Analyse der Granulozytenfunktion und des CD45R-Expressionsmusters sowie Frequenzbestimmung einer definierten CD45-Punktmutation bei Patienten mit Autoimmunthyreoiditis vom Typ Hashimoto

II

  Abkürzungsverzeichnis  

  Abkürzungsverzeichnis  

  Signifikanzniveau .  

  ADCC engl. antibody-dependend cellular cytotoxity  

  AG Antigen/-e  

  AIK Autoimmunerkrankung/-en  

  AIT Autoimmunthyreoiditis  

  AK Antikörper  

  APC engl. antigen-presenting cell/-s  

  CD engl. cluster of differentiation  

  CD45RA-C;O Bezeichnung für die Epitope (A, B, C, O) der CD45-  

  Isoformen; CD45RA-C werden durch die Exone A-C  

  kodiert  

  Basenaustausch in der DNA: Cytosin wurde durch CÆG  

  Guanin ersetzt  

  DNA engl. desoxyribonucleinacid  

  Desoxy-Nukleosidtriphosphate dNTP  

  ESS engl. exonic splicing silencer  

  FACS engl. fluorescence-activated cell sorter  

  Fluoreszein-Isothiozyanat FITC  

  FL Fluoreszenz  

  FSC engl. forward scatter; Vorwärtsstreulicht  

  Friedrich Schiller Universität FSU  

  Gate (=Analysefenster) Nummer 1-3 G1-3  

  Granulozytenfunktionstest GFT  

  Hepatitis C Virus HCV  

  HIV engl. human immunodeficiency virus  

  HLA engl. human leukocyte antigen  

  Hashimoto-Thyreoiditis HT  

  Interferon IFN  

  Ig Immunglobulin/-e  

  Interleukin/-e IL  

I

Abkürzungsverzeichnis

KIM LPAP

mAK

MHC MS MspI MW p PBS PCR PE RFLP RNA SKAP55 SLE SR SSC Taq Tg TNF TPO TSH TZR vs.

ZAP

II

  Inhaltsverzeichnis  

  Abkürzungsverzeichnis  I

  Inhaltsverzeichnis  III

1  Zusammenfassung  1

2  Einleitung  3

2.1  Autoimmunthyreoiditis Typ Hashimoto  3

2.1.1  Epidemiologie  3

2.1.2  Klinik  4

2.1.3  Diagnostik  5

2.1.4  Prognose  5

2.1.5  Therapie  5

2.1.6  Ätiologie und Pathogenese  6

2.2  CD45 Molekül  8

2.2.1  Aufbau  9

2.2.2  Funktion  10

2.2.3  Regulation des CD45  11

2.2.4  Alternatives Spleißen und genetische Polymorphismen  12

2.2.5  Bindung der CD45R-AK  15

2.2.6  CD45 und Autoimmunerkrankungen  15

3  Fragestellung und Ziele  17

4  Material  18

4.1  Probanden  18

4.1.1  Patientenkollektiv  18

4.1.2  Kontrollkollektiv  18

4.2  Materialien  19

4.2.1  Antikörper  20

4.2.2  weitere Chemikalien  21

4.2.3  Verbrauchsmaterialien  22

4.2.4  Geräte  23

4.2.5  Software  23

III

5  Experimentelle Methoden  24

5.1  Herstellung von Lösungen  24

5.1.1  Herstellung von PBS  24

5.1.2  Herstellung der Lyselösung  24

5.2  Durchflusszytometrische Analytik  24

5.2.1  Grundlagen der Durchflusszytometrie  24

5.2.2  Einstellungen des Durchflusszytometers  26

5.2.3  Anfärbung der CD45 AG von Leukozyten mit CD45 mAK  27

5.2.4  Isotypkontrollen für die verwendeten CD45 AK  28

5.2.5  Bestimmung der Phagozytoseaktivität von Granulozyten  28

5.3  DNA-Analytik  30

5.3.1  Präparation der DNA aus Vollblut  30

5.3.2  Nachweis der CÆG Punktmutation an Position 77 des Exon A  

  des CD45 Gens  31

6  Statistische Methoden  37

6.1  Statistik CD45R-Expressionsmuster  37

6.2  Statistik Granulozytenfunktion  37

6.3  Statistik Mutationshäufigkeit  38

7  Ergebnisse  39

7.1  Altersstruktur und Geschlechtsverhältnis in den Kollektiven  39

7.2  Durchflusszytometrische Darstellung der Leukozytenpopulationen  40

7.3  Ergebnisse der Isotypkontrollen  41

7.4  Grundlagen der CD45RO RA-Expression auf Lymphozyten und  

  Granulozyten  43

7.4.1  Charakterisierung eines varianten CD45RA-Expressionsmusters  

7.4.2  Charakterisierung eines varianten CD45RA-Expressionsmusters  

7.5  Verteilung des klassischen und varianten CD45RA-Expressions  

  musters in den Kollektiven  48

IV

7.6  Molekulargenetische Resultate  48

7.6.1  Nachweis des PCR-Produktes für Exon A des CD45 Gens  48

7.6.2  Nachweis der gesuchten Punktmutation durch RFLP-Analyse  49

7.6.3  Gegenüberstellung der Allelfrequenzen  53

7.7  Vergleich der klassischen mit den varianten CD45RA-Expressions  

  mustern  54

7.7.1  CD45RO und CD45RA-Expression auf Lymphozyten  54

7.7.2  CD45RB und CD45RC-Expression auf Lymphozyten  56

7.7.3  CD45RO und CD45RA-Expression auf Granulozyten  56

7.7.4  CD45RB und CD45RC-Expression auf Granulozyten  58

7.8  Vergleich des Patienten und Kontrollkollektivs unter Ausschluss der  

  Träger des C77G-Polymorphismus  58

7.8.1  CD45RO und CD45RA-Expression auf Lymphozyten  59

7.8.2  CD45RB und CD45RC-Expression auf Lymphozyten  60

7.8.3  CD45RO und CD45RA-Expression auf Granulozyten  60

7.8.4  CD45RB und CD45RC-Expression auf Granulozyten  61

7.9  Darstellung der Phagozytoseaktivität der Granulozyten  62

8  Diskussion  67

8.1  Allelfrequenz  67

8.2  Diskussion der Ergebnisse zwischen Personen mit varianten und  

  normalen CD45RA-Expressionsmustern  70

8.2.1  CD45R-Expression auf Lymphozyten  70

8.2.2  CD45R-Expression auf Granulozyten  73

8.3  Diskussion der Ergebnisse zwischen Patienten und Kontrollkollektiv  

  unter Ausschluss der Träger des C77G-Polymorphismus  76

8.3.1  CD45R-Expression auf Lymphozyten  76

8.3.2  CD45R-Expression auf Granulozyten  77

8.4  Granulozytenfunktionstest  78

9  Schlussfolgerungen  82

10  Literatur und Quellenverzeichnis  83

11  Anhang  93

V

1 Zusammenfassung

1 Zusammenfassung

Hintergrund: Lymphozyten exprimieren, je nach Aktivierungszustand, verschiedene Isoformen des CD45-Moleküls. Dies ist durch alternatives Spleißen der Exone A-C des CD45-Gens möglich. Inaktive T-Zellen prägen die Isoformen ABC, AB, BC und B aus. Nach der Aktivierung sind nur noch die Isoformen O und B auf der Zelloberfläche präsent. Durch eine CÆG Transversion an Position 77 des Exon A exprimieren aktive T-Zellen zusätzlich die Isoform AB. Die Transversion kann mit Autoimmunerkrankungen (AIK) assoziiert sein. Ein Einfluss der Punktmutation auf die Granulozytenfunktion ist bisher nicht beschrieben. Granulozyten beugen durch ihre Phagozytose- fähigkeit Infektionen vor, welche in der Ätiologie von AIK eine Rolle spielen. Sie exprimieren im Ruhezustand die Isoform O des CD45-Moleküls. Nach Zellaktivierung werden durch die Verschmelzung intrazellulärer Granula Isoformen mit Exon A kodierenden Sequenzen an die Zelloberfläche transloziert.

Fragestellungen: Besteht eine Assoziation des C77G-Polymorphismus zur Hashimoto-Thyreoiditis (HT)? Wie verändert der C77G-Polymorphismus die CD45R-Expression auf Lympho- und Granulozyten? Treten Unterschiede in der CD45R-Expression bei HT-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen auf? Übt die CÆG Transversion Einfluss auf die Phagozytoseaktivität der Granulozyten aus? Ist die Phagozytoseaktivität zwischen den Kollektiven unterschiedlich? Methoden: Bei 73 HT-Patienten und 73 Kontrollprobanden wurde das CD45R- Expressionsmuster der Leukozyten mit einem CD45RA-, -RB-, -RC- und -RO-

AK im Durchflusszytometer analysiert. Sämtliche Probanden der Studie wurden

auf die CÆG Transversion mit einer PCR-RFLP-Analyse getestet. Die Phagozytoseaktivität wurde von 41 HT-Patienten und 42 Kontrollprobanden mithilfe des kommerziell erhältlichen Testkits „Phagotest“ ermittelt.

Ergebnisse: Ein variantes CD45RA-Expressionsmuster - dem CÆG Polymorphismus typisch - wurde in beiden Kollektiven je einmal beobachtet. Die molekulargenetischen Untersuchungen bestätigten die Transversion an Position

77 des Exon A bei beiden Trägern des veränderten CD45RA-Musters. Die G-

Allelfrequenz ergab einen Wert von 0,69%. Ein Unterschied zwischen den Kollektiven war somit statistisch nicht vorhanden.

1

1 Zusammenfassung

Das CD45RA-Expressionsmuster zeigte bei den Personen mit der Transversion im Vergleich zu den Individuen mit dem klassischen CD45RA-Muster folgende statistisch signifikante Veränderungen: Erhöhte Lymphozytenzahl mit CD45RO , /RA + - CD45RC + -Markierung,

und Leukozytenpopulationen gesteigerte Zahl CD45RO + /RA + - und erniedrigte Mengen CD45RO + /RA , -Zellen. In der Gegenüberstellung der HT- mit den Kontrollprobanden unter Ausschluss der gefundenen Träger der Punktmutation ergaben sich signifikante Differenzen bzgl. der gesteigerten CD45RA- und CD45RC-Expression auf Lymphozyten sowie der reduzierten CD45RO + - und CD45RO + /RA , -Lymphozytenzahl im Kontrollkollektiv. Weiterhin war eine gesenkte CD45RB-Expression auf Granulozyten in dieser Gruppe vorhanden. Im Granulozytenfunktionstest (GFT) wurde nach Feststellung der Punktmutation bei einem der untersuchten Kontrollprobanden eine Gegenüberstellung dieser Person mit den restlichen Kontroll- und HT-Personen durchgeführt. Es zeigte sich eine erhöhte Phagozytoseaktivität an den ersten beiden Messpunkten (’10min Eisbad’ und ’1min im 37°C warmen Wasser’) bei dem Individuum mit dem varianten CD45-Expressionsmuster im Vergleich mit den beiden anderen Personengruppen. An Gegenüberstellung der Zellen von HT-Patienten mit denen der gesunden Spender eine signifikante Reduktion der Granulozytenaktivität im Patientenkollektiv. Im weiteren Untersuchungsverlauf nährten sich die Aktivitäten der Granulozyten in den Kollektiven an.

Schlussfolgerungen: Eine Assoziation zwischen dem C77G-Polymorphismus und der HT besteht nicht. Die gefundenen Differenzen in der CD45RO- und CD45RA-Expression lassen sich zum einen durch die C77G-Transversion erklären, zum anderen könnte die ständig ablaufende Immunreaktion bei den HT-Patienten verantwortlich sein. Die festgestellten Quantitätsunterschiede der, durch die Exone A-C kodierten Sequenzen in den Kollektiven könnten bei entsprechender Bestätigung in weiteren Studien ein Diagnosekriterium darstellen. Zudem gibt die veränderte Phagozytoseaktivität zwischen den untersuchten Gruppen einen Hinweis auf einen Einfluss der CD45-Isoformen auf diese Granulozytenfunktion. Bestätigt sich dieser Verdacht in weiteren Untersuchungen wären auch Modulationen der CD45-Isoformen und der damit verbunden Zellfunktion durch AK denkbar.

2

2 Einleitung

2 Einleitung

2.1 Autoimmunthyreoiditis Typ Hashimoto

Die Schilddrüse ist ein Organ mit einem vielfältigen Einfluss auf sämtliche Körperfunktionen und erstreckt sich vom Kohlenhydrat-, Fett-, und Proteinstoffwechsel über die Thermoregulation und das Herz-Kreislaufsystem auf den Magen-Darmtrakt sowie das Muskel- und Nervensystem. Durch diese multiplen Funktionen wird die gesamte körperliche, geistige und seelische Entwicklung und Verfassung des Menschen grundlegend beeinflusst. Fehlfunktionen können mit einem Überschuss an Schilddrüsenhormonen (Hyperthyreose) oder einem Hormonmangel (Hypothyreose) einhergehen. Die Ursachen können in drei Ebenen liegen. Sie können sich im Hypothalamus (tertiär), in der Hypophyse (sekundär) oder der Schilddrüse direkt (primär) befinden. Primäre Ursachen liegen u.a. bei den, im Folgenden beschriebenen, Erkrankungen, Morbus Basedow und Hashimoto-Thyreoiditis (HT), vor. Die meisten Hyperthyreosen werden durch die AIK Morbus Basedow verursacht. Dabei führen schilddrüsenstimulierende AK zur erhöhten Hormonausschüttung. In wenigen Fällen ist eine Schilddrüsenautonomie für das unausgewogene Hormonverhältnis verantwortlich.

Auch für Hypothyreosen sind mehrere Ursachen bekannt. Neben iatrogenen Veränderungen z.B. durch Strumektomie oder Radiotherapie können auch AIK zum Hormonmangel führen. Die hier untersuchte AIK - chronisch lymphozytäre Hashimoto-Thyreoiditis – geht mit einer Entzündung der Schilddrüse einher. Sie wurde erstmals 1912 von dem japanischen Pathologen und Chirurgen Hakaru Hashimoto beschrieben (Sawin 2002) und stellt die häufigste AIT dar (Schott und Scherbaum 2006). Diese Erkrankung soll nun näher erläutert werden.

2.1.1 Epidemiologie

Eine Untersuchung in der nordamerikanischen Bevölkerung ergab, dass 10% der untersuchten Personen erhöhte Schilddrüsen-AK aufweisen, von denen 5% eine Hypothyreose (0,3% eine manifeste Hypothyreose) zeigen (Hollowell et al. 2002). Neuere Studien postulieren eine 10%-ige Häufigkeit von klinischen und subklinischen Hypothyreosen. Diese Zahl kann auch für Westeuropa übernommen werden (Parle et al. 1991, Valeix et al. 2004). Dabei sind Frauen

3

2 Einleitung

fünf- bis siebenmal häufiger betroffen als Männer (Dayan und Daniels 1996). Das Durchschnittsalter der Patienten bei Diagnosestellung liegt um die 50 Jahre (Manji et al. 2006).

2.1.2 Klinik

Der Krankheitsbeginn bleibt unbemerkt, da die Patienten im initial noch subklinischen Verlauf kein Missverhältnis in der Hormonausschüttung der Schilddrüse aufweisen und deshalb keine Symptome äußern.

Durch die Destruktion von Thyreozyten kann es zu einer massenhaften Freisetzung von präformierten Hormonen kommen. Eine passagere Hyperthyreose ist die Folge. Dieses auch als Hashitoxikose bezeichnete Stadium ist u.a. durch Tachykardie, Nervosität, Gewichtsabnahme und Wärmeintoleranz gekennzeichnet und wird nicht bei allen Patienten beobachtet. Durch die progressive Zerstörung der hormonbildenden Zellen tritt im weiteren Verlauf eine Hypothyreose ein. Erst wenn ein Großteil des Schilddrüsengewebes (>90%) zerstört ist (Auernhammer 2003), werden die Patienten klinisch durch Müdigkeit, Adynamie, Obstipation, Kälteintoleranz und Gewichtszunahme auffällig.

Es sind zwei morphologische Verlaufsformen bekannt:

1. Die als klassische HT bezeichnete hypertrophe Form, welche mit einer

Volumenzunahme der Schilddrüse einhergeht. Die Struma (Struma lymphomatosa) zeigt sich im Palpationsbefund derb-elastisch bis gummiartig. Sie kann sekundär in die atrophe Form übergehen.

2. Die atrophe Form, welche durch eine Verkleinerung des

Drüsenparenchyms gekennzeichnet ist.

Die HT geht selten mit Lokalbeschwerden einher. Die Struma Hashimoto wächst langsam, verursacht deshalb nur in wenigen Fällen Engegefühl im Halsbereich, Schluck- und Druckbeschwerden oder Atemnot (Spelsberg et al. 2000).

4

2 Einleitung

2.1.3 Diagnostik

Die Diagnostik beinhaltet neben einer ausführlichen Anamnese und klinischen Untersuchung vor allem die Labortestung der Schilddrüsenhormone und Auto- AK. Es finden sich meist hochtitrige TPO-AK und Tg-AK (Meng 2001, Spelsberg et al. 2000). AK, die gegen den TSH-Rezeptor oder den Jod-Transporter gerichtet sind, können festgestellt werden, sind aber für die Diagnostik ohne Bedeutung (Riede et al. 2004).

Zusätzlich zu oben genannten Maßnahmen erhärtet eine inhomogene Echoarmut (Nawroth und Ziegler 2001) des Organs in der Sonografie den Verdacht auf das Vorliegen einer HT.

In unklaren Fällen bilden die Szintigrafie - mit einer verringerten Technetiumaufnahme der Schilddrüse (Nawroth und Ziegler 2001) - und die Biopsie weitere Diagnoseoptionen. Das aus der Probeexzision gewonnene histologische Bild weist ein lymphoplasmazelluläres Infiltrat auf (Horn et al. 1999), weshalb die HT auch den Namen „chronisch lymphozytäre Thyreoiditis“ trägt. Bei der atrophen Form ist zudem noch eine Fibrosierung des Gewebes zu erkennen (Meng 2001).

2.1.4 Prognose

Die HT ist eine chronische Erkrankung mit einem schleichend-progredienten Verlauf, welcher zu einer irreversiblen Zerstörung der Thyreozyten führt. Da Assoziation mit weiteren AIK, wie dem Diabetes mellitus Typ I, Autoimmungastritis oder dem Morbus Addison beobachtet wurden, ist die Entwicklung von Komorbidität wahrscheinlich.

Eine maligne Entartung der B-Zellen ist bei der Erkrankung ebenfalls möglich. Sie kommt gehäuft bei der klassischen HT in Form von B-Zell-Lymphomen vor. (Spelsberg et al. 2000)

2.1.5 Therapie

Eine kausale Behandlung ist derzeit noch nicht möglich, sodass sich die durchgeführten therapeutischen Maßnahmen auf die auftretende Symptomatik beschränken.

5

2 Einleitung

Während die hyperthyreote Initialphase bei Bedarf mit -Blockern therapiert wird, ist im hypothyreoten Stadium eine lebenslange Einnahme von L-Thyroxin als Schilddrüsenhormonersatz erforderlich.

2.1.6 Ätiologie und Pathogenese

Die Entstehung der HT ist ein multiätiologischer Vorgang, welcher neben Umwelteinflüssen auch humorale, zelluläre und genetische Komponenten einbezieht.

Exogene Ursachen für die Entwicklung der AIT stellen u.a. Zellschäden durch Toxine, virale oder bakterielle Infektionen (Portiankina et al. 1991), Mangel an Selen (Caturegli et al. 2007) oder aber auch eine exzessive Jodzufuhr (Manji et al. 2006) dar. Das erniedrigte Auftreten der HT in Jodmangelgebieten unterstützt die zuletzt getroffene Aussage. Es wird vermutet, dass Jod zusätzlich zu seinem direkten toxischen Effekt auf Thyreozyten durch die Reaktion mit reaktiven Sauerstoffmetaboliten ein inflammatorisches Potential erhält (Bagchi et al. 1990). Beide Mechanismen führen zur Zellzerstörung, welche ein Übermaß an AG bereitstellt. Durch die gestressten Thyreozyten kommt es zusätzlich zur Freisetzung von Hitzeschockproteinen. Sie besitzen immunmodulatorische Effekte und können damit auch zu einem Fortschreiten der AIT führen (Sztankay et al. 1994). Die Einwirkung von Jod kann deshalb sowohl einen initiierenden als auch einen entzündungssupportiven Effekt haben.

Eine unbestrittene Rolle im Entwicklungsprozess der HT hat die humorale Immunität durch die Bildung von Auto-AK. Vermutlich werden sie durch die intrathyroidal gefundenen polyklonalen B-Zellen produziert. Dabei werden die

AK gegen die Thyroidperoxidase (TPO-AK) für die Destruktion der Follikelzellen

verantwortlich gemacht (Ng et al. 2004). TSH-Rezeptor stimulierende AK und Ig, welche das Wachstum von Schilddrüsenzellen fördern, werden eine Beteiligung bei der Strumaentstehung der hyperthyreoten Verlaufsform nachgesagt (Riede et al. 2004). Eine inhibierende AK-Wirkung am TSH- Rezeptor scheint mit der Entstehung der atrophen Form der HT assoziiert zu sein (McKenzie und Zakarija 1996). Weitere beobachtete Ig sind der Tg-AK und der AK gegen das Kolloidantigen-2 (Boyages et al. 1989). Die Funktionen

6

2 Einleitung

dieser beiden Proteine sind zurzeit noch umstritten, sodass ihr Auftreten bisher als Sekundärphänomen betrachtet wird (Schott und Scherbaum 2006).

Ebenfalls wird die Beteiligung der genannten AK an der AK-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) diskutiert (McKenzie und Zakarija 1996). Hierbei werden Lymphozyten durch die spezifische Bindung von AK zur Degranulation von Perforin und Granzymen angeregt. Perforin destruiert die Membran der Zielzelle und ermöglicht den Verdauungsenzymen (Granzyme) den Eintritt ins Zellinnere. Dort wird vermutlich eine Enzymkaskade aktiviert, welche eine Apoptoseinduktion und damit den Untergang der Zielzelle bewirkt (Janeway et al. 2002, Quaratino et al. 2004). Perforinhaltige Lymphozyten wurden im Schilddrüseninfiltrat der HT gefunden (Wu et al. 1994).

Die AK unterstützen den Immunprozess nicht nur durch ihren autoantigenen Angriff sondern auch durch die Bindung von Komplementfaktoren. Dies erklärt das Vorhandensein vieler Komplementkomplexe um die Schilddrüsenfollikel herum (Weetman et al. 1989). Da Thyreozyten gegenüber der durch Komplement vermittelten Zelllyse relativ resistent sind (Tandon et al. 1994), kann dies nicht zur Destruktion der Schilddrüsenzellen führen. Ein denkbarer Mechanismus besteht in der Anlockung von Entzündungszellen mittels chemotaktischer Signale durch Mediatoren und Komplementfragmente, welche bei der Komplementaktivierung abgegeben werden (Janeway et al. 2002). Die Aktivierung der eingewanderten Leukozyten erfolgt sowohl über deren Haftung an die Fc-Bereiche der Auto-AK (Quaratino et al. 2004) als auch über die Bindung des an die Zelle gebundenen Komplementfaktors (Janeway et al. 2002). Dabei kommt es neben einer Zytokinausschüttung zu einer respiratorischen Entladung (respiratory burst) bzw. zur Mobilisation von Membranphospholipiden (Weetman et al. 1992). Arachidonsäure und somit der Vorläufer der Entzündungsmediatoren der Prostaglandin- und Leukotrien- Gruppe wird dabei freigesetzt (Janeway et al. 2002).

Auf zellulärer Ebene wird eine erhöhte Apoptoseneigung der Thyreozyten durch verstärkte Fas-Expression (Spelsberg et al. 2000) auf diesen Zellen diskutiert. Weitere Ansatzpunkte konzentrieren sich neben der Expression und Funktion des/der CD1, CD40, Protein-Tyrosin-Phosphatase-22 und Toll-Like-Rezeptoren auch auf die T-Suppressorzellen (Caturegli et al. 2007). Diese versagen in der

7

2 Einleitung

Inhibition der zytokininduzierten Auto-AK-Bildung, die durch die primäre T- Zellaktivierung induziert wird. Der beschriebene Funktionsdefekt der T- Suppressorzellen ist mit den unten aufgeführten HLA-Spezifitäten assoziiert (Meng 2001).

Eine genetische Komponente wird durch das wiederholte Auftreten der HT bei Patienten mit chromosomalen Veränderungen (z.B. Turner-Syndrom, Trisomie 21) (Rapoport 1991, Sundick 1990, Tomer und Davies 1993), die familiäre Häufung (Brix et al. 1998a, Brix et al. 1998b) und die Assoziation zu den HLA- Klasse-II-Molekülen DR3, DR4 bzw. DR5 erkennbar (Schott und Scherbaum 2006). Diese HLA-Spezifitäten gehören zum MHC-II-Komplex. MHC-II wird physiologischerweise nicht von Thyreozyten exprimiert. Allerdings wurden bei der AIT Korrelationen zwischen der Anwesenheit von MHC-II-Komplexen auf den Schilddrüsenzellen und IFN--haltigen T-Zellen berichtet (Hamilton et al. 1991). Da IFN- die MHC-II-Expression induziert (Weetman et al. 1985) und MHC-II erst in fortgeschrittenen Krankheitsstadien auf den Thyreozyten beobachtet wurde (Cohen et al. 1988, Voorby et al. 1989), ist die berichtete pathologische Expression von MHC-II-Komplexen bei HT-Patienten eher als eine Konsequenz als eine Ursache für HT anzusehen. Durch diese unphysiologische MHC-II-Expression erlangen diese Zellen die Funktion von antigenpräsentierenden Zellen (APC) und halten durch die damit verbundene T- Zell-Aktivierung den entzündlichen Vorgang aufrecht.

Als Teilursache für AIT kann auch eine genetisch determinierte Veränderung im Zytokinmuster in Frage kommen, denn diese Botenstoffe nehmen vielfältige Aufgaben im Immunsystem wahr (Badenhoop et al. 1992, Hunt et al. 2001).

2.2 CD45-Molekül

Ein Schlüsselmolekül des Immunsystems stellt das transmembranöse Glykoprotein CD45 dar. Es ist ein Oberflächen-AG welches auf allen kernhaltigen hämatopoetischen Zellen und ihren Vorläuferzellen vorkommt und bedeckt bis zu 10% der Zelloberfläche (Thomas 1989).

Das zugehörige Gen liegt auf Chromosom 1 (Region 1q31-32). Es besteht aus

33 Exonen (Hall et al. 1988).

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2 Einleitung

2.2.1 Aufbau

Seine Struktur gliedert sich in 3 Komponenten:

1. zytoplasmatische Domäne

Diese Region zeichnet sich durch eine hohe Konstanz zwischen Säugetieren aus. 95% dieses Areals sind zwischen allen Säugern gleich, während nur 35% Übereinstimmung in der extrazellulären Domäne gefunden wurden (Thomas 1989).

Zwei Phosphataseregionen, D1 und D2, bilden das zytoplasmatische Ende des CD45-Moleküls. Während D1 durch seine Phosphataseaktivität andere Moleküle manipuliert, ist die Aufgabe des D2 noch nicht klar definiert. Für D2 werden modulierende und regulierende Einflüsse auf Zellprozesse diskutiert. Sie könnten durch die als „keilartig“ beschriebene Funktion von D2 (Bilwes et al. 1996) und damit durch intramolekulare Interaktionen mit anderen zytoplasmatischen Regionen z.B. D1 zu Stande kommen (Desai et al. 1994, Felberg und Johnson 1998, Felberg und Johnson 2000, Hayami-Noumi et al. 2000).

2. Transmembrandomäne

Die aus hydrophoben Aminosäuren gebildete Region dient der Verankerung des Moleküls in der Zellmembran (Rebstock 2006).

3. extrazelluläre Domäne

An die Transmembranregion schließt sich eine Homologie von Fibronektin-III an. Nach dieser Sequenz folgt eine cysteinreiche Region. Sie geht in einen variablen Abschnitt über. Dieser wird durch die verschiedene Kombination der Exone A, B und C kodierenden Sequenzen gebildet. Durch alternatives Spleißen können aus den Produkten dieser Exone theoretisch 8 verschiedene Isoformen des CD45-Moleküls, nämlich ABC, AB, AC, BC, A, B, C, O (Abb.1) gebildet werden. Auf humanen Zellen werden nur 5 dieser 8 Isoformen gefunden. Dabei werden die Isoformen A, C und AC nicht auf humanen Zellen exprimiert.

Die Anheftung von Zuckerstrukturen an die Bestandteile der Extrazellularregion rechtfertigt den Begriff des Glykoproteins.

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2 Einleitung

Abb. 1: Darstellung des CD45-Gens mit seinen Exonen (Zahlen von 1-33) Die für die acht verschiedenen Isoformen essentiellen drei Exone (A; B; C) des CD45-Gens sind gesondert hervorgehoben. Die Molekulargewichte (MW) der Isoformen sind rechts angegeben. (Tchilian und Beverley 2006, modifiziert)

2.2.2 Funktion

Die Funktionen des CD45-AG sind vielfältig. Sie erstrecken sich durch die Modulation von Signalwegen von der Regulation von Rezeptorsignalen (u.a. auf AG, Wachstumsfaktoren und Zytokine), der B- und T-Zellaktivierung mit Aktivierung der Gentranskription, der Stimulation von B-Zellen zur AK- Produktion bis hin zur Beeinflussung der Zellproliferation. Daher sind sie Bestandteil der Regulation der Immunantwort, welche durch B- und T-Zellen aufrechterhalten wird.

Die Aufgaben des CD45-Moleküls in der myeloischen Zellreihe liegen im Gegensatz zu den Lymphozyten größtenteils noch im Dunkeln. Vermutet wird eine Beteiligung in der Zelldegranulation (Berger et al. 1994) sowie die Modulation chemokininduzierter Signale in Neutrophilen (Mitchell et al. 1999). Weiterhin wird ein Einfluss auf die Chemotaxis (Harvath et al. 1991, Gatewood et al. 1991, Kuijpers et al. 1992), die oxidative Entladung (Liles et al. 1995) und die Pahgozytose (Yu et al. 2002) diskutiert.

10

2 Einleitung

2.2.3 Regulation des CD45

Für die Regulation der CD45-Phosphataseaktivität werden mehrere Faktoren verantwortlich gemacht. Die Bindung von Liganden, die Interaktion mit anderen Proteinen sowie die Beeinflussung durch spezifische intrazelluläre Inhibitoren, wie NADPH (Fialkow et al. 1997), sind vermutete Einflussfaktoren (Hermiston et al. 2003).

Als mögliche Liganden werden CD22 und Galectin-1 diskutiert (Stamenkovic et al. 1991, Walzel et al. 1999), wobei ihre Bindung unspezifisch an T-Zell- Glykoproteine erfolgt (Pace et al. 1999, Pace et al. 2000, Trowbridge und Thomas 1994). Beweise für die Modulation der Phosphataseaktivität des CD45- Moleküls durch diese Faktoren gibt es bisher jedoch nicht. Weitere, evtl. zufällige Interaktionen des CD45-Moleküls im extrazellulären Bereich mit Thy-1, dem TZR und CD2 (Trowbridge und Thomas 1994) wurden beobachtet. In anderen Studien wurde die Wechselwirkung von CD100 mit CD45-Isoformen, welche ein oder zwei variable Produkte der Exone A-C enthalten, beobachtet. Diese Verbindung soll Einfluss auf die T-Zelladhäsion haben (Herold et al. 1996). Des Weiteren wird für die Transduktion wachstumsinhibierender Signale in T-Zellen eine Konnektion zu der .-Kette des IFN-Rezeptors verantwortlich gemacht (Petricoin et al. 1997).

Im Bereich der transmembranen Domäne kommt das Membranprotein LPAP als Interaktionspartner in Frage (Cahir McFarland und Thomas 1995, Kitamura et al. 1995). Es scheint bevorzugt mit CD45-Monomeren zu kommunizieren (Xu und Weiss 2002). Da es widersprüchliche Ergebnisse bzgl. der Beeinflussung des CD45-Moleküls gibt, bleibt es abzuwarten, ob LPAP eine CD45- regulierende Komponente besitzt.

Im intrazellulären Bereich wurde Fodrin und das Adapterprotein SKAP55 als Liganden des untersuchten Glykoproteins identifiziert (Wu et al. 2002). Fodrin stimuliert in Verbindung mit CD45 dessen Phosphataseaktivität in vitro (Lokeshwar und Bourguignon 1992). SKAP55 hingegen übt durch die Bindung an die zytoplasmatische D1-Komponente des CD45 einen positiven Einfluss auf die TZR-vermittelte Gentranskription aus (Wu et al. 2002).

Neben den genannten Möglichkeiten der „Fremdregulation“ durch andere Moleküle, kann sich das CD45-Molekül durch Dimerisation selber in der Aktivität beeinflussen. Es wurde das Phänomen der spontanen

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Homodimerisierung beschrieben. Da diese durch chemische Reaktionen in der extrazellulären Domäne moduliert wird, ist sie von den exprimierten Isoformen abhängig. Sie wird häufiger bei der niedermolekularen Isoform O als bei höhermolekularen Formen, wie dem CD45RA beobachtet. Die Dimerisation bedingt die gegenseitige Blockade der katalytischen Zentren der CD45- Moleküle. Damit fällt der aktivierende Einfluss auf den TZR weg und die Immunantwort wird inhibiert. Durch diesen negativen Feedback können unerwünschte Gewebeschädigungen unterbunden werden (Xu und Weiss 2002).

2.2.4 Alternatives Spleißen und genetische Polymorphismen

Der Vorgang des alternativen Spleißens und damit die Zusammenstellung und Expression der CD45-Isoformen hängt mit dem Aktivitäts- und Reifezustand der Zellen zusammen. Naive Lymphozyten, welche noch keinen AG-Kontakt hatten, tragen neben den Isoformen BC und B vor allem die hochmolekularen Formen

ABC und AB. O wird auf naiven Zellen nicht exprimiert, sodass diese Zellen

CD45RO , /RA + sind. Nach Kontakt mit einem AG kommt es zur Aktivierung der Zelle, welche eine Änderung im CD45-Expressionsmuster zu Gunsten der niedermolekularen Formen nach sich zieht. Diese Veränderung ergibt sich durch die Modifikation des Spleißvorganges. Aktivierte Zellen präsentieren nur die Isoformen O und B, sind deshalb negativ für CD45RA und können dementsprechend als CD45RO + /RA , deklariert werden (Clement 1992). Aktivierte und naive Lymphozyten nehmen verschiedene Aufgaben in der Immunabwehr wahr. Welchen Funktionen dabei die einzelnen CD45-Isoformen nachgehen, bleibt Gegenstand intensiver Forschungen.

Die molekularen Einzelheiten, welche den Spleißvorgang regulieren, sind bisher noch nicht komplett aufgeklärt. Man geht von einer multifaktoriellen Steuerung dieses Prozesses aus. In diesem Vorgang interagieren SR-Proteine als Spleißfaktoren mit definierten Regionen in Exon A (Positionen: 8-10bp, 40- 91bp, 127-137bp) und Exon C (Position: 16-137bp) (ten Dam et al. 2000). Mutative Veränderungen, die z.B. in Form von Deletionen oder Transversionen in den gefundenen Bereichen auftreten, können dabei Einfluss auf das Spleißverhalten nehmen (Rothrock et al. 2003, Tsai et al. 1989). Dies trifft auf den C77G-Polymorphismus zu. Hierbei ist die Base Cytosin (C) an Position 77

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des Exon A gegen Guanin (G) ausgetauscht (synonym: CÆG Polymorphismus; C77G-Transversion). Diese Punktmutation verändert zwar nicht die Aminosäuresequenz, zerstört aber das am stärksten wirksame Spleißelement ESS1. Die Funktion des ESS1 besteht in der Inhibition der Transkription des Exon A (Lynch und Weiss 2001). Aus diesem Grund resultiert der Defekt im ESS1 in einer ständigen Transkription und Translation des Exon A und somit in einem varianten CD45RA-Expressionsmuster. Dieses äußert sich in der Präsenz der Isoform AB auf aktiven T-Zellen, welche normalerweise nur die Isoform O und B präsentieren (siehe Abb.2).

naive/ruhende T-Zelle aktivierte T-Zelle

Abb. 2: Vereinfachte Darstellung der CD45-Isoformen auf naiven und aktivierten T-Zellen Bei Vorhandensein der C77G-Punktmutation kommt es nach der Zellaktivierung zum permanenten Ablesen des Exon A, sodass CD45RA zusätzlich zum normalen Expressionsmuster (schwarz) in der Isoform AB (rot) zu finden ist.

Die beschriebene Transversion der Basen war bei den bisher gefundenen Trägern nur in heterozygoter Form ausgeprägt. Ein homozygoter Merkmals- träger wurde bislang nicht identifiziert (Tchilian und Beverley 2006). Die Frequenz dieser Mutation unter gesunden europäischen Kontrollprobanden ist gering und in der Literatur mit 0-6,7% angegeben (Ballerini et al. 2002, Barcellos et al. 2001, Boxall et al. 2004a, Cocco et al. 2004, Esteghamat et al.

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2005, Gil et al. 2005, Gomez-Lira et al. 2003, Jacobsen et al. 2000, Miterski et al. 2002, Nicholas et al. 2003, Sabouri et al. 2003, Schwinzer et al. 2003, Stanton et al. 2003, Tchilian et al. 2001b, Tchilian et al. 2002, Thude et al. 2004, Vogel et al. 2003, Vorechovsky et al. 2001, Wood et al. 2002). In Deutschland schwanken die Angaben zwischen 0-1,4% (Jacobsen et al. 2000, Miterski et al. 2002, Schwinzer et al. 2003, Thude et al. 2004, Vogel et al. 2003, Wood et al. 2002). Das Auftreten dieser Veränderung scheint mit der ethnischen Herkunft verbunden zu sein. Während in afrikanischen Populationen diese Mutation bisher nicht gefunden werden konnte, kommt sie bei Kollektiven aus Zentralasien mit 6,7% gehäuft vor (Tchilian et al. 2002). Der C77G- Polymorphismus tritt dabei immer unabhängig vom Geschlecht, von der Blutgruppe sowie den HLA-Eigenschaften auf und folgt dem autosomal- dominanten Ergbgang mit voller Penetranz (Schwinzer und Wonigeit 1990, Scott et al. 1991). Die beiden Allele des CD45-Gens sind kodominant, sodass immer beide transkribiert und translatiert werden (Schwinzer und Wonigeit 1990).

An der gleichen Position im Exon A wurde eine weitere Transversion beobachtet, bei der Thymin das Cytosin an Position 77 ersetzt. Die Aminosäuresequenz erfährt auch in diesem Fall keine Veränderung. Dieser C77T-Polymorphismus wurde bisher auf eine Assoziation mit MS geprüft, welche sich aber nicht bestätigte (Gomez-Lira et al. 2003).

Neben den Polymorphismen im Exon A sind auch Veränderungen in Exon B und C bekannt (Tchilian und Beverley 2006). Im Exon B ist bislang eine Modifikation beschrieben worden, welche das Guanin an Stelle 69 durch ein Cytosin ersetzte. Dies beeinflusst die Aminosäuresequenz so, dass statt Asparaginsäure Histidin in die Proteinkette für die extrazelluläre Domäne des CD45 eingebaut wird. Eine Arbeitsgruppe fand die G69C-Punktmutation mit einer Frequenz von 1% in der norditalienischen Bevölkerung. Ein signifikanter Unterschied des Kontrollkollektivs zur ebenso untersuchten MS-Gruppe bestätigte sich nicht. (Gomez-Lira et al. 2003). Dieses Resultat schließt eine funktionelle Komponente dieser Punktveränderung in der Pathogenese der MS aber nicht aus.

Eine weitere Basentransversion wurde im Exon C an Position 138 (Adenin wird gegen Guanin ausgetauscht) beschrieben. Folge dieser Punktmutation ist eine

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