Inhaltsverzeichnis

1  Einleitung  3

2  Material und Geräte.  4

2.1  Organismen und Plasmide.  4

2.2  Chemikalien und Lösungen.  4

2.3  Geräte  6

3  Durchführung  7

3.1  Transformation aus Übernachtkultur Escherichia coli DH5α  7

3.2  Plasmidisolierung durch Minipräpäration  7

3.3  Herstellen eigener Glasmilch  9

3.4  Aufreinigung  9

3.5  Restriktionsverdau.  11

3.6  Gelelektrophorese.  13

3.7  Konzentrationsbestimmung.  14

4  Ergebnisse  15

4.1  Transformationseffizienz  15

4.2  Wiederfindung der λ-DNA mit Glasmilch der Firma Fermentas  16

4.3  Vergleich λ-DNA- Plasmid pBR322-Aufgereinigt mit Glasmilch  17

4.4  Vergleich von Fermentas- und Brillenglas-Glasmilch.  17

4.5  Vergleich von Fermentas- und Fensterglas-Glasmilch  18

4.6  Vergleich der Elutionsmittel und Elutionsmittelmenge  18

4.7  Aufreinigung von DNA mit Glasmilch auf Mikro-Zentrifuge.  19

4.8  Aufreinigung mit Affinitätssäulen  21

4.9  Gesamtvergleich aller Aufreinigungsmethoden.  21

4.10  Vergleich der Konzentrationsbestimmungsmethoden  23

4.10.1  Vergleich von Hoefer DQ 300 und Fluostar  23

4.10.2  Gelelektrophorese.  25

4.10.3  Farbstoff-Wahl  34

5  Diskussion  35

5.1  Transformationseffizienz  35

5.2  Glasmilchaufreinigung  35

5.2  Affinitätssäulenaufreinigung.  36

5.3  Vergleich von Glasmilch und Affinitätssäulen  37

5.4  Vergleich von Hoefer DQ 300 und Fluostar  37

5.6  Gelelektrophoresen.  38

6  Ausblick  39

7  Literatur.  40

8  Anhang  41

8.1  Zusammensetzungen von Medien und Lösungen  41

8.2  Abkürzungen  44

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1 Einleitung

In dieser Studienarbeit sollte versucht werden das Plasmid pBR322 mit Glasmilch aufzureinigen. Um jedoch vorher die Effektivität dieser Methode zu ermitteln, sollte Lambda-DNA mit einer genau bekannten Konzentration aufgereinigt werden. Weiterhin sollte die Methode der Glasmilchaufreinigung mit der Methode der Affinitätssäule verglichen werden.

Schon in den 70er Jahren wurden die ersten DNA-Aufreinigungsversuche mit Glasmilch durchgeführt. Sie hat ihre Bedeutung aber größtenteils verloren, als Affinitätssäulen in Kits auf den Markt kamen, welche zwar teuerer sind, aber höhere Ausbeuten und schnellere Durchführung versprechen. Glasmilch ist eine Suspension von Glas in Wasser. Die DNA bindet unter Anwesenheit des Bindungs-Puffers, welcher ein chaotropes Salz (z.B. NaI) enthält, an die Glaspartikel. Danach wird mit einem Waschpuffer, bestehend aus Tris, NaCl und EDTA, gewaschen. Im letzen Schritt kann die DNA mit Wasser oder TE-Puffer eluiert werden. Heutzutage arbeitet man meist mit Silicamembranen anstelle von Glasmilch, was die Handhabung erheblich erleichtert. Auf dem Markt gibt es je nach aufzureinigendem Ausgangsmaterial spezielle Aufreinigungskits, wie z.B. kleine, mittlere oder große Fragmente. Auch der Begriff „Glasmilch“ wird heutzutage nur noch selten verwendet, meist findet man „silica gel based DNA purification“ ^[14] .

Danksagung

An dieser Stelle möchten wir uns bei Frau Steffen und Herrn Schmietenknop für die Unterstützung und das Anleiten beim Erlernen neuer Arbeitstechniken bedanken. Nicht zuletzt durch die freundliche und engagierte Betreuung hat uns diese Studienarbeit viel Freude bereitet.

Außerdem gilt unser Dank Herrn Prof. Pfitzner für das Thema und die Unterstützung.

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2 Material und Geräte

2.1 Organismen, Plasmide und Enzyme Bakterienstamm: Escherichia coli DH5α Plasmid: pBR322 Plasmid: pUC18 Lambda-DNA (λ-DNA)

Restriktionsenzym: FastDigest™ HindIII (Fermentas) Restriktionsenzym: HindIII (Fermentas) Enzym: Ribonuklease A (kurz: RNase)

2.2 Chemikalien und Lösungen

Zusammensetzungen und Konzentrationen im Anhang

Transformation

LB-Medium (fest) LB-Medium (flüssig) LBC-Medium (fest) CaCl 2 50 mM

Minipräperation

TE-Puffer GTE-Lösung (Glucose/Tris/EDTA) SDS/NaOH-Lösung KOAc-Lösung Isopropanol Ethanol

Bestimmung der DNA-Konzentration durch Fluoreszensmessung 10x TNE Puffer Hoechst 33258 dye stock Lösung Low Range Assay Lösung PicoGreen Farbstoff

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Aufreinigung mit Glasmilch TE-Puffer

Bindungspuffer (der Firma Fermentas) Osmose-Wasser Waschpuffer (der Firma Fermentas)

Aufreinigung mit Affinitätssäule Bindungspuffer (der Firma Invitrogen) Waschpuffer (der Firma Invitrogen) Elutionpuffer (der Firma Invitrogen)

Gelelektrophorese

0,9 %iges Agarose Gel TAE-Puffer Syber-Safe Loading Dye

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2.3 Geräte

Reaktionsgefäße (1,5 ml)

Pinzette Petrischalen Impföse Drigalskispatel Bunsenbrenner Wasserbad Bio-Med Therrmocycler 60 Eisbad

Mikropipetten mit Einmal-Pipettenspitze Schottflasche Erlenmeyer-Kolben Tischautoklav 13-200 ES Ultrazentrifuge Sigma 1-15 Mikrozentrifuge Gerlinde kisker Photometer Hoefer DQ 300 Photometer Fluostar Kunststoffküvetten Schwarze Mikrotiterplatte Vortex-Rührer Stoppuhr Falconröhrchen Plastiktüte Hammer Mörser Pistel

Biometra Standart Power Pack P25 Erlektrophorese Serva Blue Marine 100 Färbeschale UV-Lampe Kamera

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3 Durchführung

3.1 Transformation aus Übernachtkultur Escherichia coli DH5α

Das LB-Medium wurde, wie unter 8.1 (Zusammensetzung von Medien und Lösungen) angegeben, zweimal zu je 500 ml hergestellt.

Am darauf folgenden Tag wurde der Stamm Escherichia coli DH5α auf LB-Medium ausgestrichen. Üblicherweise erfolgt die Inkubation über Nacht bei 37 °C. Da aber das Wochenende anstand, wurde bei 15 °C für 60 h inkubiert. Aus der obigen Kultur wurde Zellmaterial von etwa 3 mm Durchmesser in 250 µl im Reaktionsgefäß vorgelegte 50 mM CaCl 2 -Lösung gegeben und vorsichtig gemischt. Dieses wurde im Eisbad 20 min heruntergekühlt und anschließend wurde 10 µl pBR322 zugegeben (0,005 µg/ml). Nach dem wiederholten Durchmischen wurde das Reaktionsgefäß für 90 s in ein 42 °C temperiertes Wasserbad gestellt und danach sofort in einem Eisbad abgekühlt. Zum abgekühlten Ansatz kamen 250 µl flüssiges LB-Medium und dieser wurde bei Raumtemperatur 30 min stehen gelassen. Zuletzt wurden 100 µl davon auf eine mit LBC-Medium (fest) gefüllte Petrischale pipettiert und anschließend mit einem Drigalskispatel durch kreisende Bewegungen gleichmäßig verteilt. Am darauf folgenden Morgen wurden vier einzelne Kolonien mit einer Impföse von dem Medium abgenommen und in jeweils einen 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikane gegeben, in dem sich 25 ml steriles LB-Medium (flüssig) befanden. Zu jedem Kolben wurden 50 µl Carbencillin gegeben und über Nacht bei 37 °C im Brutraum inkubiert (140 upm) ^[7] .

3.2 Plasmidisolierung durch Minipräpäration

3.2.1 Isolierung von Plasmid pBR322

Für die Isolierung vom Plasmid pBR322 wurde das Ausgangsmaterial aus 3.1 verwendet. Als erstes wurde die Übernachtkultur gut durchmischt. Danach 1ml abgenommen und in ein Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde eine Minute bei 5000 upm in der Zentrifuge Sigma 1-15 zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 100 µl eiskalter GTE-Lösung vollständig resuspendiert. Dabei wurde darauf geachtet, dass sich keine sichtbaren Zellklumpen mehr in dem Reaktionsgefäß

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befanden. Im Anschluss daran wurden 200µl SDS/NaOH-Lösung hinzu gegeben, das Reaktionsgefäß mehrfach invertiert und für 5 min auf Eis inkubiert. Danach wurden 150.µl eiskalter KOAc-Lösung in das Reaktionsgefäß pipettiert und wieder für 5 min auf Eis inkubiert. Daraufhin wurde das Reaktionsgefäß bei 14.000 upm für 5 min zentrifugiert. Aus dem erhaltenen Überstand wurden 400 µl in ein neues Reaktionsgefäß pipettiert. Dabei musste darauf geachtet werden, dass kein Niederschlag und nichts von dem sich auf der Oberfläche gebildeten Film mit überführt wurde. Das Reaktionsgefäß mit dem Niederschlag wurde verworfen. Zu dem Überstand im neuen Reaktionsgefäß wurden 400 µl Isopropanol pipettiert und direkt im Anschluss mehrfach invertiert. Nach 2.min wurde das Reaktionsgefäß bei 14.000 upm für 5 min zentrifugiert. Danach wurde der Überstand entfernt, 1 ml 96 %iger Ethanol hinzu pipettiert, mehrfach invertiert und erneut bei 14.000 upm für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abdekantiert um das Pellet nicht zu zerstören. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß 15.min offen stehen gelassen um das Pellet zu trocknen. Im letzen Schritt wurde das Pellet in 15 µl TE-Puffer gelöst. Hierfür wurde das Pellet mehrfach mit der Pipette aufgezogen und wieder ins Reaktionsgefäß zurück pipettiert bis das Pellet vollständig gelöst war. Die Minipräparation wurde mit mehreren Reaktionsgefäßen parallel durchgeführt. Diese wurden am Ende der Präparation in einem Gefäß zusammengeführt. Die Minipräparation wurde im Laufe der Studienarbeitarbeit fünfmal mit unterschiedlichen Mengen durchgeführt. Insgesamt wurden 40.ml des flüssigen LB-Mediums mit Carbencillin aus der Übernachtkultur genutzt ^[9] .

3.2.2 Plasmidisolierung von pUC18

Für die Isolierung vom Plasmid pUC18 standen bereits transformierte E.coli DH5 α Kolonien bereit. pUP18 hatte eine Insertion von ungefähr 1000 bp. Bevor wie unter 4.2.1 beschrieben, eine Minipräparation durchgeführt werden konnte, mussten zwei einzelne Kolonien mit einer Impföse von dem Medium abgenommen und in jeweils einen 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen gegeben werden. In den Erlenmeyerkolben befanden sich 25 ml steriles LB-Medium (flüssig). Zu jedem Kolben wurden 50 µl Carbenicillin gegeben und über Nacht bei 37 °C im Brutraum inkubiert (140 rpm). Diese Plasmidisolierung wurde im Laufe der Studienarbeit dreimal durchgeführt. Dabei wurden insgesamt 30 ml des flüssigen LB-Mediums mit Carbencillin aus der Übernachtkultur genutzt.

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3.3 Herstellen eigener Glasmilch

Für die Herstellung der eigenen Glasmilch wurde ein bereitgestelltes Brillenglas zuerst mit dem Hammer grob zerkleinert. Dazu wurde das Brillenglas in eine Plastiktüte gesteckt, um Glassplitter am Flug zu hindern. Anschließend wurde das grob zerkleinerte Glas in einen Porzellanmörser überführt und ungefähr 2 h mit dem Pistill gemörsert. Der feine Glasstaub wurde in Falconröhrchen überführt. Ein Teil des Glaspulvers wurde zur Herstellung einer eigenen Glasmilch eingesetzt. Hierzu wurden 4 Volumenteile Glaspulver in 3 Volumenteilen bidest. Wasser suspendiert. Bei der Herstellung der Glasmilch aus dem bereitgestellten Fensterglas wurde gleichermaßen verfahren.

3.4 Aufreinigung

3.4.1 Aufreinigung von Lambda-DNA mit Glasmilch von Fermentas

Als Ausgangmaterial lag Lambda-DNA bereits aufgereinigt in einer bekannten Konzentration (0,3 µg/µl) vor.

Eine aliquote Menge an Glasmilch wurde zur DNA-Suspension geben (max. 2 µg DNA pro µl Glasmilchsuspension) ^[8] . Anschließend wurden drei Volumenteile Bindungspuffer je Volumenteil DNA-Suspension hinzugeben und für 5 min bei 55 °C inkubiert. Dabei wurde das Reaktionsgefäß alle 2 min gut durchmischt. Nach der Inkubation wurde die Glasmilch bei 14.000 upm für 5 s abzentrifugiert und der daraus gewonnene Überstand vorsichtig entnommen und verworfen. Zu dem Pellet wurden 500 µl Waschpuffer hinzubegeben und anschließend das Pellet auf dem Vortex resuspendiert. Nun wurde wiederholt bei 14.000 upm für 5 s zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Waschvorgang wurde dreimal durchgeführt. Die an der Glasmilch gebundene DNA wurde mit Osmose-Wasser und später zum Testen auch mit TE-Puffer eluiert. Dafür wurde die Glasmilch mit einer möglichst kleinen Menge Flüssigkeit resuspendiert und für 5 min bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurde die Glasmilch bei 14.000 upm für 30 s wieder abzentrifugiert. Der Überstand konnte nun vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß abdekantiert werden. Der Vorgang des Eluierens wurde zweimal durchgeführt ^[8] .

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