Tierexperimentelle Untersuchung zum Einfluss von Sirolimus auf die Wundheilung

Tag der Mündlichen Prüfung: 06. Mai 2008

Abstract

Problem:

Klinisch führt das bei der Transplantation solider Organe eingesetzte immunsuppressive Medikament Sirolimus zu vermehrten Wundheilungsstörungen. Die hierbei zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Sirolimus auf standardisierte Parameter der akuten Wundheilung und auf die Ex- pression der Wundmediatoren Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Transforming Growth Factor (TGF-ß) und induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) zu prüfen. Methode:

Als Versuchstiere wurden 44 männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet, die in Vollnarkose eine dorsale Hautinzision erhielten. Bei dem Eingriff wurden zudem 10 Polyvinylalkohol-Schwämmchen subkutan unter die Rückenhaut implantiert. Die Tiere wurden in vier Gruppen unterteilt und Sirolimus wurde über 10 Tage in verschiedenen Dosierungen oral appliziert (Gruppe SIR0.5: 0,5 mg/kg KG, Gruppe SIR2: 2 mg/kg KG, Gruppe SIR5: 5 mg/kg KG und eine Kontrollgruppe). Am 10. postoperativen Tag wurden die Tiere eingeschläfert, die Schwämmchen explantiert und die dermale Wunde entnommen. Die Wunden und die Schwämmchen wurden sowohl histologisch als auch immunhistochemisch untersucht. Zudem wurde die Reißfestigkeit der Wunden geprüft und der Hydroxyprolingehalt des Granulationsgewebes bestimmt.

Ergebnis:

Die Behandlung mit Sirolimus wurde von den Tieren gut vertragen. Der postoperative Gewichtsverlauf der Tiere der Kontrollgruppe unterschied sich nicht signifikant vom Gewichtsverlauf der Tiere der Behandlungsgruppen. Bei den Tieren der Gruppen SIR2 und SIR5 zeigte sich am 10. postoperativen Tag eine Beeinträchtigung der Wundheilung in Form eines verminderten Hydroxyprolingehaltes im Granulationsgewebe und einer verminderten Wundreißfestigkeit. Zudem deutete die immunhistochemische Untersuchung des Wundgewebes auf einen verminderten Gehalt an VEGF, TGF-ß und iNOS hin. Diskussion:

Unsere Untersuchung hat erstmals tierexperimentell eine Hemmung der Wundheilung durch Sirolimus gezeigt. Dies spiegelte sich in einer verminderten Expression von Wundmediatoren wider. Ob diese Beeinträchtigung des Wundheilungsprozesses reversibel ist oder in Abhängigkeit von der Dauer der Therapie steht, bleibt zu untersuchen.

Für meine lieben Eltern,

für unsere Ömi.

Inhaltsverzeichnis

1  Einleitung  9

2  Stand der Forschung  11

2.1  Wundheilung  11

2.2  Einfluss der immunsuppressiven Therapie auf die Wundheilung  14

2.3  Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)  17

2.4  Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß)  18

2.5  Induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS)  20

3  Fragestellung  22

4  Material und Methoden  23

4.1  Material  23

4.1.1  Versuchstiere  23

4.2  Methoden  24

4.2.1  Sirolimus-Applikation  24

4.2.2  Operation  24

4.2.3  Materialgewinnung und Materialverarbeitung  25

4.2.4  Sirolimus-Bestimmung im Serum  28

4.2.5  Messung der mechanischen Reißfestigkeit der Wunde  28

4.2.6  Hydroxyprolinbestimmung  29

4.2.7  Bestimmung von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in  der

  Wundflüssigkeit  32

4.2.8  Bestimmung von Transforming Growth Factor (TGF-ß) in  der

  Wundflüssigkeit  33

4.2.9  Bestimmung der Gesamtproteinmenge in der Wundflüssigkeit  34

4.2.10  Histologische Übersichtsfärbung (Hämatoxylin-Eosin Färbung)  35

4.2.11  Immunhistochemische Färbung  36

4.3  Datenverarbeitung  41

4.3.1  Software  41

4.3.2  Statistische Auswertung  41

5  Ergebnisse  42

5.1  Einfluss von Sirolimus und Operation auf das Körpergewicht  42

  5  

5.2  Einfluss von Sirolimus auf die Wundheilungsparameter  44

5.2.1  Wundreißfestigkeit der formalinfixierten Hautproben  44

5.2.2  Hydroxyprolingehalt des Granulationsgewebes  45

5.2.3  Einfluss von Sirolimus auf die Konzentration von VEGF und TGF-ß  47

5.2.4  Gesamtproteinkonzentration in der Wundflüssigkeit  49

5.2.5  Histologische Übersichtsfärbung (Hämatoxylin-Eosin Färbung)  50

5.2.6  Immunhistochemische Färbung  55

6  Diskussion  76

6.1  Wundmodell  77

6.2  Gewicht im Versuchsverlauf  78

6.3  Einfluss von Sirolimus auf die Wundheilung  79

6.4  Einfluss von Sirolimus auf die Expression von VEGF TGF-ß und  iNOS

  in Wunden  83

6.4.1  Vascular endothelial growth factor (VEGF)  83

6.4.2  Transforming growth factor (TGF-ß)  85

6.4.3  Induzierbare NO-Synthase (iNOS)  87

6.5  Schlussfolgerung und Ausblick  90

7  Zusammenfassung  91

8  Literaturverzeichnis  93

  6  

Abkürzungsverzeichnis

µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer ACTH Adrenocortikotropes Hormon AEC-Farbstoff 3-Amino-9-ethylcarbazol AP Alkalische Phosphatase Aqua bidest. destilliertes Wasser bFGF basic fibroblast growth factor (basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor) BSA bovine serum albumine (Rinderserumalbumin) bzw. beziehungsweise ca. circa cm Zentimeter d dies (Tag) DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (Komplexbildner) EGF epidermal growth factor (epidermaler Wachstumsfaktor) ELISA enzyme-linked immunosorbent assay (enzymgebundener Immunoassay) eNOS endotheliale nitric oxide synthase (endotheliale Stickstoffmonoxid- synthase) FGF fibroblast growth factor (Fibroblasten Wachstumsfaktor) FKBP12 FK506 binding protein-12 (FK506-Bindungsprotein-12) g Gramm ggf. gegebenenfalls HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin Färbung HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) ICAM-1 intercellular adhesion molecule-1 (interzelluläres Adhäsionsmolekül-1) IFN-γ Interferon γ IL-1 Interleukin-1 iNOS inducible nitric oxide synthase (induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase) IGF-1 insulin-like growth factor-1 (Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor-1)

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kg Kilogramm KG Körpergewicht KGF keratinocyte growth factor (Keratinozyten Wachstumsfaktor) M Mol/l ml Milliliter MEIA Mikropartikel-Enzym-Immunoassays mg Milligramm min Minute MITU S-Methyl Isothiouronimum mm Millimeter MMF Mykophenolat Mofetil mTOR mammalian target of rapamycin (Ziel des Rapamycins im Säugetier) n Anzahl N Newton ng Nanogramm nm Nanometer nNOS neuronale nitric oxide synthase (neuronale Stickstoffmonoxidsynthase) p-DABA p-Dimethylaminobenzaldehyd PDGF platelet-derived growth factor (von Thrombozyten abgeleiteter Wachstumsfaktor) SPARC secreted protein acidic and rich in cystene (saures, cysteinreiches Sekretionsprotein) TBS tris buffer saline (dreifach Puffer-Salzlösung) TMB Tetramethylbenzidin TGF-α transforming growth factor-α (transformierender Wachstumsfaktor-α) TGF-ß transforming growth factor-ß (transformierender Wachstumsfaktor-ß) TNF-α tumor necrosis factor-α (Tumor Nekrose Faktor-α) u.a. unter anderem VEGF vascular endothelial growth factor (vaskulärer, endothelialer Wachs- tumsfaktor) z.B. zum Beispiel

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Kapitel 1 Einleitung

1 Einleitung

Die Wundheilung hat eine zentrale Beutung nach chirurgischen Eingriffen. Sie ist zudem Voraussetzung für das Abheilen chronischer Wunden bei immunkompromittierten Patienten mit Tumorleiden, Sepsis oder Diabetes mellitus, sowie nach Polytrauma oder einer Organtransplantation. Für den Ablauf einer komplikationslosen Wundheilung sind eine Reihe von komplexen zellulären und molekularen Mechanismen notwendig, die unter normalen Bedingungen dazu führen, dass sich die Wundränder verschließen und sich Narbengewebe ausbildet [112]. Um verschiedene Einflussfaktoren auf die Wundheilung zu untersuchen, wie z.B. medikamentöse Therapie oder ischämische Prozesse, ist es notwendig, sich zunächst mit dem physiologischen Ablauf der Wundheilung vertraut zu machen. Clark beschreibt die Wundheilung der Haut als eine Integration dynamischer interaktiver Prozesse zwischen löslichen Mediatoren, festen Blutbestandteilen, extrazellulärer Matrix und Parenchymzellen [28,30]. Die einzelnen Phasen der Wundheilung werden dabei von komplexen Kontrollmechanismen geführt, die eine Initiation des Heilungsprozesses und eine Regeneration des Hautgewebes gewährleisten [94]. Zu den einzelnen Wundheilungsprozessen zählen vor allem Blutgerinnung, Entzündungsreaktion, Zellreplikation, Epithelialisierung, Angiogenese, Einlagerung von Matrix, Wundmodulation und Narbenbildung [80]. Zur Untersuchung dieser Phasen der Wundheilung hat sich seit Jahren ein Wundmodell im Tierversuch mit Ratten etabliert. Schon 1968 untersuchte Aspesos den Wundheilungsprozess unter ischämischen Bedingungen im Tiermodell [10]. Das in dieser Arbeit verwandte Wundmodell wurde 1957 von Edwards etabliert und gilt als Standardmodell in der Wundheilungsforschung [5,13,102,103,120,152].

Das Immunsystem besitzt bei der Wundheilung eine zentrale Rolle [48,147]. Die Regulation der Wundheilung durch lokale Produktion von Wachstumsfaktoren, welche Entzündungszellen sowohl autokrin als auch parakrin beeinflussen, wird in der Literatur intensiv belegt [41,74]. Dabei sind Wachstumsfaktoren eng in die Wundheilung eingebunden und gerade bei der Initiation des Heilungsprozesses ist ihre Freisetzung durch immunkompetente Zellen von enormer Wichtigkeit [51]. Zu den Hauptaufgaben dieser Wachstumsfaktoren zählen, neben Chemotaxis und Modulation von Entzündungszellen, die Stimulation von Fibroblasten und Endothelzellen. Damit gewährleisten sie eine für die Neoformation von Granulationsgewebe essentielle Kollagensynthese und Neovas- kularisation [107]. Als wichtige Zytokine für den physiologischen Ablauf der

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Kapitel 1 Einleitung

Wundheilung haben sich u.a. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß) erwiesen, die eine Schlüsselrolle bei der Wundmodulation spielen [37,52]. Auch die zentrale Bedeutung des Stickstoffmonoxid- stoffwechsels und die Expression des Schlüsselenzyms induzierbare Stickstoffmonoxid- synthase (iNOS) für den Ablauf einer komplikationslosen Wundheilung ist mehrfach untersucht worden [11].

In dieser Arbeit wurde die Expression der drei Mediatoren VEGF, TGF-ß und iNOS am

10. postoperativen Tag immunhistochemisch untersucht und mit anderen Wundheilungs-

parametern korreliert, um eine mögliche Aussage über den Ablauf der Wundheilung treffen zu können.

Das Medikament Sirolimus ist ein immunsuppressives Agens, dass in der Transplantationschirurgie einen festen Stellenwert erlangt hat. Klinisch wird es zur Prophylaxe einer Abstoßungsreaktion nach Organtransplantation eingesetzt. Sowohl in klinischen als auch in experimentellen Studien wurde die pharmakologische Wirkung von Sirolimus auf die Wundheilung untersucht. Dabei wurde ein inhibitorischer Effekt von Sirolimus auf die Fibroblastenaktivität beschrieben, der mit einer Beeinträchtigung der Wundheilung einhergeht [88]. Unter anderem durch eine Beeinträchtigung von Fibroblastenfunktion und Angiogenese kam es in einer aktuellen Studie in 35 - 50 % der mit Sirolimus therapierten Patienten zu chirurgischen Komplikationen wie Lymphozelen, Wunddehiszensen, und Abszessen [67]. Auch die Inzidenz von Wundinfektionen im Rahmen einer Sirolimustherapie wurde untersucht und dabei eine erhöhte Infektionsgefahr aufgrund unzureichend abgeschlossener Wundheilung vermutet [3]. In einer prospektiv randomisierten Studie wurde eine höhere Inzidenz an postoperativen Wundkomplikationen bei einer Therapie mit Sirolimus gegenüber einer Therapie mit dem Immunsuppressivum Tacrolimus nachgewiesen (47 % vs. 8 %, p <0.0001) [40].

Der genaue Mechanismus dieser möglichen Beeinträchtigung der Wundheilung durch Sirolimus, unter Berücksichtigung der Wirkung auf die Zytokin vermittelte Wund- modulation, bleibt jedoch ungeklärt.

In unserer Arbeit untersuchten wir im Tierversuch die dermale Wundheilung unter immunsuppressiver Therapie mit Sirolimus am 10. postoperativen Tag und testeten eine mögliche Inhibition der Mediatoren VEGF, TGF-ß und iNOS.

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Kapitel 2 Stand der Forschung

2 Stand der Forschung

2.1 Wundheilung

Der Wundheilungsprozess wird in verschiedene Phasen unterteilt, die zeitlich versetzt ablaufen: Koagulation, Entzündung, Proliferation und Modulation [29,80,81].

Koagulationsphase

Sofort nach Hautgewebsverletzung führt eine lokale Aggregation von Blutplättchen zur Hämostase. Dabei setzen Thrombozyten Wachstumsfaktoren frei, vor allem Platelet- derived Growth Factor (PDGF), Transforming Growth Factor-α (TGF-α), Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), Fibroblast Growth Factor (FGF) und Epidermal Growth Factor (EGF). Die meisten dieser Moleküle werden zudem auch von Monozyten oder Makrophagen synthetisiert [159]. Diese Zytokine haben einen Effekt auf die Proliferation und Migration von Endothelzellen, Fibroblasten, Monozyten und Epithelzellen. Auch Leukozyten werden dabei durch Freisetzung vasoaktiver und chemotaktischer Faktoren aus der Gerinnungskaskade, dem Komplementsystem und beschädigten Zellen rekrutiert und in die frühe Phase der Wundheilung miteinbezogen [29].

Entzündungsphase

Der Ablauf der Entzündungsphase ist ein komplexes Zusammenspiel zahlreicher Noxen und Mediatoren, welche nach einer Wundsetzung in das betroffene Gewebe eingeschwemmt werden [172]. Nach 6 Stunden ist im Wundgewebe eine erhöhte Konzentration verschiedener Entzündungszellen nachzuweisen [175]. Dabei sind neutrophile Granulozyten die ersten Zellen, die aktiv in die Wunde einwandern und Enzyme freisetzen [91]. Unterstützt durch die von Entzündungsmediatoren vermittelte Vasodilatation mit konsekutiver Strömungsverlangsamung und erhöhter Kapillar- permeabilität kommt es nun entlang der Konzentrationsgradienten chemotaktischer Substanzen zur Granulozytenmigration in die Wunde [147]. Ihre Aufgabe besteht in der unspezifischen Immunabwehr gegen Bakterien und im Wunddébridement [157].

24 Stunden nach einem Trauma dominieren auch im Wundsekret vor allem neutrophile

Granulozyten und einige wenige Lymphozyten. Nach 48 Stunden zeigen sich hohe Konzentrationen an Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und einigen Fibroblasten

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Kapitel 2 Stand der Forschung

[174,175]. Neben Wachstumsfaktoren werden Monozyten und Makrophagen durch verschiedene Faktoren wie Hypoxie, Laktat, Fibronektin, Kollagen, Elastin und endotheliale Integrine stimuliert und phagozytieren pathogene Keime, Zelldedritus und Proteine [91]. Durch autokrine Mechanismen werden von Makrophagen, Monozyten und Lymphozyten weitere Zytokine synthetisiert, darunter IGF-1, TGF-ß, PDGF, VEGF, Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), Interleukin-1 (IL-1) und Interleukin-2 (IL-2) [29,45,91,130]. Wundmakrophagen, die sich vornehmlich aus im Blut zirkulierenden Monozyten differenzieren, erscheinen ab dem 2. Tag in der Wunde und stellen die größte Zellfraktion zwischen dem 3. und 5. Tag der Heilung [147]. Lymphozyten erreichen am 7. Tag der Heilung ihre größte Konzentration und während der späten Entzündungs- und frühen Proliferationsphase modulieren verschiedene Subtypen von T-Lymphozyten die Bildung der Extrazellulärmatrix [48]. Im Gegensatz zu Granulozyten sind Makrophagen und Lymphozyten unentbehrlich für eine normale Heilung [48,99].

Proliferationsphase

Die Proliferationsphase ist charakterisiert durch die Bildung von Granulationsgewebe, das sich aus Makrophagen, Myofibroblasten und Fibroblasten zusammensetzt. Diese Zellen sind eingebettet in eine Extrazellulärmatrix aus Fibronektin, Blutgefäße, Hyaluronsäure und interstitiellem Kollagen. Die Syntheseaktivität der Fibroblasten wird zum großen Teil von TGF-ß, aber auch von anderen Wachstumsfaktoren wie dem Adhäsionsmolekül Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) oder Stickstoffmonoxid (NO) angetrieben [31,147]. Am 3. Tag sind Fibroblasten zusammen mit neu gebildetem Typ-III-Kollagen, später dann Typ-I-Kollagen, im Wundgewebe vorhanden [1]. Die Fibroblasten unterlaufen dann einigen phänotypischen Änderungen, um verschiedene Funktionen zu erlangen [91]. Diese Funktionen beinhalten die Proliferation, Migration und die Synthese von extrazellulären Matrixproteinen [31]. Neovaskularisation setzt ab dem 2. Tag ein, wenn unter dem Einfluss von Zytokinen, einer niedrigen Sauerstoffkonzentration und einer hohen Laktatkonzentration Kapillaren in das Wundgewebe einsprießen [91]. Während der Angiogenese findet eine dynamische Interaktion zwischen Endothelzellen, angio- genetischen Zytokinen (vor allem FGF, VEGF und TGF-ß), Angiopoetin und der umgebenen Extrazellulärmatrix statt [167]. Unter Hypoxiebedingungen wird die VEGF- Synthese auf das 5-fache des Ausgangsniveaus hochreguliert [85,160]. Mit der Abnahme von Entzündungszellen in der Wunde werden Wachstumsmediatoren zunehmend von anderen Zellen wie Fibroblasten, Endothelzellen und Keratinozyten synthetisiert.

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Kapitel 2 Stand der Forschung

Fibroblasten synthetisieren IGF-1, Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), TGF-ß, PDGF,

VEGF und Keratinocyte Growth Factor (KGF). Endothelzellen produzieren TGF-ß, bFGF,

PDGF, VEGF, und Keratinozyten synthetisieren VEGF, EGF, TGF-ß und TGF-α [147].

Wundmodulation

Die Phase der Wundmodulation beginnt um den 7. Tag und dauert bis zu zwei Jahren. Dabei wird das Fibronektin aus dem Wundgewebe entfernt und es kommt durch weitere Ablagerung von Typ-I- und Typ-III-Kollagen zur strukturellen Organisation der zellulären Matrix. Zunächst dominiert Typ-III-Kollagen im Wundgewebe; die reife Wunde besteht jedoch ebenso wie die normale Haut zu 90 % aus Typ-I-Kollagen. Während des Abheilungsvorgangs unterläuft das Wundgewebe kontinuierlichen zellulären Verän- derungen. Die Anzahl der Kollagenfibrillen nimmt zu und die Ablagerung von Proteoglykan bewirkt eine zusätzliche Stabilität des Hautgewebes [86]. Anfängliches Fibrin, später auch das von aktivierten Makrophagen gebildete Fibronektin und Thrombospondin-1 sowie andere (Glyko-) Proteine (z.B. SPARC – secreted protein acidic and rich in cystene) werden nach und nach durch Kollagen ersetzt [147]. Nach 2 - 3 Wochen wird der maximale Kollagengehalt im Wundgewebe erreicht [90]. Die Verdickung, Ausrichtung entlang der Belastungsrichtung und Quervernetzung der Kollagenbündel korreliert mit der zunehmenden Festigkeit der Wunde. Nach einem Monat erreicht das Wundgewebe 40 % der Reißfestigkeit von normalem Hautgewebe und überschreitet nur selten 80 % der Reißfestigkeit nach einem Jahr [91]. Im Gegensatz dazu erlangt beispielsweise Wundgewebe des Magens oder des Duodenums schon nach 20 - 40 Tagen der Heilung die Ausgangsstabilität wieder [65]. Die Bestandteile der Extrazellulärmatrix haben im weiteren Verlauf der Abheilung, nicht nur durch die Bildung eines passiven Gerüstes für einwachsende Zellen, sondern auch über die Wundmodulation eine große Bedeutung für den physiologischen Ablauf der Wundheilung. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der Thrombospondin-1-Synthese in Wunden durch lokale Applikation von Antisense-Thrombospondin-Oligomeren zu einer verzögerten Wundheilung führt [44]. Die Phase der Wundmodulation ist also geprägt von einem interaktiven Wechselspiel zwischen Extrazellulärmatrix und Wundzellen, die als Resultat ein stabiles, kollagenreiches Hautgewebe bewirken.

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Kapitel 2 Stand der Forschung

2.2 Einfluss der immunsuppressiven Therapie auf die Wundheilung

Die Transplantation eines Organs wurde im 20. Jahrhundert durch zwei entscheidende Entwicklungen möglich. Zum Einen war es die Etablierung der Technik zur Bildung von Gefäßanastomosen durch Dr. Alexis Carrel, zum Anderen war es die Entwicklung effektiver pharmakologischer Immunsuppression, um die Abstoßung des Allotransplantats zu verhindern.

1953 wurden Kortikosteroide erstmals im Tierversuch erfolgreich gegen eine Abstoßungsreaktion eingesetzt [42]. Medewar und Morgan konnten unabhängig voneinander an Kaninchen zeigen, dass die systemische Gabe von Steroiden die Überlebenszeit von Hauttransplantaten verlängerte [110]. 1963 wurde von Starzl erstmals eine Kombinationstherapie mit Azathioprin und Kortikosteroiden bei Nieren- transplantationspatienten erfolgreich angewandt und damit die bisherigen immun- suppressiven Regime enorm verbessert [110]. Bis zur Einführung der Cyclosporine im Jahre 1983 wurde die Kombination von Azathioprin und Steroiden als Standardtherapie zur Immunsuppression angesehen [132]. 1986 konnte durch die erste klinische Studie endgültig die Effizienz der Cyclosporine nachgewiesen und eine neue Gruppe der Immunsuppressiva, die Calcineurininhibitoren, bestätigt werden [14,76]. Als weitere Substanz dieser Gruppe wurde 1989 Tacrolimus hinzugefügt, das in einer klinischen Studie erfolgreich gegen eine Abstoßungsreaktion nach Lebertransplantation eingesetzt wurde. Dieses Ergebnis ließ sich auch unter maximaler Cyclosporintherapie nicht erzielen [92]. In den 90er Jahren wurde die immunsuppressive Therapie durch das Makrolidantibiotikum Sirolimus, oder Rapamycin, erweitert. Im Gegensatz zu den Cyclosporinen und Tacrolimus interagiert diese Substanz jedoch nicht mit Calcineurin, sondern bindet an den mTOR- Rezeptor (mammalian target of rapamycin), um eine Aktivierung der T-Zellen, vor allem durch eine Inhibition von Interleukin-2 (IL-2) zu blockieren [68]. Weitere pharmakologische Effekte von Sirolimus sind eine verminderte T-Zell-Antwort auf IL-2, IL-12, IL-7, IL-15, eine verminderte B-Lymphozyten und Thymozyten Proliferation, eine Inhibition des Übertritts der T-Lymphozyten aus der G1-Phase in die S-Phase des Zellzyklus und die Beeinflussung zahlreicher Zytokine (u.a. PDGF, TGF-ß, VEGF) [15]. Die Entwicklung und enorme Verbesserung der immunsuppressiven Therapie hat bis zur heutigen Zeit dazu geführt, dass die Transplantation eines Organs eine etablierte Therapieoption bei terminalen Organinsuffizienzen geworden ist. Sowohl die Letalität nach Transplantation, als auch die Inzidenz der Abstoßungsreaktionen konnten effizient

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Kapitel 2 Stand der Forschung

gesenkt werden. Eine zunehmende Herausforderung im klinischen Alltag ist jedoch nun die Reduzierung der unerwünschten Wirkungen einer immunsuppressiven Therapie geworden. Neben den systemischen Komplikationen wie Infektionen bei Panzytopenie, Diabetes mellitus und Osteoporose sind vor allem Wundheilungsstörungen zu nennen. Wundheilungsstörungen und Wundinfektionen zählen heute zu den häufigsten Komplikationen nach Transplantation [116,185]. Bei verschiedenen immunsuppressiven Medikamenten wurden diese Wundheilungsstörungen beobachtet.

Eine Beeinträchtigung der dermalen Wundheilung durch Kortikosteroide wurde erstmals 1949 bei Patienten mit Weichteilverletzungen bemerkt, bei denen sich nur eine minimale Formation von Granulationsgewebe nach Gabe von Adrenocortikotropem Hormon (ACTH) zeigte [136]. Diese Beobachtungen wurden durch verschiedene tierexperimentelle Studien im Ratten- oder Kaninchenmodell bestätigt und ausgeweitet [6,49,115,128,137,146]. Auch in klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass Kortikosteroide vor allem in hohen Dosierungen die Wundheilung durch Inhibition der Proliferation von Fibroblasten und Blutgefäßen beeinträchtigen [66,72,100]. Green verglich in einer klinischen Studie die postoperativen Wundheilungsstörungen von 38 Patienten, die nach Kolektomie oder Splenektomie Kortikosteroide erhielten, mit 22 Patienten, die nach der gleichen operativen Prozedur keine Kortikosteroide erhielten. Dabei zeigten sich bei den Patienten nach Kortikosteroidtherapie ein 5-fach erhöhtes Auftreten von Wundheilungsstörungen, wobei die Dauer der Kortikosteroidtherapie keinen entscheidenden Einfluss auf die Inzidenz der postoperativen Wundheilungskomplikationen hatte [66,72]. In einer weiteren klinischen Studie wurde ebenfalls die Inzidenz der postoperativen Wundheilungsstörungen nach Kortikosteroidtherapie untersucht und eine Inzidenz von 44 % bei den Kortisonpatienten gegenüber 22 % bei der Kontrollgruppe festgestellt [50]. In einer tierexperimentellen Studie konnte zudem eine verminderte Wundreißfestigkeit unter systemische Gabe von Kortison beobachtet werden [49]. Sowohl histologisch als auch durch den Nachweis einer verminderten Wundreißfestigkeit konnte also gezeigt werden, dass durch eine perioperative Gabe von Kortikosteroiden die postoperative Wundheilung gestört wurde.

Eine Beeinträchtigung der Wundheilung wurde auch bei anderen immunsuppressiven Substanzgruppen beobachtet. In tierexperimentellen Untersuchungen wurde die Wirkung von Tacrolimus auf die Wundheilung untersucht. Dabei wurde anhand des auch in unserer Arbeit verwendeten Tiermodells gezeigt, dass es nach Gabe von Tacrolimus (2,0 mg/kg KG) über 10 Tage nach Operation zu einer statistisch signifikanten Reduktion der

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Kapitel 2 Stand der Forschung

Wundreißfestigkeit (p<0,01) und Abnahme des Kollagengehaltes (p<0,05) kommt [147,148]. In einer prospektiv randomisierten Studie wurden Wundheilungsstörungen nach immunsuppressiver Therapie mit Tacrolimus bzw. Sirolimus verglichen. Dabei wurden bei

28 % der Patienten (n = 77) Wundheilungskomplikationen festgestellt, davon 8 % bei

Patienten der Tacrolimus-Gruppe und 47 % bei Patienten der Sirolimus-Gruppe [40]. Sirolimus wird in der Literatur in einigen Studien mit Wundheilungsstörungen in Verbindung gebracht. 1991 beschreibt Akselband erstmals eine durch Fibroblast Growth Factor (FGF) vermittelte inhibitorische Wirkung von Sirolimus auf die Proliferation von Endothelzellen und Fibroblasten, die für den Ablauf der physiologischen Wundheilung essentiell sind [2]. Flanagan untersuchte wenige Jahre später die Wirkung von Sirolimus auf die Proliferation von T-Lymphozyten und konnte eine Inhibition des Eintritts der Zellen in die S-Phase des Zellzyklus nachweisen [56]. Die zentrale Bedeutung der T- Lymphozyten für den geregelten Ablauf der Wundheilung ist bekannt [48,147]. Auch in einigen klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass ein Zusammenhang zwischen Sirolimus und Wundheilungsstörungen besteht, der vor allem in der Transplantations- chirurgie zu einem zentralen Problem geworden ist. So beschreibt Guilbeau drei Fälle von Patienten, die nach Lebertransplantation und immunsuppressiver Therapie mit Sirolimus in Kombination mit Kortikosteroiden eine Verzögerung der Wundheilung mit Wunddehiszensen erfahren hatten. Als Sirolimus durch ein anderes Immunsuppressivum ersetzt wurde, waren die Wundheilungsstörungen rückläufig und die Wunden verschlossen sich komplikationslos [71]. In einer retrospektiven Studie wurden Wundheilungsstörungen nach Sirolimustherapie in Kombination mit Kortikosteroiden und Tacrolimus oder Cyclosporinen bei Nierentransplantationspatienten beobachtet. Dabei zeigten sich bei 53 % der Patienten der Sirolimusgruppe eine oder mehrere Wundheilungskomplikationen gegenüber 7 % der Patienten der Kontrollgruppe [168].

Es bleibt unklar, inwieweit das Ausmaß der Wundheilungskomplikationen in Abhängigkeit von einer Kombinationstherapie mit Sirolimus und anderen Immunsuppressiva steht. Der genaue Mechanismus, der für eine Beeinträchtigung der Wundheilung durch Sirolimus verantwortlich gemacht werden könnte, ist zudem noch nicht geklärt. Ob dieser Mechanismus durch eine Inhibition bestimmter Zytokine geschieht und ab welcher Dosierung diese Inhibition eintritt, soll Gegenstand unserer Arbeit sein.

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Kapitel 2 Stand der Forschung

2.3 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)

VEGF ist ein dimerisches Glykoprotein mit einer strukturellen Homologie zum Zytokin

PDGF. Es sind vier Homodimere bekannt, die sich in Größe und Löslichkeit unterscheiden (121, 165, 184 und 209 kd). Die verschiedenen Isomere von VEGF werden durch posttrankriptionales Splicing von einem einzelnen Gen generiert [53].

Eine VEGF-Synthese wurde vornehmlich in Endothelzellen, aber auch in Melanozyten nachgewiesen [34]. VEGF wird in verschiedenen stark vaskularisierten Geweben wie dem Ovar, den Nieren, dem zentralen Nervensystem und soliden Tumoren exprimiert [101,165]. Zu den Hauptaufgaben von VEGF zählt die Induktion der Mitogenese und der interstitiellen Kollagenasetranskription in Endothelzellen [171]. Zudem hat VEGF einen steigernden Effekt auf die vaskuläre Hyperpermeabiltät während der Wundheilung und verstärkt damit den Transport von Nährstoffen in das Wundgewebe [24]. Es konnte in einer tierexperimentellen Studie gezeigt werden, dass VEGF während des Wundheilungsprozesses in Keratinozyten an den Wundrändern vermehrt exprimiert wird [24]. Dabei scheint die Expression von VEGF stark von ischämischen Verhältnissen und verschiedenen Mediatoren, insbesondere der iNOS, angetrieben zu werden [101,165]. Ein Zusammenhang zwischen einer Inhibition der iNOS und einem daraus resultierenden verminderten VEGF-Gehalt im Wundgewebe wird beschrieben [79].

Die zentrale Bedeutung von VEGF für den Ablauf der physiologischen Wundheilung wird in der Literatur beschrieben. 1998 beschreibt Howdieshell eine erhöhte VEGF- Konzentration im Wundsekret bei Schweinen [78]. 1999 konnten diese Ergebnisse durch eine Antikörper vermittelte Inhibition von VEGF und dadurch bedingte Wund- heilungsstörungen bestätigt werden [77]. In einigen weiteren tierexperimentellen Untersuchungen zu Wundheilungsstörungen unter Hypoxiebedingungen wurde gezeigt, dass VEGF die Angiogenese während der Proliferationsphase entscheidend steigert [37,125,154,192]. Eine topische Applikation von VEGF führte darüber hinaus durch eine gesteigerte Angiogenese und durch Mobilisierung und Rekrutierung von Zellen aus dem Knochenmark zu einer Beschleunigung der Wundheilung bei diabetischen Mäusen [60]. In einer anderen tierexperimentellen Studie konnte sogar gezeigt werden, dass durch topische Gabe von VEGF eine Verzögerung des Wundheilung reversibel ist [117].

Auch in einigen klinischen Studien wurde die Bedeutung von VEGF für die Wundheilung untersucht. Wagner konnte bei Patienten mit akuten und chronischen Wunden sowohl im dermalen Wundgewebe als auch im Wundsekret 3-fach erhöhte VEGF-Konzentrationen

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Kapitel 2 Stand der Forschung

nachweisen [178]. In einer anderen Studie wurden bei Patienten nach Brandverletzung 22- fach erhöhte VEGF-Konzentrationen am 14. Tag gemessen. VEGF war bei der Abheilung der Brandwunden entscheidend für den Wundverschluss und die Ausbildung eines Wundödems [83].

VEGF induziert eine Angiogenese im Rahmen der Wundheilung durch verschiedene

Mechanismen. Zum Einen wirkt VEGF direkt mitogen auf Endothelzellen. Zum Anderen steigert es die vaskuläre Hyperpermeabilität und führt damit zur Einlagerung von Fibrinmatrix, die wiederum auch ein potenter Stimulus der Angiogenese ist [46]. Auf diese Weise trägt VEGF eine wichtige Funktion für den Ablauf der normalen Wundheilung.

2.4 Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß)

Die Familie der TGF-ß Zytokine wurde erstmals im Rahmen von Untersuchungen der Fibroblastenstimulation in Anwesenheit von TGF-α entdeckt [164].

Es ist bekannt, dass TGF-ß verschiedene Zellinteraktionen steuert, die essentiell für die Wundheilung sind [52,118,134]. In der Literatur werden fünf verschiedene Subtypen von TGF-ß unterschieden, die in ihrer Bezeichnung von 1 - 5 durchnummeriert werden. In unserer Arbeit untersuchten wir immunhistochemisch die Konzentration von TGF-ß1 im Wundgewebe und im Wundsekret am 10. postoperativen Tag. Nach Synthese eines Precursor-Proteins werden die einzelnen TGF-ß Isomere abgespalten und liegen dann als Polypeptid mit 112 Aminosäuren vor. Das biologisch aktive TGF-ß ist eine Verbindung aus zwei Monomeren (meist ein Homodimer). Die verschiedenen TGF-ß Formen haben sehr ähnliche Funktionen, sind jedoch in ihren Aufgaben nicht vollkommen gleich. Ihr Wirkungsmechanismus variiert je nachdem, welche Zielzelle sie beeinflussen. Obwohl fast alle Zelltypen des menschlichen Organismus TGF-ß produzieren, wird es im Rahmen der Wundheilung vor allem von Fibroblasten, Thrombozyten und Monozyten gebildet. Sobald TGF-ß extrazellulär freigesetzt wurde, bindet es an Rezeptoren der Zellmembran und stimuliert dann auto- und parakrin über einen intrazellulären Signalweg die Zielzelle [52]. TGF-ß steuert verschiedene Zellarten, die für die Wundheilung von großer Bedeutung sind. Entzündungszellen, vornehmlich neutrophile Granulozyten und Makrophagen, werden durch TGF-ß chemotaktisch rekrutiert und lagern sich durch Migration im Wundgewebe ein. TGF-ß ist somit unerlässlich für die Entzündungsphase und ermöglicht Entzündungszellen, ihre Wirkung im Wundgewebe zu entfalten. Während der Proliferationsphase wird die Migration und Proliferation von Endothelzellen durch

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Induktion der Expression des α5ß1-Integrins bewirkt [35]. Dadurch nimmt TGF-ß Einfluss auf die Angiogenese während der Wundheilung. Fibroblasten sind eine weitere Zellart, die sehr stark durch TGF-ß beeinflusst werden. Durch Chemotaxis und Stimulation der Proliferation entfaltet TGF-ß seine Wirkung an Fibroblasten und leitet somit die Produktion der Extrazellulärmatrix, insbesondere bestehend aus Kollagen und Fibronektin, ein [96]. Diese Beziehung zwischen TGF-ß und Fibroblasten ist fundamental für die Proliferationsphase und Wundmodulation während der physiologischen Wundheilung. Die Bedeutung von TGF-ß für die Wundheilung wurde in verschiedenen tierexperimentellen Studien untersucht. 1986 beschrieb Ignotz eine TGF-ß vermittelte Stimulation der Expression von Fibronektin und Kollagen und deren Einbau in die extrazelluläre Matrix [82]. Im gleichen Jahr wurde durch Roberts in vivo eine Beschleunigung der Fibrose und Angiogenese und in vitro eine Stimulation der Kollagenformation durch TGF-ß beobachtet [143]. In mehreren tierexperimentellen Studien konnte gezeigt werden, dass TGF-ß eine signifikante Steigerung der Kollagensynthese und der Proliferation von Fibroblasten bewirkt und somit zu einer Beschleunigung der Wundheilung führt [37,108,114,122]. Anhand eines Tiermodells wurde mehrfach verdeutlicht, dass durch Glukokortikoide induzierte Wund- heilungsstörungen unter TGF-ß Wirkung reversibel sind [17,130,131,178]. Auch durch Bestrahlung verursachte Wundheilungsstörungen werden durch TGF-ß verbessert [18]. In einigen klinischen Studien wurde ebenfalls der Zusammenhang zwischen TGF-ß und dem Ablauf einer normalen Wundheilung hergestellt. So konnte im Wundsekret bei Patienten mit Dekubitus eine statistisch signifikante Erhöhung der TGF-ß Konzentration nachgewiesen werden [1,89]. In einer klinischen Studie mit 24 Patienten nach Hauttransplantation wurden im Wundsekret TGF-ß Konzentrationen von 3 - 4 ng/ml gemessen. Diese gegenüber den anderen im Wundsekret gemessenen Zytokinen erhöhte Konzentration spiegelt auch klinisch eine wichtige Beteiligung von TGF-ß an dem Ablauf der Wundheilung wider [125].

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Kapitel 2 Stand der Forschung

2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS)

Bislang sind von den Stickstoffmonoxidsynthasen drei Isoformen bekannt: die endotheliale NO-Synthase (eNOS, Typ I), die induzierbare NO-Synthase (iNOS, Typ) und die neuronale NO-Synthase (nNOS, Typ III). Die verschiedenen Isoformen der iNOS werden zelltypspezifisch exprimiert und unterschiedlich reguliert [111]. Die eNOS und die nNOS sind kalziumabhängig und werden Calmodulin vermittelt aktiviert [124]. Ein wesentlicher Unterschied zwischen den einzelnen Unterformen der Stickstoffmonoxidsynthase ist darin zu sehen, dass die eNOS und die nNOS in der Lage sind, Stickstoffmonoxid (NO) in einem zeitlich begrenzten Rahmen von wenigen Minuten zu synthetisieren [109]. Hingegen produziert die iNOS größere Mengen NO im zeitlichen Bereich von Stunden und Tagen [176].

Die induzierbare NO-Synthase wurde zunächst in Makrophagen nachgewiesen [162]. Später fand sich auch eine Expression der iNOS in Mesangial- und Tubuluszellen der Niere [58,93,129]. Das von der iNOS in hoher Konzentration bereitgestellte Stickstoffmonoxid ist ein wichtiger Effektor in der unspezifischen Immunabwehr [58,93]. Die Aktivität der iNOS und die freigesetzte NO-Menge ist abhängig vom extrazellulären Angebot an L-Arginin [121]. Es konnte gezeigt werden, dass NO direkt oder indirekt im Hautgewebe eine Vasodilatation, Angiogenese und Melanogenese auslöst [25,63,170,180]. Die Expression der iNOS wird im Rahmen der Entzündungsreaktion, z.B. nach mechanischen Traumen, thermischen Schäden und Exposition gegenüber Endo- oder Exotoxinen gesteigert [163]. Stimuli für die Expression der iNOS sind proinflammatorische Mediatoren wie Lipopolysaccharide, Tumor Nekrose Faktor-α (TNF- α), TGF-ß, IL-1 und Interferon γ (IFN-γ).

Die Bedeutung der iNOS für die Wundheilung wurde durch verschiedene tierexperimentelle Studien untersucht. 1996 wurde durch Schäffer im Tiermodell gezeigt, dass eine verminderte Konzentration an Stickstoffmonoxid, verursacht durch eine kompetetive Inhibition der NO-Synthase durch S-Methyl Isothiouronimum (MITU), mit einer statistisch signifikanten Verminderung des Kollagengehalts und der Wundreißfestigkeit einhergeht [147,149]. In einer weiteren Untersuchung wurde durch den Transfer des iNOS Gens eine Reversibilität von Wundheilungsstörungen erzielt [188]. Zu den Mechanismen mit denen die iNOS in die Wundheilung eingreift zählt die Induktion der Angiogenese. Es konnte gezeigt werden, dass ein Defizit an NO-Synthase die Wundheilung durch eine verminderte Angiogenese beeinträchtigt [98]. Auch durch eine

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Kapitel 2 Stand der Forschung

Stimulation der Kollagensynthese scheint die iNOS am Wundheilungsprozess teilzunehmen. So wurde in einer in vitro Untersuchung von menschlichen Muskelsehnen eine gesteigerte Kollagensynthese unter dem Einfluss von iNOS beobachtet [186]. In der Literatur wird auch durch einige klinische Studien der bedeutende Zusammenhang zwischen der Expression von iNOS und einer physiologischen Wundheilung bestätigt. So wurde bei Patienten (n=16) mit chronischen Ulzera eine statistisch signifikant erhöhte mittlere Heilungsrate unter hoher iNOS-Expression gegenüber einer niedrigen iNOS- Expression festgestellt. Diese Ergebnisse haben verdeutlicht, dass eine hohe iNOS- Expression mit einer gesteigerten Wundheilungsrate zusammenhängt und möglicherweise sogar als Prognosefaktor genutzt werde könnte [106]. In einer aktuellen klinischen Studie wurde der Zusammenhang zwischen der iNOS und einer Wundheilung anhand von menschlichem Respirationsepithel untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Stickstoffmonoxid, synthetisiert mittels der iNOS, durch Stimulation der Epithelzell- migration wesentlich zur Reparation des Respirationsepithels beiträgt [19].

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Kapitel 3 Fragestellung

3 Fragestellung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, im Tierversuch an Ratten die Auswirkungen des immunsuppressiven Medikaments Sirolimus (in Dosen von 0,5, 2 und 5 mg/kg KG) auf akute Wundheilungsprozesse zu untersuchen.

Hierzu wurde Sirolimus, beginnend am Tag vor der Operation, über 10 Tage oral appliziert. Nach Ablauf der 10 Tage erfolgte eine Einschläferung der Tiere. Anschließend wurden die mechanische Wundfestigkeit und der Kollagengehalt des Granulationsgewebes als Standardparameter der Wundheilung analysiert. Dieses Ergebnis wurde im Zusammenhang mit der Expression der Wundmediatoren VEGF, TGF-ß und iNOS im dermalen Wundgewebe diskutiert.

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Kapitel 4 Material und Methoden

4 Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Versuchstiere Als Versuchstiere wurden 44 männliche Albinoratten vom Stamm Sprague-Dawley (Firma Charles River, Sulzfeld, Deutschland) mit einem Gewicht von 220 - 280 g verwendet. Eine Woche vor dem Versuch wurden die Tiere zur Akklimatisation in den Räumen der Versuchstierhaltung unter standardisierten Bedingungen (12 Stunden Tag-Nacht Zyklus, 22° C Raumtemperatur) untergebracht. Je zwei Ratten wurden in einem transparenten Käfig gehalten, der mit Sägemehl ausgestreut und durch ein Metallgitter abgedeckt war. Alle Tiere erhielten Standard-Trockenfutter und Wasser ad libitum. Sie wurden zusätzlich während des Versuchsverlaufs regelmäßig gewogen. Es wurden vier Versuchsgruppen gebildet, wobei drei Gruppen Sirolimus in verschiedener Dosierung (SIR0.5: 0,5 mg/kg KG/d, SIR2: 2 mg/kg KG/d, SIR5: 5 mg/kg KG/d) und die Kontrollgruppe ein Lösungs- mittel erhielten. Perioperativ verstarben acht Tiere (je ein Tier aus den Gruppen SIR0.5, SIR2, SIR5 und fünf Tiere aus der Kontrollgruppe) unter den Narkosebedingungen. Im Versuchsverlauf verstarben noch drei Tiere (zwei Tiere aus SIR5 und ein Tier aus der Kontrollgruppe) aus ungeklärter Ursache. Fünf zusätzliche männliche Albinoratten vom gleichen Stamm (Sprague-Dawley, Firma Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden deshalb nachträglich operiert und der Kontrollgruppe zugefügt. Der Versuch wurde durch die Bezirksregierung Arnsberg gemäß § 8 des Tierschutzgesetzes am 23.09.2004 genehmigt.

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