Widmung

Diese Arbeit ist meinen lieben Eltern gewidmet, die mich stets bei all meinen Vorhaben und meiner bisherigen Ausbildung unterstützt haben und mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen.

1.  Einleitung.  1

2.  Bakterienresistenz.  2

2.1.  Resistenzarten  2

2.2.  Resistenzmechanismen  3

2.3.  Resistenztestung  4

2.3.1.  Dilutionsmethoden.  5

2.3.2.  Agardiffusionsmethoden.  6

2.3.3.  Antibiogramm  6

2.3.4.  ETEST  6

3.  Grundlagen der antibakteriellen Chemotherapie  7

3.1.  Wirkspektrum  8

3.1.1.  Breitspektrumantibiotika.  8

3.1.2.  Schmalspektrumantibiotika.  8

3.2.  Wirkqualität  9

3.2.1.  Bakterizide  9

3.2.2.  Bakteriostatiker  9

3.3.  Wirkmechanismus von Antibiotika.  10

3.4.  Pharmakokinetik  10

3.5.  Nebenwirkungen  11

4.  Staphylokokken.  11

4.1.  Staphylokokkus aureus  12

4.1.1.  Besonderheiten, Virulenzfaktoren.  12

4.1.2.  Nachweis.  13

4.1.3.  Epidemiologie  15

4.1.4.  Pathogenese und Klinik  15

4.2.  MRSA (Methicilin resistenter Staphylokokkus aureus)  17

4.2.1.  PFGE.  19

4.3.  VISA , GISA  19

4.4.  cMRSA.  20

5.  Glykopeptidantibiotika.  20

5.1.  Vancomycin  20

5.1.1.  Resistenz  21

5.1.2.  Pharmakokinetik  21

5.1.3.  Nebenwirkungen  22

5.2.  Teicoplanin  22

5.2.1.  Resistenz  23

5.2.2.  Pharmakokinetik  23

5.2.3.  Nebenwirkungen  23

6.  Neue Antibiotika  24

6.1.  Linezolid  24

6.1.1.  Resistenz  25

6.1.2.  Pharmakokinetik  25

6.1.3.  Nebenwirkungen  25

6.2.  Tigecycline  26

6.2.1.  Resistenz  26

6.2.2.  Pharmakokinetik  27

6.2.3.  Nebenwirkungen  27

7.  Experimenteller Teil  28

7.1.  Auftauen der MRSA-Stämme.  28

7.2.  Identifizierung  28

7.2.1.  Katalase-Testung.  28

7.2.2.  Koagulasenachweis mittels „Staphaurex Plus“  29

7.2.3.  RAPIDEC staph  30

7.2.4.  ID 32 STAPH  31

7.2.5.  Oxacillin Platte.  32

7.3.  Resistenztestung  32

7.3.1.  Agardiffusionstest  32

7.3.2.  Resistenzbestimmung mittels E-Test  37

8.  Diskussion  41

9.  Schlussfolgerung  41

10.  Literaturverzeichnis.  42

11.  Abbildungsverzeichnis  43

In vitro Aktivität der neuen Antibiotika Linezolid und Tigecycline vs. Glykopeptidantibiotika bei MRSA

1. Einleitung

Das Interesse für die Thematik, mit der ich mich in meiner Arbeit befasse, habe ich während eines Praktikums im Bakteriologischen Labor am Institut für Hygiene der medizinischen Universität in Graz erlangt. Damals habe ich nämlich erfahren, dass die Resistenzen, die die Bakterien gegenüber den verwendeten Antibiotika aufweisen, immer mehr werden.

Ein großes Problem, vor allem im klinischen Bereich, stellen dabei MRSA ¹ dar. Für eine notwendige Antibiotikatherapie stehen dabei nur eingeschränkt Antibiotika zur Verfügung - als Mittel der Wahl gelten dabei die beiden Glykopeptidantibiotika Vancomycin und Teicoplanin. Der Nachteil dieser beiden Antibiotika ist jedoch, dass sie zum Teil sehr starke Nebenwirkungen mit sich bringen und dass eine Therapie mit ihnen meist sehr teuer ist.

Als ich dann erfahren habe, dass es zwei neue Antibiotika (Linezolid und Tigecycline) am Markt gibt bzw. geben wird (Linezolid kommt erst im Sommer 2006 auf den Markt), die bei MRSA sehr wirksam sein sollen, stand für mich das endgültige Thema meiner Arbeit fest: „In vitro Aktivität der neuen Antibiotika Linezolid und Tigecycline vs. Glykopeptidantibiotika bei MRSA“.

Zuerst habe ich alle MRSA Erstisolate des Institutes für Hygiene aus dem Jahr 2005 noch einmal als Methicillin resistente Staphylokokken der Species S. aureus identifiziert. Dann habe ich mittels Agardiffusionsverfahren das Resistenzverhalten getestet und mittels E-Test® ² die Wirkung der beiden neuen Antibiotika überprüft.

¹ Methicillin resistente Staphylokokkus aureus

² Firma AB Biodisk

In vitro Aktivität der neuen Antibiotika Linezolid und Tigecycline vs. Glykopeptidantibiotika bei MRSA

2. Bakterienresistenz

Definition: „Eine Bakterienresistenz liegt vor, wenn Bakterien in Anwesenheit therapeutisch relevanter Konzentrationen eines Chemotherapeutikums

(Antibiotikums) ihre Vermehrung nicht einstellen. Sie sind gegenüber der Wirksubstanz unempfindlich.“ (HOF et. al ³ 2004, 287)

2.1. Resistenzarten

Natürliche Resistenz

Der Wirkmechanismus eines bestimmten Antibiotikums kommt nicht zum Zuge, da das Bakterium dem Antibiotikum keinen Angriffspunkt bietet. Es handelt sich um eine bekannte, immer vorhandene Unempfindlichkeit, die bei der Therapie zu berücksichtigen ist.

z. B.: Unwirksamkeit von Penicillin G gegen gramnegative Stäbchen In jeder Bakterienpopulation existieren so genannte Persister. Das sind einzelne Individuen, die durch zufällige, sehr seltene Mutationen gegen bestimmte Wirkmechanismen von Antibiotika resistent sind. Sie vermehren sich unter einer Antibiotikatherapie aufgrund ihres Selektionsvorteils und werden zum Problem.

Erworbene (übertragene, sekundäre) Resistenz:

Diese Art der Resistenz steht im Zusammenhang mit einer Antibiotikatherapie. Der Austausch des genetischen Materials zwischen einzelnen Bakterienzellen spielt dabei, neben dem bereits oben erwähnten Selektionsmechanismus, eine wichtige Rolle. (vgl. HOF et. al 2004, 288)

Resistenz- Plasmide verleihen ihrer Wirtszelle eine Resistenz gegenüber bis zu acht verschiedener Antibiotika. Diese Plasmide lassen sich durch einfachen Zellkontakt auf andere Bakterien übertragen; sowohl vertikal als auch horizontal. Dieser Umstand begünstigt ihre Verbreitung und damit auch die Resistenzentwicklung bei Bakterien. (vgl. Schlegel 1992, 513)

³ lat. et alii = und andere

In vitro Aktivität der neuen Antibiotika Linezolid und Tigecycline vs. Glykopeptidantibiotika bei MRSA

induzierbare Resistenz

Alle gramnegativen Stäbchenbakterien (außer Salmonella sp.) besitzen mindestens eine chromosomal kodierte Information für eine Betalaktamase. Nur wenige Bakterien (z.B.: Enterobacter sp., Serratia sp.) exprimieren dieses Gen konstitutiv und sind somit gegen die meisten Betalaktamantibiotika resistent. Unter einer Therapie mit solchen Stoffen können, bei unzureichender Dosierung, auch bis dahin empfindlich erscheinende Bakterien nach und nach Resistenzen entwickeln; auch ohne neue Resistenzgene. (vgl. HOF et. al 2004, 289)

2.2. Resistenzmechanismen

Die vier wichtigsten Resistenzmechanismen sind :

• Produktion antibiotikaabbauender, beziehungsweise modifizierender Enzyme

• Ausbildung antibiotikaunempfindlicher Zielstrukturen; z.B.: PBP2’ bei MRSA

• Permeabilitätsbarriere: die äußere Membran verhindert das Eindringen von Antibiotika

• aktiver Efflux: Proteine fungieren als Pumpe und befördern Antibiotika wieder aus der Zelle; z.B.: Makrolidresistenz bei Streptokokken (vgl. HOF et. al 2004, 288)

In vitro Aktivität der neuen Antibiotika Linezolid und Tigecycline vs. Glykopeptidantibiotika bei MRSA

Tabelle 1: Strategien der Bakterien zur Ausbildung von Resistenzen

(vgl. HOF et. al 2004, 288)

2.3. Resistenztestung

Bei den Methoden zur Resistenztestung (Empfindlichkeitsbestimmung) wird geprüft, ob ein Erreger empfindlich oder resistent gegen ein antimikrobielles Chemotherapeutikum ist. Dies kann in vitro geprüft werden, indem der Erreger

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verschiedenen Konzentrationen der Substanz ausgesetzt wird. Es gibt Dulutionsmethoden und Agardiffusionsmethoden. (vgl. MIKSITS und HAHN 2004, 323)

Die Verfahren und Interpretationen erfolgen gamäß den aktuellen CLSI - Normen (Clinical Laboratory Standards Institute - früher: NCCLS)

2.3.1. Dilutionsmethoden

Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK): In einem geeigneten Nährmedium wird eine Verdünnungsreihe eines Antibiotikums angelegt. Dann wird eine definierte, geringe Menge an Bakterien eingeimpft und bebrütet. Nach 24 Stunden wird abgelesen, ob die Keime sich vermehrt haben. Die niedrigste Konzentration, die das Wachstum unterdrückt, gilt als minimale Hemmkonzentration. Bei der kritischen Beurteilung dieses Wertes muss man jedoch bedenken, dass die Entstehungsbedingungen recht artefiziell sind (kontinuierliche Konzentration über 24 Stunden, neutraler pH, etc.)

Weiterhin sagt der absolute Wert allein nichts über den zu erwartenden Therapieerfolg aus. Dieser hängt nämlich auch von den pharmakologischen Eigenschaften des Medikaments ab. Deswegen werden zur Bewertung so genannte Breakpoints herangezogen. Das sind Serumspiegel, die nach der Hälfte des üblichen Applikationsintervall erreicht werden können. Unter Zuhilfenahme dieser normativen Maßstäbe kann man unter Vorbehalt eine Aussage über die Empfindlichkeit des Erregers machen.

Die Erfahrung zeigt, dass der MHK in einer gewissen Korrelation zum therapeutischen Erfolg steht. (vgl. HOF et. al 2004, 291f)

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2.3.2. Agardiffusionsmethoden

Bei der Agardiffusionsmethode werden die Hemmhofdurchmesser um antibiotikahaltige Plättchen bestimmt. Das Antibiotikum diffundiert aus dem Plättchen in den Agar; so entsteht ein Konzentrationsgradient. Dabei herrscht die höchste Konzentration direkt beim Plättchen. In dem Bereich um das Plättchen, in dem die Konzentration mindestens die MHK erreicht, wird die Vermehrung des Teststamms gehemmt. Der entstehende Hemmhof ist umso größer, je empfindlicher der Stamm gegen das Mittel ist. Um interpretierbare Ergebnisse zu erhalten, muss eine lineare Korrelation zwischen den Hemmhofdurchmessern und der minimalen Hemmkonzentration bestehen. Für die Reproduzierbarkeit ist die Konstanthaltung der Testbedingungen unerlässlich. Wesentliche Kriterien dafür sind:

• die Zusammensetzung des Kulturmediums

• die eingesetzte Bakterienkonzentration

• die Inkubationsbedingungen

• die Antibiotikamenge im Plättchen

2.3.3. Antibiogramm

Bei der Resistenztestung in der Praxis werden mehrere antimikrobielle Substanzen gegen ein Erregerisolat getestet. Die daraus resultierenden Ergebnisse werden in Form eines Antibiogramms zusammengefasst. (vgl. MIKSITS und HAHN 2004, 323ff)

2.3.4. ETEST®

„Etest ist eine quantitative Methode zur Bestimmung der Minimalen-Hemm-Konzentration (MHK)… Wenn der Etest-Streifen auf eine inokulierte Agaroberfläche gelegt wird, wird der vorgefertigte exponentielle Gradient der antibiotischen Substanz oder des Reagenz sofort in den Agarnährboden transferiert. … Nach Inkubation über

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Nacht oder länger, bildet sich eine symmetrische Hemmellipse gleichmäßig entlang des Streifens. Die MHK wird direkt von der Skala in μg/ml an dem Punkt abgelesen, wo sich Hemmellipse und Streifen schneiden.“ (AB BIODISK 2005)

Abb. 1: E-Test-Streifen (Dr. in Andrea Grisold); Wirksamkeit von Teicoplanin (TP) gegen einen S. aureus Stamm

3. Grundlagen der antibakteriellen Chemotherapie

„Definition: Als antibakterielle Chemotherapie bezeichnet man die gezielt gegen den Erreger einer Infektionskrankheit gerichtete Behandlung mit dem Vorsatz, diesen zu vernichten oder wenigstens seine Vermehrung zu unterbinden. Hierzu kommen Medikamente zum Einsatz, die nach dem Prinzip der selektiven Toxizität die Zelle des Mikroorganismus möglichst effektiv schädigen und die körpereigene Zelle möglichst unbeeinflusst lassen sollen.

Als Antibiotika werden antibakteriell wirksame Stoffe bezeichnet, die auf natürliche Weise vorkommen und von Pilzen oder Bakterien gebildet werden. Synthetisch gewonnene, antimikrobiell wirkende Pharmaka werden unter dem Begriff antibakterielle Chemotherapeutika zusammengefasst. Die Nomenklatur ist jedoch nicht streng, sondern vielmehr fließend. In der Regel werden alle Medikamente der antibakteriellen Chemotherapie als „Antibiotika“ bezeichnet, was sich schon deswegen empfiehlt, weil der Begriff „Chemotherapie“ beim Laien mit der