute. Der Durchfluss wurde wiederum verworfen, die Säule mit 500 µl AW2-Puffer gefüllt und noch mal bei 6000g abzentrifugiert. Anschließend wurde die DNA in einem neuen 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß mit 100 µl Wasser eluiert.

ATL-Puffer („ tissue Lysis Buffer”) enthält Proteinkinase A AL, AW1, AW2 sind nicht näher bezeichnet.

2.4.2 Minipräparation der Plasmid-DNA

Plasmid-DNA wurde mit dem Kit "Qiaprep Spin" isoliert. Für die Plasmid-Minipräparation wurden Einzelkolonien, die das gewünschten Plasmid enthielten, über Nacht auf Schüttler in 4 ml Mannitol oder LB (G.oxydans oder E. coli) mit den entsprechenden Antibiotika kultiviert. Aus der Übernacht-Kulturen wurden Plasmide wie folgt isoliert: 4 ml Übernacht-Kulturen wurden 1 min bei 14000g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 250 µl P1 mit RNase resuspendiert und mit 250 µl Puffer P2 versetzt (4-6 Mal invertieren), und bei Raumtemperatur 5 min

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

inkubiert. Um lokale Präzipitation zu vermeiden, wurde sofort nach der Zugabe von 350 µl Puffer N3 vorsichtig gemischt. Die Lösung wurde bei diesem Schritt trüb. Nach der anschließenden Zentrifugation wurde die Qiaprep Spin Säule auf ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und 10 min bei 13000xg zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und erneut für 30-60 s zentrifugiert, um weiteren Überstand zu entfernen. Die Säule wurde zum Waschen mit 0,5 ml Puffer PB beladen und 30-60 s bei 13000 x g zentrifugiert. 0,75 ml Puffer PE wurden ebenfalls zum Waschen der Säule aufgetragen und 60 s abzentrifugiert. Die Zentrifugate wurden verworfen. Um sicher zu gehen, dass kein Waschpuffer verblieben war, wurde abschließend 1 min zentrifugiert. Zur DNA-Elution wurde die Säule auf ein frisches Eppendorf-Gefäß überführt und mit 50 µl H 2 0 beladen, 1 min stehen gelassen und für 1 min zentrifugiert. Im Zentrifugat befand sich die DNA.

2.4.3 Konzentrationsbestimmung der DNA

Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde durch photometrische Messung der Nukleinsäure bei 260 nm wie beschrieben ermittelt [27]. Bei geringen DNA-Mengen und kleinen Volumina wurde die DNA-Konzentration nach der Gelelektrophorese durch visuellen Vergleich mit dem DNA-Standard, der ebenfalls auf das Gel aufgetragen wurde und die Intensität der Banden nach der Ethidiumbromidfärbung verglichen [27].

2.4.4 Polymerase-Kettenreaktion ( PCR )

Die PCR wurde zur exponentiellen Vervielfältigung der gewünschten DNA Abschnitte, und zum Einfügen neuer Restriktinonstellen für die Ligation, durchgeführt.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Für die Klonierungsarbeiten wurde die PCR zur Amplifizierung der folgenden DNA-Abschnitte durchgeführt.

• 2,663 kb großes Fragment, das Gen A enthält.

• 4,2 kb großes Fragment, das die beiden Gene A+B enthält

• 0,2 kb großes Fragment, das die MCS-region des Plasmides pBBR1MCS5 enthält.

Die Primer wurden ca. 200 bp vor ATG entfernt ausgewählt, um sicher zu gehen, dass der eigene Promotor des Gens A und des Gens A+B amplifiziert wurde. Anschließend wurden die Restriktionsstellen für die Ligation eingefügt.

Die für diese Untersuchung verwendeten Primerpaare sind mit den entsprechenden Hybridisierungstemperaturen in Tab 2.5 dargestellt, die mittels des Programms bestimmt werden [28].

Tab 2-5 Primerpaare und ihre Hybridisierungtemperaturen

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Restriktionserkennungssequenzen

5’-T ^↓ CTAG ↑ A-3’ XbaΙ 5’-G ^↓ TCGA ↑ C-3’ SalΙ

BstXΙ 5’-CCAN ↑ NNNN ^↓ NTGG-3’

Zur Amplifizierung des Gens A wurde ein Thermocylerprogramm entwickelt

Tab 2-6 PCR-Thermocyclerprogramm zur Amplifizierung des Gens A

Für die Amplifzierung der Gene A+B wurde das vorliegende Programm modifiziert, hierbei betrug die Hybridisierungstemperatur 64°C und Polymerisationszeit 5 min.

Zur Durchführung der PCR wurden die Template-DNA bzw. frische Kolonien, die beiden Oligonucleotid-Primer, ein Gemisch aller Desoxynucleotid, die Pfu-bzw. Taq-Polymerase, 10x Reaktionspuffer in 25 µl Endvolumen verwendet.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Tab 2-7 Zusammensetzung des PCR-Anzatzes

Um unspezifische Hybridisierungen bei Ansetzen der Reaktion und während der Initialen Aufheizphase des Thermocyclers zu vermeiden, wurde die Hot-Start-PCR angewendet. Dabei wurde die Pfu-Polymerase während des Denaturierungsschritts zur Reaktionsmischung pipettiert.

2.4.5 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA

Die Agarosegel-Elektrophoresen wurden wie bei Sambrook et al beschrieben durchgeführt [27]. In der vorliegenden Analyse wurden alle Gelelektrophorese auf 1 %igen Agarosegelen in 0,5 fachen TAE-Puffer durchgeführt. Es wurden 2 bis 10 µl DNA-Lösung mit 2 µl 6x Ladepuffer vermischt und auf Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde 1 bis 1,5 h bei Raumtemperatur und 100 V durchgeführt. Als Standard wurden 5 µl 1-kb-DNA-Lader (Gene ruler, MBI Fermentas) verwendet. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 10 bis 20 min in Ethidiumbromid Lösung (0,5 µg/ml) bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Anregung mit UV Licht (254 nm) wurde der Ethidiumbromid-DNA-

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Komplex im Sichtbaren Bereich (500-590 nm) als rot-orange leuchtende Bande sichtbar.

Zusammensetzung der 50 x TAE-Puffer pro L Tris 242 g Essigsäure 57,1 ml 0,5 M EDTA pH 8 100 ml

2.5 Klonierungsmethoden

2.5.1 Restriktionsanalyse

Die Restriktionsanalysen wurden nach Angaben des Herstellers (MBI Fermentas) durchgeführt. Zur Klonierung in die gewünschten Vektoren wurden die PCR-Produkte über Nacht bei 37 °C verdaut. Die Restriktion der Vektoren wurde 3 bis 4 h bei 37 °C verdaut durchgeführt. Zur Auffindung der Restriktionsstellen innerhalb der zu klonierenden DNA-Fragmente wurde das Programm Nebcutter V 2.0 (Biolabs Inc., New England) verwendet [29]. Die Restriktionsreaktionen wurden in einem Volumen von 25 µl wie Tab. 2.8 dargestellt, durchgeführt.

Tab 2-8 Zusammensetzung des Restriktionsansatzes

Bei Doppelverdau mit XbaI/SalI, wurden jeweils 1,5 µl der beiden Enzyme und ein entsprechender Reaktionspuffer, in dem beiden Enzyme aktiv sind, verwendet.

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2.5.2 Restriktion des PCR-Produkt, und des Plasmides pBBR1MCS5 (für XbaI-SalI Fragmente)

Die Schnittstellen der Enzyme können in den beiden Strängen eines DNA-Moleküls entweder an der gleichen Stelle liegen oder um einige Basen versetzt sein. Dementsprechend entstehen nach der Spaltung entweder glatte DNA-Enden (blunt ends) oder überstehende DNA Enden (sticky ends). Das Plasmid pBBR1MCS5 und die PCR-Produkte wurden stets so verdaut, dass sticky ends entstanden.

2.5.3 5’-Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase

Vor der Ligation, wurde der verdaute Vektor mit alkalischer Phosphatase behandelt. Dadurch wird verhindert, dass der linearisierte Vektor religiert. Dem dephosphorylierten Vektor fehlt die 5’-Phosphatgruppe, die von der Ligase benötigt wird. Allerding ist eine Ligation mit einem zu kombinierenden DNA-Fragment, das eine intakte 5’-Phosphatgruppe enthält, möglich.

Die Reaktionsmischung zur Erzeugung des 5’-dephosphrylierten Vektors wurde 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch die Hitze inaktiviert (85 °C ,15 min) gestoppt und die Ligation durchgeführt.

2.5.4 Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem PCR-Purification-kit (Qiagen).

Die eigentliche Aufreinigung des gewonnenen PCR-Produktes erfolgte mit Hilfe des PCR-Purifikation-Kits von Qiagen. Hierzu wurde das PCR-Produkt mit dem PB-Puffer im Verhältnis 1:5 gemischt.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

und auf eine QIA-quick-Säule gegeben, die in einer Sammelgefäß steht. Das Reaktionsgemisch wurde nun für 1min bei 13000 rpm zentrifugiert. Die Silica Gel Membran der QIAquik-Säule adsorbiert bei der Zentrifugation, so dass sich in der Sammeltube der abzentrifugierte Rest aus PCR-Ansatz ohne DNA und PB-Puffer befindet, der verworfen wird. Die QIAquick-Säule wurde nun in eine neue Sammeltube gestellt. In einem weiteren Reinigungsschritt wurden 750 µl PE-Puffer, der zuvor mit Ethanol aufgefüllt worden war, auf die Säule gegeben und zweimal für 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert, wonach das Sammelgefäß abermals verworfen wurde. Nun wurde die QIAquick-Säule in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt. Zur Elution der auf gereinigten DNA aus der Membran der Säule wurde vorsichtig 50 µl autoklaviertes Wasser in das Zentrum der Säule pipettiert, für 1 min inkubiert und abermals für 1min bei 13000 rpm zentrifugiert.

Die aufgereinigte DNA befand sich nun im Eppendorf-Gefäß, die QIAquick Säule wurde verworfen.

2.5.5 Ligation

DNA-Ligasen katalysieren die Bildung einer Phosphatdiesterbindung zwischen einer freien 5’-Phosphatgruppe und einer benachbarten freien 3’-Hydroxylgruppe. Bei der Ligation wird die ATP-abhängige T4-DNA-Ligase, die von dem Bakteriophagen T4 codiert wird und sowohl glatte als auch überstehende DNA-Enden verbinden kann, eingesetzt. Für die Ligation wurde das Verhältnis Vektor zur Insert von 1:3 (s 2.4.3) eingesetzt. Der Reaktionsansatz (20 µl), der 1,5 µl T4-DNA-Ligase (1U/µl), 2 µl 10x T4-Ligationspuffer und Vektor-/Insert-DNA enthält, wurde über Nacht bei 16 °C inkubiert. Der Ligationsansatz wurde mit PCR-Reinigung-Kit gereinigt (s. 2.5.4) und zur Transformation von E. coli DH5α verwendet.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

2.6 Transformation

Bei der Transformation von Bakterien wurde DNA in Form von chromosomalen Bruchstücken oder Plasmiden in kompetenten Zellen eingebracht. Die DNA oder Teile davon können sich über homologe Rekombination in das bakterielle Genom integrieren oder sich als selbständig replizierendes Plasmid etablieren. Kompetente Zellen sind in der Lage freie und artfremde DNA aufzunehmen. Kompetenz kommt bei Bakterien in der Natur vor, wobei die Übertragungswahrscheinlichkeit nicht sehr hoch ist. Nur eins von etwa 10 ⁶ DNA-Fragmenten gelangt in die Zelle.

Die natürliche Transformation kann durch gezielte Behandlung, z.B. Elektroporation, Mikroinjetion und Hitzeschock-Behandlung der Zelle bei hoher Konzentration von CaCl 2 , induziert werden. Dadurch kann eine hohe Transfomationseffizienz erreicht werden.

2.6.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen von E. coli DH5α

4 ml LB-Medium wurden mit E. coli DH5α beimpft und über Nacht bei 37 °C kultiviert. 100 ml LB-Medium wurden mit 3ml Übernacht-Kultur beimpft und bei 37 °C unter Schütteln bis zur OD = 0,5-0,6 kultiviert. Danach wurde die Kultur 30 min auf Eis inkubiert und 10 min bei 5500 x g bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 10 ml MQ gewaschen. Es wurde in 10 ml 10%igen kalten Glycerol resuspendiert, in ein neues Gefäß überführt und 15 min 5500g zentrifugiert. Das Pellet wurde wieder in 1 ml 10%igem Glycerol resuspendiert und in Portionen von 100 µl in 0,5-ml-Mikroreaktionsgefäßen portioniert. Die Zellen wurden direkt zur Elektroporation verwendet bzw. bei - 80°C eingefroren.

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2.6.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen von Gluconobacter oxydans

Es wurde 50 ml Mannitol-Flüssigmedium mit einer Vorkultur beimpft und bis zu OD 0,8 kultiviert (Schütteln bei 30 °C). Die Zellen wurden abzentrifugiert (10 min, 4°C, 5500 g), 2 mal gewaschen und in 10 ml Natrium Gluconat-Medium + 0,5 % Glucose aufgenommen. Es wurde auf 500 ml Medium, bis zu OD ≈ 0,3 erreicht ist, kultiviert. Die Zellen wurden abgeerntet (5500 x -g, 15 min, 4 °C), das Pellet wurde in 10 ml 1 mM HEPES pH = 7 aufgenommen, dann 2 mal mit 10 %igen Glycerol. gewaschen. Anschließend wurde das Pellet in 1 ml Glycerol versetzt und zu 100 µl für die Transformation aliquotiert. Für die Regenerierung der kompetenten Zellen wurde Mannitol-Medium verwendet.

2.6.3 Elektroporation

Bei der Elektroporation werden Zellen in einer DNA-haltigen Lösung einem Stromstoß ausgesetzt, der in der Cytoplasmamembran temporäre Poren erzeugt. Diese Poren werden durch Pulse eines sich entladenden Kondensators erzeugt und bereits nach kurzer Zeit wieder geschlossen. Durch diese Poren kann Plasmid-DNA sowohl durch Diffusion als auch elektrophoretisch in die Zelle gelangen. Für die Elektroporation wurden frisch hergestellte kompetente Zellen oder bei -80 °C eingefrorene Zellen nach dem Auftauen auf Eis verwendet. Es wurden 20 µl gereinigter Ligationsansatz für die Elektroporation von 100 µl verwendet. Das Gemisch aus kompetenten Zellen und Ligationsansatz wurde in einer eiskalten Elektroporationsküvette mit 0,2 cm Elektrodenabstand gefüllt. Für die Elektroporation von E.coli und Gluconobacter oxydans wurde der „Gene Pulser (2)” der Firma Biorad mit folgenden Einstellungen verwendet:

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

200 , 25 µF, 2,5 KV

Nach der Regenerierung der transformierten kompetenten Zellen wurden auf den entsprechenden Selektivmedien ausplattiert.

2.7 Identifizierung von Klonen mit rekombinanter DNA

Die Klone, die bei der Transformation rekombinantes Plasmid aufgenommen hatten, wurden durch Antibiotikaresistenz und Blau-Weiß-Selektion identifiziert (für E.coli). Rekombinante enthaltende Bakterien wurden auf einem Nährboden mit den entsprechenden Antibiotika isoliert (für G.oxydans). enthielten die Agar-Platten zusätzlich X-Gal, konnten die Bakterienkolonien mit rekombinanter Plasmid-DNA von solchen mit reiner Plasmid-DNA unterschieden werden. Transformierte Zellen mit Plasmiden ohne Fremd-DNA über eine aktive β-Galactosidase, die X-Gal spaltet und dadurch eine blaue Färbung der Zellen identifiziert werden. transformierte Zellen mit Plasmiden, die eingebaute fremde DNA enthalten, besitzen keine β-Galactosidase-Aktivität und bleiben weiß.

2.8 Enzymexpression

2.8.1 Induktion bei E. coli

Auf LB-Medium gewachsene E. coli-Kultur (OD = 0,4 und 0,8) wurde durch Zentrifugation (5500xg, 10 min) geerntet, mit 10 ml Kalium Phosphat Puffer 10 mM (pH = 6) gewaschen. Das Minimal Medium enthielt, zur Induktion der ADH-Biosynthese, Ethanol (0,1 %) als einzige C-Quelle für PTB 9016/PTB9018.

Nach 12h und 24h Induktionszeit, wurden die Zellen geerntet und für den French-Press-Aufschluß vorbereitet.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Für E.c-PTB9006 wurde auf LB-Medium + IPTG (1 mM) gezüchtet. Bei einem OD 620nm = 0,4 und 0,8 wurden Proben genommen und sofort aufgearbeitet.

2.8.2 Enzymexpression bei Gluconobacter oxydans

Die Kultivierung von Gluconobacter oxydans (PTB9016/PTB9018) zur Proteinexpression erfolgt in 200 ml (Photometerkolben:geeignet für direkte OD Messung) bei 140 rpm und eine Temperatur von 30 °C. Das Natrium gluconat (Glucose 0,5%/0,3%, Ethanol 0,5%, Glucose0,5% +Ethanol 0,5%)-Medium wurde mit Gentamycin und Cefoxitin versetzt. Angeimpft wurde mit dem Pellet einer 20 ml Übernachtkultur auf Mannitol-Medium. Nach 6h, 10h, 12h, 24h Kultivierungslaufzeit erfolgte jeweils 50 ml Probenahme, die durch Zentrifugation bei 5500xg für 10 min bei 4 °C geerntet werden kann. Der Überstand wurde verworfen, das Bakterienpellet wurde 2 x mit 10 ml Kaliumphosphatpuffer 10 mM pH=6 gewaschen, und sofort mit der french-Press aufgeschlossen.

2.9 Zellaufschluss mittels french Press

Zur Gewinnung der membrangebundenen Alkohol Dehydrogenase wurde das abzentrifugierte Zellmaterial von 200 ml Kultursuspension 2 ml KPP 10 mM pH=6 resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgt mit einer „french Press“ Hochdruck-Molekularpresse auf 4 °C vorgekühlten

Aufschlusszelle. Bei diesem Verfahren wird das Probenmaterial in der Aufschlusszelle einem Druck von 1200 psi (85 Bar) ausgesetzt und durch ein kleines Ventil gepresst. Die plötzliche Druckentspannung und auftretende Scherkräfte bewirken ein Zerreißen der Zellen und die Freisetzung der Proteine. Zur Gewährleistung eines vollständigen Aufschlusses wird dieser Vorgang 3-Mal durchgeführt. Die Zelltrümmer

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

werden sofort durch Zentrifugation bei 14000 g für 20 min bei 4 °C entfernt, der klare Überstand wird für Enzymaktivitätsmessung verwendet

2.10 Bestimmung der spezifischen ADH-Aktivität

Die Bestimmung der ADH-Aktivität bei Gluconobacter oxydans erfolgte sofort nach dem Zellaufschluss. Mittels Enzymassay wurde die volumetrische Aktivität der ADH (U/ml) gemessen, die Messdaten wurden schließlich auf die in dem Zellextrakt vorhandene Proteinkonzentration (mg/ml) bezogen und die spezifische ADH-Aktivität (U/mg) ermittelt.

2.10.1 Enzymtest

Die PQQ-abhängige-ADH ist ein Dehydrogenase-Enzym, welches Wasserstoffionen von einem Substrat auf ein anderes Substrat überträgt. In diesem Fall ist das Ethanol der Elektronendonator, die ADH Elektronüberträger und das PQQ der Elektronenakzeptor. Die ADH oxidiert Ethanol zu Acetaldehyd, und dabei entsteht PQQH 2 . Abb.2-1 zeigt ein Schema, wie in vitro die Oxidationsäquivalente von Ethanol über das Enzym und den dazwischengeschalteten Mediator auf den Redoxfarbstoff als Endakzeptor übertragen werden.

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Abb. 2-1 Formales Reaktionsschema (E-PQQ: aktives Zentrum mit einem Molekül Pyrrolochinolinchinon) [30].

Das farbstoff-abhängige Enzym (ADH) wurde in einem Testvolumen von 1 ml gemessen. Es wurde die Extinktionsabnahme bei 600 nm bei 25 °C kontinuierlich aufgezeichnet und anschließend grafisch ausgewertet. Die Reaktion wurde mit dem Substrat gestartet. Im Puffer MOPS (200 mM pH=6,5) waren 0,8 mM KCN, 0,1 mM PMS 0,05 mM DCPIP, 0,1 M Ethanol und Enzym enthalten.

2.10.2 Proteinkonzentrationsbestimmung

Die Proteinkonzentrationsbestimmung wurde nach der Methode von BRADFORD (1976) durchgeführt. Das Prinzip dieser Methode beruht auf der Bindung des Farbstoffes Coomassie Blue G-250 an Proteine, infolgedessen sich Protein-Farb-Komplexe bilden und das Absorbtionspeakmaximum des

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

Farbstoffes von 465 nm nach 595 nm verschoben wird. Somit lässt sich über eine einfache Extinktionsmessung die dementsprechende Proteinmenge ermitteln. Allerdings kann, vor allem aufgrund der Störanfälligkeit des Testes und der Alterung der Coomassie-Lösung, kein allgemeingültiger Extinktionskoeffizient angegeben werden, so dass jedes Mal mit Standardwerten verglichen werden muss, d.h. zu jeder Bestimmung muss eine Kalibriergerade angefertigt werden [31]. Für eine solche Eichkurve wurden Lösungen mit 5 verschiedenen Konzentrationen hergestellt, die aus Rinderserumalbumin (BSA) als Standard und Wasser bestanden. Die Konzentration der Standardlösung lag im Bereich zwischen 0,01-0,1mg/ml Protein. In Abhängigkeit vom Konzentrationsbereich mussten je 100 µl diesen Standardlösungen und 900 µl Bradfordlösung gründlich vermischt und 2 min inkubiert werden. Nach der Inkubation wurden die gebildete Farbkomplexe bei 595 nm gegen die Blindprobe (0,9 ml Bradfordlösung + 0,1 ml NaCl (0,15 M)) gemessen. Die zu quantifizierenden Proben wurden entsprechend des eingesetzten Kalibrierbereiches mit autoklaviertem Wasser vorverdünnt (meist 1:100) und des Weiteren ebenso die Standardlösungen behandelt. Aus der zuvor aufgenommenen Kalibrierkurve ließen sich die Proteinkonzentration der Proben errechnen.

Herstellung der Farbstoff-Stammlösung (Bradford-lösung)

• 100 mg Coomassie-Brillant-Blue G 250 in 50 ml Ethanol (über Nacht rühren).

• 100 ml 85 %ige H 3 PO 4 zugeben, auf 1 l mit Bidestilliertem Wasser und 2 Lagen Filterpapier filtrieren

• In einer braunen Flasche bei RT gelagert wurde (begrenzt haltbar).

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M aterial und M ethoden ____________________________________________

2.10.3 Berechnung der spezifischen ADH-Aktivität.

Zur Berechnung der spezifischen ADH-Aktivität wurden zunächst die Volumenaktivität (U/ml) ermittelt. Diese ergab sich aus der Extinktion pro Minute. Die dazu verwendete Berechnungsformel leitet sich von dem Lambert-Beer’schen Gesetz ab

∆E * ∆t ^-1 Extinktionsänderung pro Zeit (min ^-1 )

Extinktionskoeffizient DCPIP (600 nm) (21,99 ml * µmol -1 * cm ^-1 )

ε d Durchmesser der Küvette (1 cm) V Messvolumen (1 ml) v Probevolumen (Enzym) (0,02ml) VF Verdünnungsfaktor des Zellextraktes

Definition für Enzymaktivität [U = Unit ]:

Die Einheit der Enzymaktivität [ U ] ist die Menge Enzym, die bei 25 °C unter optimalen Bedingungen pro Minute 1 µmol (10 ^-6 mol) Substrat umsetzt. Die spezifische Enzymaktivität (U/mg) erhält man mittels Division der Volumenaktivität durch die entsprechende Proteinmenge (mg) im Testansatz.

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E rgebnisse

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3 Ergebnisse

Zur Untersuchung des membrangebundenen, PQQ-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase-Komplexes bei G. oxydans, wurden einmal das Gen ADH (A) alleine und dann die Gene ADH (A)+Cyt c (B) zusammen in den Vektor pBBR1MCS5 kloniert.

Bei der Charakterisierung der verschiedenen Vektorkonstrukte durch Restriktionsanalyse wurden die gleichen Fragmente erhalten, unabhängig davon ob die Vektoren aus E. coli oder G. oxydans isoliert wurden.

3.1 Amplifizierung der Gene ADH (A) und ADH (A)+Cyt c (B)

Die ADH (A)-Gen 2663 bp bzw. für die Gene [ADH (A) + Cyt c (B)] 4200 bp-DNA-Abschnitte, die jeweils das Gen A 2274 bp bzw. die Gene 4097 bp enthalten, wurden mittels PCR amplifiziert (s. 2.4.4). Die Primer für das Gen A und A+B wurden 267 bp vor dem Start Codon ATG des Gens A ausgewählt, damit der eigene Promotor auch amplifiziert wurde, und 122 bp nach dem Stop Codon TGA des Genes A, beziehungsweise 193 bp nach dem Stopp Codon TAA des Genes B.

Abb. 3-1 Gelelektrophorese der PCR-Produkte. Spur M:Größenmarker (GeneRuler ^TM DNA Ladder); Spur 1: PCR-Produkt (Gen A); Spur2: PCR-Produkt (Gene A+B).

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E rgebnisse

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Die PCR-Produkte, die am 5’-Ende des Vorwärtsprimers die Schnittstelle für XbaI und am 5’-Ende des Rückwärtsprimers die Schnittstelle SalI enthielten (s. 2.5.1), wurden durch XbaI-SalI verdaut. Die gereinigten Verdauungsprodukte wurden jeweils zwischen die XbaI-SalI Schnittstellen des 4712 bp großen Vektors pBBR1MCS5 kloniert. Daraus resultiert das 7375 bp große Plasmid pTB9016, bzw. das 8912 bp große Plasmid pTB9018.

3.2 Restriktion der PCR-Produkte (A, A+B) , des Plasmides und Ligation

Nach dem Verdau (XbaI-SalI) und der Reinigung des PCR-Produktes (Gen A) wurde es mit dem verdauten Plasmid (XbaI-SalI) pBBR1MCS5 auf dem gleichen Elektrophoresegel aufgetragen.

Abb. 3-2 Gelektrophoretische Auftrennung . Gen (A) und Plasmid pBBR1MCS5 vor der

Ligation. Spur M: Größenmarker (GeneRuler ^TM DNA Ladder); Spur 1: PCR-Produkt (Gen A) geschnitten mit XbaI SalI; Spur 2: der verdaute Vektor pBBR1MCS5.

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E rgebnisse

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Anhand dieses Bildes wurde durch die Größe, die Intensität und das gewünschte Verhältnis Insert/Vektor (3:1) die Volumenmenge der DNA für den Ligationsansatz abgeschätzt.

Die Gene A+B zusammen wurden auch mit (XbaI-SalI) verdaut und dann mit dem verdauten Vektor pBBR1MCS5 (XbaI-SalI) zusammen ligiert.

Abb. 3-3 Gelektrophoretische Auftrennung : Gene (A+B) und Plasmid pBBR1MCS5 vor

der Ligation. Spur M: Größenmarker (GeneRuler ^TM DNA Ladder); Spur 1: der verdaute Vektor pBBR1MCS5; Spur 2: PCR-Produkt (Gene A+B) geschnitten mit XbaI SalI.

3.3 Transformation von und mit E. coli G. oxydans

pTB9016/pTB9018/pBBR1MCS5

Nach der Transformation wurden die positiven Klone entweder mittels PCR oder Miniplasmidpräparation identifiziert.

Die verwendeten Primer für diese Identifizierung der Klone PTB9016 sind ADHvorXbaI/ADHrevSalI und für die Identifizierung der Klone PTB9018 sind ADHvorXbaI/CytcrevSalI (s. Tab 2-5). Um zu überprüfen, ob das gewünschte Insert wirklich an das Plasmid ligiert ist, wurden die Gene mit den Primern MCSvor/MCSrev amplifiziert, weil sie nicht direkt an die Sequenzen der Gene binden, sondern an die MCS-Region des LacZ des Plasmides pBBR1MCS5.

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E rgebnisse

_____________________________________________

Abb. 3-4 Schema des verdauten Plasmid pBBR1MCS5.

Für die späteren Messungen der Enzymaktivität wurde als Kontrolle, nicht nur der Wildtyp sondern auch der Wildtyp mit leerem Vektor verwendet.

Abb. 3-5 Gelektrophorese des PCR-Produktes von transformierten Kolonien mit dem Plasmid pBBR1MCS5 Spur 1: PCR Produkt mit den Primern MCSvor/rev, Spur M:

Größenmarker (GeneRuler ^TM DNA Ladder).

Die verwendete Primer binden an MCS-Region links und rechts von der Schnittstelle XbaI-SalI, deshalb ist die grösse der amplifizierte Region ist nicht 56 bp sondern 200 bp. (s. Tab 2-5).

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E rgebnisse

_____________________________________________

Abb. 3-6 Schema der Konstruktion des Plasmides pTB9016.

Abb. 3-7 Gelelektrophorese des PCR-Produktes der transformierten Kolonien mit dem

Plasmid pTB9016. Spur M: Größenmarker (GeneRuler ^TM DNA Ladder), Spur 1: PCR Produkt mit den Primern ADHvorXbaI/ADHrevSalI.

Abb. 3-8 Schema der Konstruktion des Plasmides pTB9018.

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E rgebnisse

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Abb. 3-9 Gelelektrophorese des PCR-Produktes von transformierten Kolonien mit dem Plasmid pTB9018. Spur M: Größenmarker (GeneRuler ^TM DNA Ladder), Spur 1: PCR-Produkt mit den Primer ADHvorXbaI/CytcrevSalI.

Für einen sicheren Nachweis der Plasmide pTB9016 7,375 kb bzw. pTB9018 8,912 kb, wurden Miniplasmidpräparationen und ein Kontrollverdau mit BstxΙ durchgeführt. BstxΙ hat zwei Schnittstellen; im Gen ADH (A) und im pBBR1MCS5. (S. Abb. 3-6 und 3-8). pTB9016 + BstxΙ = 5907 bp + 1468 bp pTB9018 + BstxΙ = 7444 bp + 1468 bp

Abb. 3-10 Gelelektrophorese des verdauten Plasmides pTB9016. Spur M: Größenmarker (GeneRuler ^TM DNA Ladder), Spur 1: BstxI-Verdau-Produkte, Spur 2: unverdautes Plasmid pTB9016.

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E rgebnisse

_____________________________________________

Die negative Kontrolle wurde auch auf dem Gel aufgetragen, um das gewünschte grösse des Plasmides zu überprüfen. (das ist nur relatif, denn es ist in diesem Versuch nur die zirkulare Form, aber manchmal erscheint das Plasmid, trotz der gleiche grösse in verschiedenen Formen, was in diesem Fall nicht).

(GeneRulerTM DNA Ladder), Spur 1: unverdautes Plasmid pTB9018, Spur 2: BstxI-Verdau- Produkte.

Die transformierten Zellen mit den Plasmiden, pBBR1MCS5, pTB9016, pTB9018, werden jeweils PBBR1MCS5, PTB9016, PTB9018 genannt.

3.4 Untersuchung der ADH-Aktivität von den transformierten E. coli DH5" " " "

Die E. coli-PTB9016,-PTB9018,-PBBR1MCS5, und der Wiltdtyp E. coli-DH5" (als Kontrolle) wurden zuerst auf LB-Medium bis zu einer OD = 0,4 bzw. 0,8 gezüchtet. Die Zellen wurden gewaschen und auf MM-M9 (Ethanol 0,1 %)-Medium gezüchtet.

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E rgebnisse

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Abb. 3-12 Wachstum auf LB-Medium. Kurve 1: E. coli DH5", Kurve 2: E.c- PBBR1MCS5,Kurve 3: E.c-PTB9016, Kurve 4: E.C PTB9018

Nach 12 h bzw. 24 h Induktionszeit, wurden die Zellen aufgeschlossen, es wurde keine ADH-aktivität gefunden, trotz Zugabe von PQQ in dem Rohextrakt.

E. coli DH5α kann nicht in aeroben Bedingungen Cytochrom c synthetisieren, E. coli- DH5α, E.c-PTB9016, E.c-PTB9018 wurden zur kompetenten Zellen gemacht, und anschließend mit dem Plasmid pEC86 (pEC 86 enthält die Gene für die Bildung von Cyt c unabhängig von der Sauerstoffkontrolle transformiert [9].

Abb. 3-13 Gelektrophorese der PCR-Produkte von Miniplasmidpräparationen E. coli- TransformantenSpur 1: enthält nur Plasmid pEC86, Spur 2: enthält pEC86+pTB9016, 3:

enthält pEC86+pTB9018, Spur M: Größenmarker (GeneRuler ^TM DNA Ladder).

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E rgebnisse

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Abb. 3-14 Wachstum auf LB-Medium. Kurve 1: E. coli DH5α+, Kurve 2: E.c- PTB9016+,Kurve 3: E.c-PTB9018+ pEC86.

Trotz der Transformation mit pEC86, war eine Enzymaktivität der ADH nicht nachweisbar.

Weil sich der LacZ-Promotor von pTB9016 und pTB9018 entgegengesetzt zur Orientierung der Gene (A) und (A+B) befindet, wurde E. coli DH5α mit pTB 9006 (von Fr. Viola Khodaverdi) transformiert; LacZ-Promotor und Gen (A) sind in diesem Konstrukt die gleiche Richtung orientiert.

Abb. 3-15 Schema der Konstruktion des Plasmides pTB9006.

Dieses Mal wurde es direkt auf LB-Medium mit IPTG induziert, nach einer OD von 0,4 und 0,8 wurde geerntet, aufgeschlossen und der Enzymassay durchgeführt. Es wurde auch keine Aktivität gemessen.

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E rgebnisse

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Abb. 3-16 Wachstum auf LB-Medium +IPTG. Kurve 1: E. coli DH5"+ pUC18, Kurve 2: E. coli DH5"+ pTB9006.

3.5 Untersuchung der ADH-Aktivität bei G. oxydans

3.5.1 Kultivierung der G. oxydans -Wildtyp, -PBBR1MCS5, -PTB9016, und -PTB9018 auf Medium A (Natrium Gluconat Glucose 0,5%)

Es wurde auf Medium A (s. 2.2) kultiviert, und es wurde im Laufe der Kultivierung jede Stunde die optische Dichte bei 620 nm und der pH-Wert des Kultivierungsmediums gemessen. Nach 6 h, 10 h, 12 h, 24 h Kultivierungslaufzeit wurden Proben genommen und der Enzymaktivitätstest durchgeführt.

Um die Darstellung der Ergebnisse deutlich zu vereinfachen, wurden jede Kultivierung und jeder Enzymaktivitätstest von G.o-PBBR1MCS5, -PTB9016, -PTB9018 jeweils in einem Diagramm mit dem G. oxydans Wildtyp verglichen.

Für alle Versuche wurde Ethanol als Substrat für den Enzymaktivitätstest verwendet.

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E rgebnisse

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• Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium A von G.o-WT mit G.o-PBBR1MCS5

Abb. 3-17 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und -PBBR1MCS5 auf Medium A. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

Abb. 3-18 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium A, zwischen G.o-WT und G.o-PBBR1MCS5 (frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

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E rgebnisse

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Während der Kultivierung wurde die stationäre Phase sowohl für den G.o-WT als auch G.o-PBBR1MCS5 nach ca. 10-12h erreicht. Die pH-Veläufe sind ähnlich, der start-pH ist 6,0 nach 24 h wurde 4,2 gemessen. Die spezifische Aktivität der ADH bei G.o-WT und G.o-PBBR1MCS5 ist außer für die Zeit 12 h (späte logarithmische Phase) fast gleich. Bei 12 h die SA von G.o-PBBR1MCS5 ca. 3 fach höher gegenüber G.o-WT.

• Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium A von G.o-WT mit G.o-PTB9016

Abb. 3-19 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und G.o- PTB9016auf Medium A. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

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E rgebnisse

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Abb. 3-20 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium A, zwischen G.o-WT und G.o-PTB9016 (frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

Die stationäre Phase bei G.o-PTB9016 wurde nach 12 h Kultivierung erreicht, der End-pH-Wert des Mediums war 4,3. Die SA nach 6 h, von G.o- PTB9016unterscheidet sich kaum im Vergleich zum G.o-WT. Die höchste SA des G.o-WT liegt bei 10 h, während sie für G.o-PTB9016 bei 12 h liegt. Nach 10 h und 24 h Kultivierung ist die SA von G.o-PTB9016 ca. 2 fach höher als bei G.o-WT. Nach 12 h Kultivierung liegt die SA von G.o-PTB9016 ca. 6 fach höher gegenüber G.o-WT.

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E rgebnisse

_____________________________________________ • Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium A von G.o-WT mit G.o-PTB9018.

Abb. 3-21 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und G.o -PTB9018 (frisch transformiert) auf Medium A. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

Abb. 3-22 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium A, zwischen G.o-WT und G.o-PTB9018 (frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

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E rgebnisse

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Hier wurde die stationäre Phase für G.o-PTB9018 nach ca. 12 h erreicht und der End-pH-Wert des Kultivierungsmediums war 4,5. Die SA von G.o-PTB9018 für alle Kultivierungszeiten (6, 10, 12, 24 h) unterschied sich deutlich zu den SA von G.o-WT. Der maximale Wert für die SA für G.o-PTB9018 liegt nach 10 h Kultivierung. Nach 6 h Kultivierung lag das Verhältnis der SA zwischen G.o-PTB9018/G.o- WTca. bei 3 fach, nach 10 h bei ca. 7 fach, nach 12 h bei ca. 5 fach, und nach 24 bei ca. 4 fach.

3.5.2 Kultivierung der G. oxydans Wildtyp, PBBR1MCS5, PTB9016, und PTB9018 auf Medium B (Natrium Gluconat Ethanol 0,5%)

Das Prinzip ist ähnlich wie bei der Kultivierung auf Medium A, anstatt Glucose 0,5 %, wurde zum Medium M Ethanol 0,5 % zugegeben.

• Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium B von G.o-WT mit G.o-PBBR1MCS5

Abb. 3-23 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und G.o- PBBR1MCS5(frisch transformiert) auf Medium B. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

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E rgebnisse

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Abb. 3-23 Vergleich der spezifische Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium B, zwischen G.o-WT und G.o-PBBR1MCS5 (frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

Die Wachstumsverläufe sind deutlich unterschiedlich, der G.o-WT erreicht nach 12 h eine OD 620 nm von 0,9, G.o-PBBR1MCS5 nur ein OD 620 nm 0,38. Der End-pH Wert für den WT ist 4,6, für G.o-PBBR1MCS5 ist 4,8. Im Laufe der Kultivierung (6 h, 10 h, 12 h) variiert die SA (G.o-WT, -PBBR1MCS5) nur geringfügig, nach der Kultivierungszeiten 6, 10, 24 h, war die SA bei G.o- PBBR1MCS5ca. 2 fach höher gegenüber G.o-WT, nach 12 h Kultivierungszeit ca. 3 fach höher.

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E rgebnisse

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• Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium B von G.o-WT mit G.o-PTB9016

Abb. 3-24 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und G.o- PTB9016auf Medium B. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

Abb. 3-25 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium B, zwischen G.o-WT und G.o-PTB9016 (frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

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E rgebnisse

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Das Wachstum von G.o-PTB9016 auf dem Medium B ist noch viel schlechter als gegenüber G.o-WT, denn die OD 620 nm nach 12 h ist ca. 0,2, und der End-pH-Wert ist 4,82. Für die SA gibt es deutliche Unterschiede im Vergleich mit dem G.o-WT. Nach 6 h ist die SA bei G.o-PTB9016, 4 fach höher gegenüber G.o-WT, nach 10 h / 12 h; 3 fach höher, und nach, 24 h 2 fach höher.

• Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium B von G.o-WT mit G.o PTB9018

Abb. 3-26 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und G.o- PTB9018auf Medium B. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

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E rgebnisse

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Abb. 3-27 Vergleich der spezifische Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium B, zwischen G.o-WT und G.o-PTB9018 (frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

Das Wachstum von G.o-PTB9018 ist fast ähnlich wie das Wachstum von G.o-PTB9016, der End-pH-Wert für das Kultivierungsmedium ist 5,0. Die SA von G.o-PTB9018 ist deutlich höher gegenüber G.o-WT, nach 6 h /10 h /24; ist die SA ca. 5 fach höher, und nach 12 h, ca. 4 fach höher.

3.5.3 Kultivierung der G. oxydans Wildtyp, PBBR1MCS5, PTB9016, und PTB9018 auf Medium C (Natrium Gluconat Glucose 0,3%)

Dieser Versuch wurde durchgeführt, um zu untersuchen, wie stark sich die SA der ADH mit einer Verminderung der Glucosekonzentration (Vergleich zwischen Kultivierung auf Medium A: Glucose 0,5 %, und Medium C: Glucose 0,3 %) ändert.

Jede zweite Stunde wurde eine Probe genommen für die Messung der OD 620nm und der pH-Werte.

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E rgebnisse

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• Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium C von G.o-WT mit G.o-PBBR1MCS5

Abb. 3-28 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und G.o- PBBR1MCS5auf Medium C. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

Abb. 3-29 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium C, zwischen G.o-WT und G.o-PBBR1MCS5 (frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

Im Gegensatz zur Kultivierung auf Medium A, wächst der G.o-WT etwa schlechter als G.o-PBBR1MCS5. Nach 12 h Kultivierung ist die OD 620nm bei

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E rgebnisse

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G.o-WT 0,8, während G.o-PBBR1MCS5 erreicht ein OD 620nm von 1, die pH-Verläufe sind ähnlich und erreichen nach 24 h Kultivierung ein pH von 4,5. Die SA für G.o-PBBR1MCS5 ist deutlich höher als die SA für den G.o-WT, nach 6 h ist ca. 4 fach höher, nach 10 h ca. 3 fach höher, und nach 12 h ca. 2 fach höher.

• Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium C von G.o-WT mit G.o-PTB9016

Abb. 3-30 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und G.o- PTB9016auf Medium C. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen.

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E rgebnisse

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Abb. 3-31 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium C, zwischen G.o-WT und G.o-PTB9016 (frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachtumsversuchen.

G.o-PTB9016 wuchs auf Medium C zu höherer End-OD als G.o-WT, nach 12 h Kultivierung war G.o-WT schon in der stationäre Phase, während, G.o- PTB9016immer noch in späte logarithmische Phase war. Die pH Profile sind gleich mit einem End-pH von 4,6.

Für G.o-PTB9016 ist die maximale SA nach 10 h (späte logarithmische Phase) Kultivierung zu sehen. Im Laufe der Kultivierung ist die SA von G.o- PTB9016immer höher als G.o-WT, nach 6 h ca. 6 fach-, nach 10 h ca.5 fach, nach 12 h ca. 3 fach-höher, und nach 24 h fast gleich groß.

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E rgebnisse

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• Vergleich der Ergebnisse der Kultivierung auf Medium C von G.o-WT mit G.o-PTB9018

Abb. 3-32 Wachstumstest und pH-Verlauf der Kultivierung von G.o-WT und G.o- PTB9018auf Medium C. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

Abb. 3-33 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium C, zwischen G.o-WT und G.o-PTB9018. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

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E rgebnisse

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Das Wachstum von G.o-PTB9018 auf Medium C ist am besten, nach 20 h Kultivierung ist die stationäre Phase noch nicht erreicht (mit einer OD ^620nm über 1,2) der final-pH für das Kultivierungsmedium ist um die 4,8. Die SA für G.o-PTB9018 erreicht ihr Maximum nach 10-12 h Kultivierung 2,01 U/mg und bleibt auch relativ hoch nach 24 h. Im Laufe der Kultivierung ist die SA für G.o-PTB9018 deutlich höher als der G.o-WT, nach 6 h ca. 8 fach-, nach 10 h bzw. 24 h ca. 9 fach-, und nach 12 h ca.10 fach höher.

3.5.4 Kultivierung von G.o-PTB9016 auf Medium D (Natrium Gluconat [Glucose 0,5%+ Ethanol 0,5%]).

Abb. 3-34 Spezifische Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium D, G.o- PTB9016(frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

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E rgebnisse

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Abb. 3-35 Spezifische Aktivität der ADH bei Kultivierung auf Medium D, G.o- PTB9016(frisch transformiert). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA aus drei unabhängigen Wachstumsversuchen.

Das Wachstum von G.o-PTB9016 auf Medium D ist etwa besser als auf Medium B, aber viel schlechter als auf Medium A und C. Dieser Versuch wurde mit der Absicht durchgeführt, dass die SA mit beiden C-Quellen Glucose und Ethanol viel höher als nur ein C-Quelle wird, aber die Ergebnisse zeigen das Gegenteil dazu.

Weil die SA von G.o-PTB9016 auf Medium D sehr schwach ist, wurde auf die weitere Kultivierungen verzichtet.

3.5.5 Vergleich der SA der ADH nach Kultivierung auf verschiedenen C-Quellen.

Im folgenden Graphiken der Abb 3-37 wurde das Vergleich der SA des ADH nach der Kultivierung von G.o-WT, -PBBR1MCS5, -PTB9016, -PTB9018 auf verschiedene C-Quellen zusammengefasst.

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Abb 3-37 Zusammenfassung der Ergebnisse der Kultivierungen

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E rgebnisse

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Bei allen 4 Stämmen, ist deutlich zu sehen, dass auf dem Medium A (Natrium Gluconat + Glucose 0,5%) die SA am höchsten ist, gefolgt von Medium C, Medium B, und Medium D.

3.5.6 Temperatureinfluss (-80°C) auf G. oxydans PTB9018

Die kompetenten Zellen von G. oxydans wurden mit dem Plasmid pTB9018 transformiert, nach 2 h Regenerierung wurde auf Mannitol-Agar ausplattiert. Die entstehenden, frisch transformierten, positiven Kolonien wurden auf Mannitol (Gentamycin/Cefoxitin) gezüchtet, ein Teil dieser Kultur wurde mit Glycerol für eine Nacht bei - 80°C aufbewahrt, das Rest wurde sofort für die Hauptkultur auf Medium A verwendet.

Die gefrorenen Zellen von G. oxydans PTB9018 wurden auch auf Medium A kultiviert. Nach 10 h, 12 h Kultivierung wurde jeweils (frische und gefrorene Zellen) eine Probe genommen.

Tab. 3-1 Spezifische Aktivität der ADH nach Inzucht von transformierten Zellen G. oxydans PTB9018 und nach Einfrieren und Auftauen der transformierten Zellen.

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E rgebnisse

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Abb. 3-38 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH nach Inzucht von transformierten Zellen G. oxydans PTB9018 und nach Einfrieren und Auftauen der transformierten Zellen. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte der SA (in MOPS-Puffer pH=6,5 200mM) aus drei unabhängigen Wachtumsversuchen.

Es gibt große Unterschiede der SA zwischen frisch- und gefrorene Zellen PTB9018.

Der Verlust der SA in Prozent bei gefrorenen Zellen ist nach: 10 h Kultivierung = 90 %. 12 h Kultivierung = 30 %

3.5.7 Einfluss der Pufferzusammensetzung auf die spezifische Aktivität der ADH.

Tab. 3-1 Vergleich der spezifischen Aktivität der ADH von G. oxydans -WT, -PTB9016, -PTB9018 auf verschiedene Puffer.

Der beste pH für die Enzymaktivität ist pH = 6. Aber MOPS-Puffer kann nur ab pH = 6,5 puffern. (Acetat-und Mavllvainepuffer besitzen die höchste SA bei pH = 6,0), deshalb wurde dieser Versuch nicht mit dem gleichen pH-Wert durchgeführt.

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E rgebnisse

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Abb. 3-369 Graphische Darstellung der spezifische Aktivität der ADH für G.o-WT und G.o-PTB9016 (Rohextrakte frisch verwendet) aus Tabelle 3-12. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus dreifachen Bestimmungen. MOPS-Puffer 200 mM pH = 6,5, Acetat-Puffer 200 mM pH = 6, Macllvaine-Puffer 100 mM pH = 6.

Abb. 3-40 Graphische Darstellung der spezifischen Aktivität der ADH für G.o-PTB9018 (Rohextrakt gefroren bei -20 °C) aus Tabelle 3-2. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus dreifachen Bestimmungen. MOPS-Puffer 200 mM pH = 6,5, Acetat-Puffer 200 mM pH = 6, Macllvaine-Puffer 100 mM pH = 6.

Die Rohextrakte von G.o-WT und G.o-PTB9016 wurden direkt frisch für den Enzymtest verwendet, der Rohextrakt von G.o-PTB9018 wurde nach einer Nacht bei - 20 °C verwendet, deshalb die Ergebnisse können nicht zusammen in einem Diagramm dargestellt werden. Der SA-verlauf ist ähnlich für alle drei Stämme (G.o-WT, G.o-PTB9016, G.o-PTB9018), der beste Puffer für ADH ist MOPS-Puffer 200 mM pH = 6,5, und der schlechteste ist Macllvaine-Puffer 100 mM pH=6.

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E rgebnisse

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3.5.8 Wirkung der Cofaktoren auf die spezifischen Aktivität der ADH

Tab. 3-2 Wirkung der Cofaktoren auf die spezifische Aktivität der ADH bei G.o-WT, G.o-PTB9016, und G.o-PTB9018.Frisch: Direkt nach dem Aufschluss wurde die Enzymaktivität bestimmt ohne Inkubation mit PQQ. 1x Einfrieren und Auftauen: Lagerung über Nacht der aufgeschlossenen Probe bei -20 °C. Die Probe wurde 10 min mit 4 µm PQQ, 2 mM Cacl 2 , und 2 mM Mgcl 2 inkubiert. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus dreifachen Bestimmungen.

Um zu sehen, ob es unterschiedliche Wirkungen der Cofaktoren auf die drei Untereinheiten der ADH gibt, wurde dieser Versuch mit allen drei Rohextrakten (G.o-WT, G.o-PTB9016, G.o-PTB9018) durchgeführt: Rohextrakt von G.o-WT: Enthält nur ADH mit drei Untereinheiten in kompakte Form.

Rohextrakt von G.o-PTB9016: Enthält ADH wie im G.o-WT + eine überexprimierte große Untereinheit A. Rohextrakt von G.o-PTB9018: Enthält ADH wie im G.o-WT + die überexprimierten große Untereinheiten A+B.

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E rgebnisse

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Abb. 3-41 Graphische Darstellung der Daten aus Tabelle 3-13.: Wirkung der Cofaktoren auf G.o-WT, G.o-PTB9016, und G.o-PTB9018 (Rohextrakt gefroren bei - 20 °C). Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus dreifachen Bestimmungen.

Nach dem Zusatz der Cofaktoren hat die SA für G.o-WT kaum geändert, im Gegensatz zu G.o-PTB9016/ G.o-PTB9018 ist die SA am höchsten bei frisch, und vermindert sich sowohl nach der Einfrierung (-20°C) als auch bei der Addition von Cofaktoren (Die Addition von Mg++ zeigt den niedrigsten Wert der SA).

3.6 Bestimmung der Km-Werte von ADH (G.o-WT, G.o-PTB9016, G.o-PTB 9018) für verschiedene Alkohole.

Für diesen Versuch wurde die Km-Werte bestimmt, um zu sehen, wie groß die Affinität der ADH für Ethanol, Propanol 1, Butanol 1, Propanol 2, Butanol 2 ist,

und gleichzeitig die Interaktion der drei Untereinheiten der ADH untersucht, denn die Änderung der Konformation wirkt auf die Affinität.

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E rgebnisse

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ADH + S

Nach Michaeilis-Menten:

Die Bestimmung von Km-Werte und Vmax.ergibt sich nach der Messung der katalytische Geschwindichkeit der ADH bei verschiedenen

Substratkonzentrationen. Es ist vorteilhaft, die Michaeilis-Menten-Beziehung in eine Gleichung umzuwandeln, die den Sachverhalt in der Form einer Gerade wiedergibt.

Dies gelingt, wenn man von beiden Seiten der Gleichung den Kehrwert nimmt:

Trägt man 1/v gegen 1/[S] auf, so ergibt sich eine Gerade mit dem Ordinatenabschnitt 1/Vmax und der Steigung Km/Vmax. In diesem Versuch wurde es nur die Km bestimmt, deshalb wurde die Auswertung nur mit ∆E/min durchgeführt.

Km wurde durch doppeltreziproke Darstellung der ADH-Kinetik (Lineweaver-Burk-Diagramm) bestimmt: 1/v ist als Funktion von 1/[S] aufgetragen. Die Steigung der Geraden ist Km/Vmax, der Y-Achsenabschnitt 1/Vmax und X-Achsenabschnitt -1/Km [32].

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E rgebnisse

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Tab. 3-3 Vergleich der Km der ADH (G.o-WT, G.o-PTB9016, G.o-PTB9018) für verschiedene Alkohole. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus dreifachen Bestimmungen.

Die Affinität der ADH zu den Alkoholen mit OH-Gruppe in Position 1 (Ethanol, Propanol 1, Butanol 1) ist deutlich höher als zu den Alkoholen mit OH Gruppe in Position 2 (Propanol 2, Butanol 2).

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D iskussion

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4 Diskussion

Zum einem wurde in der vorliegenden Diplomarbeit die Expression der ADH in E. coli untersucht. Danach wurden dazu das Wachstumsverhalten und pH-Verlauf von G. oxydans auf verschiedenen C-Quellen unter definierten Bedingungen untersucht, und die SA nach 6, 10, 12, und 24 h Kultivierung ermittelt. Zum anderen wurde der Einfluss einiger Enzymassaypuffer und einiger Cofaktoren auf die ADH-Aktivität getestet.

4.1 Expression der ADH in E. coli

Die Expression der ADH könnte in dieser Arbeit nur durch den Enzymtest identifiziert. (Aus finanziellen Gründe könnte keine Westernblot durchgeführt).

Die ADH-Expression in E. coli wurde durch die Enzymaktivitätsmessung überprüft. Es konnte keine Aktivität nachgewiesen werden, obwohl PQQ zum Rohextakt zugegeben wurde. Trotz Transformation der Stämme E.c- PTB9016/E.c-PTB9018mit dem Plasmid pEC86 (enthält Gene für die Bildung von Cyt c). Es könnte sein, dass die ADH bzw. ADH-Cyt c Inclusions-Bodies in E. coli bilden und deshalb inaktiv waren. Es könnte auch sein, dass die ADH Helferproteine benötigt, die nicht im E. coli vorhanden sind. Diese Helferproteine sind wichtig für die effektive Rückfaltung der ADH bzw. ADH-Cyt c in der aktiven Form [33].

Eine andere Vermutung ist, dass der Promotor der ADH-Cyt c Gene nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird. Eine weitere Ursache für fehlende Enzymaktivität könnte auch die Unfähigkeit von E. coli darstellen, bestimmte Posttranslationsmodifikation, die für die Enzymaktivität essentiell sind, durchzuführen. Weiterhin könnte die Signal-Sequenz, die für die Lokalisation der ADH-Cyt c in der Membran notwendig ist, in E. coli nicht funktionsfähig sein oder ADH wurde durch Proteasen abgebaut [34].

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D iskussion

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4.2 Expression der ADH in G. oxydans

Die bei G. oxydans fehlenden Enzyme der zentralen Stoffwechselwege, die z.B. zu dem unvollständigen Zitratzyklus führen, zwingen diesen Organismus zur unvollständigen Oxidation der entsprechenden Substrate. Diese Reaktionen werden in der Regel von membrangebundenen Dehydrogenasen (u.a. ADH) katalysiert. Dabei ragt das aktive Zentrum der Enzyme in den periplasmatischen Raum, so dass ein Transport der entsprechenden Substrate über die Cytoplasmamembran nicht notwendig ist. Die bei den unterschiedlichen Dehydrogenierungsreaktionen frei werdenden Elektronen gehen über Cytochrome oder Ubichinonpool in die Atmungskette ein [33]. Eine charakteristische Eigenschaft von G. oxydans sind die geringen Wachstumserträge, also die langsame Produktion von Biomasse. Dieses ist unter anderem eine der Eigenschaften, die Gluconobacter für biotechnologische Anwendungen interessant macht. Das Wachstum von G. oxydans -PBBR1MCS5, -PTB9016, und -PTB9018 auf Medium A und C (Glucose als C-Quelle) ist schneller als Medium B/D (Ethanol als C-Quelle). Ein Grund dafür könnte sein, dass 0,5 % Ethanol toxisch für die Zellen ist. Es könnte auch sein, dass die Überexpression der ADH die normale Expression der Acetaldehyddehydrogenase steigt, d.h. Ethanol wird schnell zum Acetaldehyd umgesetzt, der langsam zum Acetat entgiftet wird. Acetaldehyd ist toxisch für die Zellen. Beim G.o-WT gibt es keine Wachstumsunterschiede auf Medium A/B/ und C, man könnte vermuten, dass die ADH und die ALDH in gleichen Mengen exprimiert, d.h. Acetaldehyd schnell in Acetat umgesetzt wird.

Für alle Kultivierungsversuche (A, B, C) wurde gefunden, dass die SA bei G.o-PBBR1MCS5 relativ höher ist als der G.o-WT. Der leere Vektor pBBR1MCS5 enthält 2 Gene: Das Lac Z (α) Gen (ß-Galaktosidase) und das Gentamycin-Resistanz Gen. Es könnte sein, dass G.o-PBBR1MCS5 mehr Proteine als bei G.o-WT exprimiert wurden, d.h. besser induzierbar. (Direkte Mitteilung von Fr, Mennenga).

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D iskussion

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Für G.o-PTB9018 war die SA viel höher als G.o WT und G.o-PBBR1MCS5, und höher als G.o-PTB9016 (Die SA von G.o-PTB9018 im Vergleich mit G.o- PTB9016nach 10 h Kultivierung auf Medium A ca. 3,5 fach-, auf Medium B und C ca. 2 fach höher. Dieser Unterschied lag am zusätzlichen Gen für Cytochrom c bei G.o-PTB9018.

Weiterhin wurde festgestellt, dass die Untereinheit ADH (A) ein und die Untereinheit Cyt c (B) drei Häm c-Moleküle enthalten. Zwei der Hämgruppen der Untereinheit B und die der Untereinheit A sind in den intramolekularen Elektronentransport der ADH auf Ubichinon involviert [35]. G.o-PTB9016 besitzt nur eine Untereinheit, es könnte deshalb sein, dass für den Elektronentransport das bereits vorhandene Cyt c dient. Es wurde auch gezeigt, dass die Cyt c-Untereinheit essentiell für die Ethanol Oxidase-Atmungskette ist und als Bestandteil einer alternativen, Cyanid-insensitiven Atmungskette von G. oxydans dient [36]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die durch die membrangebundene Alkoholdehydrogenase katalysierte Reaktion reversibel ist, so dass das Protein sowohl Ubichinon reduzieren als auch Ubichinol oxidieren kann [37]. Wegen dieser Eigenschaft der Elektronenübertragung hat die ADH eine große Bedeutung in der Biosensorenindustrie [38].

Für die Kultivierung auf Medium A/C wurde festgestellt, dass die SA der ADH kurz vor der stationären Phase (späte logarithmische Phase) am höchsten war. Die Kultivierung der Zellen erfolgte unter Verbrauch der Glucose und Abfall der pH-Werte. Nach einem Abschnitt verzögerten exponentiellen Wachstums (späte exponentielle Phase) folgte eine stationäre Phase, die durch eine stark verminderte Zellteilungsrate gekennzeichnet war. Dieser Wachstumsverlauf korreliert mit dem Glucoseverbrauch. Der Übergang von der logarithmischen zur stationären Wachstumsphase war durch einen starken Anstieg der ADH-Aktivität gezeichnet. Eine Ausnahme bildete die

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D iskussion

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Kultivierung von G.o-PTB9018 auf Medium C, hierbei war die stationäre Phase nach 24 h Kultivierung noch nicht erreicht, deshalb ist es deutlich zu sehen, dass die SA der ADH nach 10 h, 12 h, 24 h ungefähr gleich hoch ist. (ca. 2 U/mg). Aufgrund des Aufbaus der Experimente war es nicht möglich die SA im Kultivierungszeitraum von 12-24 h und nach 24 h zu bestimmen. Deshalb konnten keine Aussagen über die SA in genannten Zeiträumen gemacht werden. Auf jeden Fall konnte gezeigt werden, dass die SA von überexprimierter WT von Gluconobacter auf Medium mit Glucose höher war gegenüber Medium mit EtOH. Die Ursache könnte darin liegen, dass Glucose in Verbindungen umgesetzt wird, die die Expression der ADH induzieren. Eine mögliche Begründung der Tatsache, dass die SA in der spätlogarithmischen Phase am höchsten war, ist der Stresszustand. Den Bakterien stand in der spätlogarithmischen Phase nur noch wenig Glucose als Substrat zur Verfügung. Weiterhin könnte der

Sauerstoffübergangskoeffizient aufgrund der hohen Zelldichte vermindert sein. Dieser Stresszustand könnte zur Expression in den Proteinen geführt haben. (Direkte Mitteilung von Fr. Mennenga).

4.3 Einfluss der Einfrierung bei - 80 °C auf die Zellen G.o-PTB9018

Der Einfluss der Temperatur (-80 °C) wurde frisch transformierten Zellen G.o- PTB9018vor und nach dem Einfrieren getestet. Der Verlust der SA der ADH (30 bis 90 %) bei den gefrorenen transformierten Zellen, könnte erklärt werden, entweder, dass der Vektor unstabil war (direkte Mitteilung von Hr.Prof Görisch), oder die Superhelizität des Vektors und damit die Genexpression durch bestimmte Umweltbedingungen beeinflusst wurden, wie z.B. Veränderungen der Temperatur oder der Osmolarität des Mediums [39].

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D iskussion

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4.4 Einfluss der Pufferzusammensetzung und der Cofaktoren auf die SA der ADH

Der beste Puffer für die Bestimmung der Enzymaktivität war MOPS-Puffer (pH=6,5 200 mM), , Im Gegensatz dazu war Macllvaine Puffer der schlechteste Puffer für ADH (Enthält höhe Konzentration von Phosphationen, die mit Calcium ausgefällt werden).

Die untersuchte Cofaktoren hatten keine positiven Effekte auf die Enzymaktivität der ADH. In der Literatur ist beschrieben, dass die ADH Ca ⁺⁺ (2mM) und PQQ (4µM) benötigt [40]. Es könnte sein, dass ADH genug Calcium vom Medium gebunden hat. Weiterhin wurde vermutet, dass der Stamm selbst genug PQQ produziert. Diese Tatsachen machen G. oxydans noch interessanter. für die biotechnologische Fragestellungen. Für eine großtechnische Herstellung und z.B.Vitamin PQQ sind jedoch weitere Studien notwendig. Daraus ergibt sich möglicherweise ein neues Anwendungsgebiet für die biotechnologischen Einsatz von G. oxydans zur Synthese des neuen Vitamins [41].

Der Effekt des Einfrierens von dem Zellfreirohextrakt bei - 20 °C hatte einen leichten Effekt (Abnahme der SA), d.h. ADH ist ein relativ stabiles Enzym.

4.5 Vergleich der Affinität der ADH zu verschiedenen Substraten

Dieser Versuch wurde durchgeführt, um die Affinität der ADH zu verschiedenen Substrate zu bestimmen, und um die Interinteraktion der drei Unterinteraktion zu untersuchen. Man könnte feststellen, dass es keine Interinteraktionnen gibt, denn die Km-Werte (G.o-WT/ G.o-PTB9016/ G.o- PTB9018)sind für jedes Substrat ungefähr gleich (d.h. die Konfirmation vom aktiven Zentrum blieb unverändert, unabhängig davon, ob das Enzym nur aus einer Untereinheit A, oder zwei Untereinheiten A+B, oder aus drei Untereinheiten (A+B+S) bestand. Für Ethanol, Propanol 1, Butanol 1, waren die Km-Werte viel kleiner als für Propanol 2 und Butanol 2. Das bedeutet,

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D iskussion

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dass ADH eine höhere Affinität zu den Alkoholen hatte, die die OH-Gruppen in der Position 1 hatten, gegenüber Alkoholen mit OH-Gruppen in der Position 2.

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A usblick

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5 Ausblick

Die gelungene Überexpression der ADH von G. oxydans stellt ein Fundament für weitere Untersuchungen dar, um die biochemischen Mechanismen von G. oxydans besser verstehen zu können (z.B. Effekt von Ethanol und Glucose auf die Expression der ADH). Im Laufe der Kultivierung muss der Glucose- und Ethanolverbrauch gemessen und mit der SA korreliert werden. Weiterhin sollten die Stoffwechselwege identifiziert werden, um zu sehen welche Verbindungen für die ADH-Induktion entstanden sein könnten. Eine Überexpression von Cytochrom c, von den Genen für Ubiquinone Q 10 -Synthese und für Cytochrom o-Oxidase könnten weitere positive Effekte auf die Elektronentransportkette haben. Wie von Kornberg [32] empfohlen, sollten die genauen kinetischen Eigenschaften sowie die Enantioselektivität der ADH mit einem gereinigten Enzym ermittelt werden. Nach Reinigung der Untereinheiten A, B, und S könnten die Dehydrogenase (A) und die Komplexe AB und ABS getrennt untersucht werden.

Um das Wachstumsverhalten von Gluconobacter besser bestimmen zu können und gleichzeitig mehrere Proben zu nehmen, ist es sinnvoll mit einem Fermenter zu arbeiten, der eine genaue Messung und Kontrolle von Sauerstoffverbrauch, Wachstumsrate, pH, Temperatur, Rührerdrehzahl und Druck ermöglicht.

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Z usam m enfassung

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6 Zusammenfassung

1) Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Gen (A) und /oder das Gen (B) der ADH von G. oxydans amplifiziert und in den Vektor pBBR1MCS5 ligiert.

2) Die entstehenden Plasmide wurden jeweils in E. coli kloniert und damit G. oxydans transformiert.

3) Die Klone von E.coli wurden auf LB/MM-M9 isoliert. Bei E. coli und E.coli + pEC86 konnte keine ADH-Aktivität nachgewiesen werden. Die entstehenden Stämme von G. oxydans wurden auf verschiedenen Medien kultiviert: Der beste Medium mit der höchste SA war Medium A (Natrium Gluconat Medium + Glucose 0,5%) gefolgt von Medium C (Natrium Gluconat Medium + Glucose 0,3%), Medium B (Natrium Gluconat Medium + Ethanol 0,5%), und Medium D (Natrium Gluconat Medium + Glucose 0,5% + Ethanol 0,5%). Die ADH-Aktivität wurde im Laufe der Kultivierung (6, 10, 12, 24 h) bestimmt. 4) Es wurde die Wirkung von -80 °C auf die Expression der ADH und Stabiltät des Klons von G.O-PTB9018 untersucht. 5) Der optimalte Puffer für den Enzymassay wurde bestimmt (MOPS-Puffer pH=6,5 200 mM).

6) Es wurde auch festgestellt, dass ADH die benötigten Calciumionen des Mediums gebunden hatte. Außerdem könnte sein, dass dieser Stamm genug PQQ produzierte.

7) Eine Analyse des Substratspektrums der ADH wurde durchgeführt. Aufgrund, der in dieser Arbeit erzielten Resultate konnte ADH charakterisiert werden, die Affinittät der ADH für primäre Alkohole war höher als sekundäre Alkohole.

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Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Biotechnolgie Fachgebiet Technische Biochemie, der TU Berlin anfertigt.

Herrn Prof. Dr. H. Görisch danke ich für die Überlassung des Themas, für die freundliche Aufnahme und Bereitstellung des Arbeitsplatzes.

Herrn Prof. Dr. P. Fischer danke ich auch für die großzügige Unterstützung und sein großes Interesse am Fortgang der Arbeit.

Bei Herrn Prof. Dr. W Schilf bedanke ich mich für die freundliche Übernahme des Korreferates.

Vor allem möchte ich mich bei Frau Dipl. Biol. Bina Mennenga für ihre ständige Diskussionsbereitschaft und für die Ratschläge, die diese Arbeit begleitet haben, bedanken.

Allen Mitarbeitern des Instituts für Biotechnologie gilt mein Dank für ihre Hilfsbereitschaft. Besonders herzlich danke ich Niels Hempel, Viola Khodaverdi, Gaby Wagner, Seung-Wook Ha und Marcus Moreno für die freundliche Unterstützung und die kollegiale Zusammenarbeit.

Zu guter Letzt möchte ich meiner Frau, meinen Eltern und meinen Geschwistern danken.

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Ich erkläre an Eides statt, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfaßt, andere als die angegebenen Quellen nicht benutzt und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe.