Inhaltsverzeichnis

1.  Einleitung  1

1.1  Signaltransduktion  1

1.2  Der PI3K/Akt Signalweg.  2

1.3  Pathologische Veränderungen im PI3K/AKT Signalweg  6

1.4  RNA-Interferenz.  8

1.5  Zielstellung der Arbeit.  10

2.  Material und Methoden  11

2.1  Materialien.  11

2.1.1  Geräte.  11

2.1.2  Verbrauchsmaterialien  12

2.1.3  Medien, Puffer und Lösungen.  12

2.1.4  Western Blot Antikörper.  15

2.1.5  Chemikalien und Reagenzien  16

2.1.6  siRNAs.  17

2.2.  Zellbiologische Methoden  17

2.2.1  Kultivierung humaner Leukämiezelllinie Jurkat  17

2.2.2  Quantifikation - Zellzahl und Vitalität  18

2.3.  Molekularbiologische Methoden.  20

2.3.1  Herstellung von Proteinlysaten  20

2.3.2  Proteinbestimmung nach Bradford  20

2.3.3  Western Blot  22

2.3.3.1  SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese  22

2.3.3.2  Semi-Dry Blot  23

2.3.3.3  Proteinfärbung mit Ponceau  23

2.3.3.4  Blocken unspezifischer Bindungsstellen und Immunreaktion  24

2.3.3.5  Detektion mittels Meerrettichperoxidase  25

2.4.  Transfektion mit siRNA (small interfering RNA)  25

2.4.1  Transfektion mittels Elektroporation  26

2.4.2  Verwendete siRNA Moleküle.  27

2.5  Durchflusszytometrie.  30

2.5.1  Bestimmung der Transfektionsrate  31

2.5.2  Apoptose-/ Nekrosemessung  32

2.5.3  Intrazelluläre Färbung.  34

2.6.  Statistik  36

3.  Ergebnisse  37

3.1  Transfektionseffizienz  37

3.2  Transfektion mit Cell Death siRNA  37

3.3  Ergebnisse der Transfektion mit siRNA AKT1  42

3.4  Ergebnisse der Transfektion mit siRNA AKT2  45

3.5  Transfektion mit AKT siRNA in Kombination.  47

3.6  Überblick der Ergebnisse der Western Blots.  53

3.7  Transfektionen mit AKT siRNA bei gleichzeitiger Stimulation mit IGF  55

Abbildungsverzeichnis   

Seite   

Abbildung  1: Regulation des PI3K/AKT-Signalweges  

Abbildung  2: Übersicht über die Aktisoformen  

Abbildung  3: Genetische Veränderungen des PI3K-Signalweges  

Abbildung  4: Mechanismus der RNA-Interferenz.  

Abbildung  5: Neubauer Zählkammer  

Abbildung  6: Reduktion des Tetrazoliumsalzes WST-1 zu Formazan.  

Abbildung  7: Aufbau des Blotsandwich.  

Abbildung  8: Elektroporationsküvette.  

Abbildung  9: Struktur des Aktmoleküls mit Bindestellen der verwendeten  

siRNAs   

Abbildung  10: Bestimmung der Transfektionsrate am Durchflusszytometer  

Abbildung  11: Übersicht über Verteilung der lebenden, apoptotischen  

und  nekrotischen Zellen nach Annexin V-FITC und PI-Färbung.  

Abbildung  12: Darstellung der Vorgehensweise bei der Bestimmung  

der  Apoptose- und Nekroserate.  

Abbildung  13: Vorgehensweise bei der FACS-Messung nach  

intrazellulärer  Färbung  

Abbildung  14: Ergebnisse der Zellzählung nach Transfektion mit  

Cell  Death siRNA  

Abbildung  15: Vitalität nach Elektroporation mit Cell Death siRNA.  

Abbildung  16: Apoptoserate nach Transfektion mit Cell Death siRNA  

Abbildung  17: Nekroserate nach Transfektion mit Cell Death siRNA  

Abbildung  18: Zellzahl nach Transfektion mit AKT1 siRNA  

Abbildung  19: Vitalität nach Transfektion mit AKT1 siRNA  

Abbildung  20: Western Blot nach Tranfektion mit AKT1 siRNA.  

Abbildung  21: Zellzahl nach Transfektion mit AKT2 siRNA  

Abbildung  22: Vitalität nach Transfektion mit AKT2 siRNA  

Abbildung  23: Apoptose- und Nekroserate nach Transfektion  

mit  AKT2 siRNA  

Abbildung  24: Zellzahl nach Transfektion mit kombinierten AKT siRNAs.  

Abbildung  25: Vitalität nach Transfektion mit kombinierten AKT siRNAs.  

Abbildung  26: Apoptose- und Nekroserate nach Transfektion mit  

kombinierten  AKT siRNAs.  

Abbildung  27: Mittlere Fluoreszenzintensität nach Transfektion mit  

kombinierten  AKT siRNAs.  

Abbildung  28: FACS-Daten intrazelluläre Färbung nach 48 h  

Abbildung  29: Western Blot bei AKT siRNAs in Kombination  

Abbildung  30: Western Blot AKT siRNAs  

Abbildung  31: Western Blot mit Caspase-Antikörper.  

Abbildung  32: Zellzahl nach Transfektion mit AKT siRNAs bei gleichzeitiger  

Stimulation  mit IGF  

Abbildung  33: Vitalität nach Transfektion bei gleichzeitiger Stimulation.  

Abbildung  34: Apoptose- und Nekroserate nach Transfektion  

Gleichzeitiger  Stimulation  

Abbildung  35: Western Blot Stimulationsversuch  

Tabelle 1: Proteinstandards zur Erstellung der Eichkurve..................................... 21 Tabelle 2: Verwendete Primärantikörper............................................................... 24 Tabelle 3: Verwendete Sekundärantikörper .......................................................... 25 Tabelle 4: Zielsequenzen der eingesetzten AKT siRNAs .....................................29 Tabelle 5: Verwendete Farbstoffe bzw. Antikörper für FACS-Messung.............. 31 Tabelle 6: Verwendete Antikörper für die intrazelluläre Färbung ........................35 Tabelle 7: Transfektionseffizienz .......................................................................... 37 Tabelle 8: Signifikanzen (p-Werte) für die Apoptose- und Nekroserate

Tabelle 9: Zellzahlen nach Behandlung mit verschiedenen

Konzentrationen VEGF.........................................................................55 Tabelle 10: Zellzahlen nach Behandlung mit verschiedenen

Konzentrationen IGF ..........................................................................56

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung AKT Proteinkinase B ALL Akute Lymphatische Leukämie APS Ammoniumpersulfat bzw. beziehungsweise dATP desoxy-Adenosintriphosphat dCTP desoxy-Cytidintriphosphat dGTP desoxy-Guanosintriphosphat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen dsRNA doppelsträngige RNA EGF Epidermal growth factor FGF Fibroblast growth factor FITC Fluoreszein Isothiozyanat FKS Fetales Kälberserum Foxo Forkhead Box Gruppe O FSC Forward Scatter g Erdbeschleunigung GSK3 Glycogensynthase Kinase-3 h Stunde HSA humanes Serumalbumin IGF Internal Growth Factor min Minute

mRNA messenger RNA mTor Mammalian Target of Rapamycin PBS phosphate buffered saline PCR Polymerase-Kettenreaktion PH-Domäne Pleckstrin-homologe Domäne PI Propidiumiodid PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase PI3K Phosphatidylinositol 3-Kinase PVDF Polyvinylidenfluorid Ras Proto-Onkogen (Ratten Sarkom) RISC RNA Induced Silencing Complex RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA-Interferenz RNAse Ribonuklease rpm Umdrehungen pro Minute (rotations per minute) RTK Rezeptor-Tyrosin-Kinase SDS sodium dodecyl sulfate siRNA small interfering RNA SSC Side Scatter TNF α Tumornekrosefaktor α TBST Tris buffered saline mit Triton X TEMED Tetramethyletylendiamin TGF Transforming growth factor Tris Trishydroxymethylaminomethan z.B. zum Beispiel

Unter Signaltransduktion versteht man die Weiterleitung eines Primärsignals und die im Endeffekt daraus resultierenden Vorgänge innerhalb einer Zelle. Sie dient der Integration einer Zelle in ihre Umwelt und gibt ihr die Möglichkeit auf verschiedene interne oder externe Reize entsprechend zu reagieren. Die Signaltransduktion wird durch eine Vielzahl von Signalwegen vermittelt. An denen sind eine große Anzahl von Enzymen und sekundären Botenstoffen in einer oder mehreren nachgeschalteten Ebenen beteiligt. In der Literatur wird dabei auch oft von Signalkaskaden gesprochen [1]. Ein Signalweg steht und wirkt aber nie isoliert, sondern seine Signale werden zusammen mit denen anderer Signalkaskaden im Zytoplasma oder Zellkern integriert. Durch Signalkaskaden entsteht ein komplexes Signalnetzwerk, welches viele Feedback-Reaktionen und eine bessere Reaktionsfähigkeit bei auftretenden Störungen ermöglicht. Signaltransduktionsvorgänge sind für alle Organismen von essentieller Bedeutung. Da sie es zum einen ermöglichen auf Veränderungen ihrer Umwelt entsprechend zu reagieren und so ihr Überleben zu sichern und zum anderen, wie bereits erwähnt, um innere und äußere Reize zu verarbeiten. Durch Signaltransduktion werden wichtige biologische Prozesse reguliert wie z.B. die Immunreaktion, sämtliche Sinneswahrnehmungen, Zellproliferation und Gentranskription.

Am Anfang einer jeden Signaltransduktionskette steht ein extrazellulärer oder intrazellulärer Reiz. Dies können Hormone, Wachstumsfaktoren oder Neurotransmitter aber auch elektromagnetische Wellen (Licht), Duftstoffe oder mechanische Reize sein. Die extrazellulären Signale werden von einem Rezeptormolekül empfangen, welches gewöhnlich nur von einem bestimmten Signaltyp aktiviert werden kann. Daraufhin wird ein intrazelluläres Signal erzeugt, was in der Folge zu einer Signalkaskade führt bis eine endgültige Antwort der Zelle wie z.B. Aktivierung eines Stoffwechselenzyms oder Anschalten der Expression eines Gens ausgelöst wird [1]. Im Folgenden soll näher auf die Auslösung von Signalwegen durch Wachstumsfaktoren eingegangen werden. Diese spielen bei dem in dieser Arbeit untersuchten PI3K/AKT Signalweg eine entscheidende Rolle.

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Bei Wachstumsfaktoren handelt es sich um extrazelluläre Signalproteine, die verschiedenste intrazelluläre Prozesse regeln (Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung) und insbesondere bei der Entwicklung von mehrzelligen Organismen eine wichtige Funktion übernehmen. Das Signal wird in der Regel über die Bindung des Wachstumsfaktors an einen spezifischen Rezeptor in der Zellmembran vermittelt. Es gibt sechs große Familien von Wachstumsfaktoren: FGF-Familie (Fibroblast growth factor), TGF-Familie (Transforming growth factor), Hedgehog, Wingless, Delta und Serrate und Ephrine. Bei Bindung an ihren jeweiligen spezifischen Rezeptor erzeugt dieser durch Konformationsänderung im Inneren der Zelle ein Signal, welches über eine Signalkaskade zur Aktivierung oder Abschaltung von Genen führt. Im Falle des untersuchten Signalweges handelt es sich um Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK), eine Klasse der enzymgekoppelten Oberflächenrezeptoren. Ein wichtiger Signalweg, der durch die Bindung von Wachstumsfaktoren an diese RTKs aktiviert wird, ist der PI3K/Akt Signalweg, der im nächsten Abschnitt ausführlich besprochen werden soll. [2]

1.2 Der PI3K/Akt Signalweg

Der Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) Signalweg vermittelt zelluläre Wirkungen von Insulin und Wachstumsfaktoren. Auf der einen Seite schützt die Aktivierung des PI3K Signalweges vor vorprogrammiertem Zelltod (Apoptose). Diese Wirkung ist besonders für das Überleben und Wachstum von Tumorzellen von Bedeutung und kann dadurch zur Tumorentwicklung beitragen. Auf der anderen Seite spielt der PI3K Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels durch Insulin und gestörte Funktionen des Signalweges begünstigen die Entwicklung des Diabetes mellitus. Auf diese Funktion soll im Folgenden nicht näher eingegangen werden. Die nachfolgenden Ausführungen konzentrieren sich auf die Bedeutung des PI3K/Akt Signalweges im Zusammenhang mit der Entstehung und Entwicklung von Tumoren.

Der PI3K/Akt-Kinaseweg ist ein wichtiger Regulator des Zellüberlebens. Seine Aktivierung spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl zellulärer Prozesse wie z.B. Transkription, Proliferation, Migration, Zellwachstum, Apoptose und

Glucosemetabolismus. [3, 4] Die Aktivierung der Lipidkinase PI3K wird neben

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Die folgende Abbildung (Abb. 1) gibt einen kurzen Überblick über die Regulation des PI3K/Akt-Signalweges.

PI3Ks sind heterodimere Moleküle, die aus einer katalytischen (p110, 110 kD) und einer regulatorischen (p85, 85 kD) Untereinheit aufgebaut sind. Die Aktivierung einer Rezeptor-Tyrosin-Kinase durch Bindung eines der oben genannten Moleküle führt zur Aktivierung von PI3K, welche daraufhin innerhalb von Sekunden Phosphatidylinositole der Zellmembran phosphoryliert, d.h. aus PIP 2 entsteht durch Phosphorylierung PIP 3, ein wichtiger sekundärer Botenstoff. Die Aktivierung der regulatorischen Untereinheit der PI3K kann ebenfalls über G-Protein gekoppelte Rezeptoren erfolgen [3]. PIP 3 rekrutiert nun Proteinkinasen wie z.B. PKB/Akt und PDK1, die mit ihrer PH- (Pleckstrin-homologe) Domäne an PIP 3 binden. Die Lokalisierung an die Zellmembran führt zu Konformationsänderungen, durch die zwei Phosphorylierungsstellen des AKT-Moleküls exponiert werden. Die vollkommene Aktivierung von Akt erfordert die Phosphorylierung des Moleküls an beiden Stellen. Durch PDK2 (Ser473-Kinase) wird das Molekül beim Ser473 phosphoryliert und durch PDK1 bei Thr-308. PKB/Akt ist nun in aktiviertem Zustand dazu in der Lage eine große Anzahl an zellulären Signalmolekülen, die für die Regulation von Zellwachstum, Zellzyklus und Zellteilung wichtig sind, zu phosphorylieren. Als direkter Gegenspieler von Akt ist PTEN (Phosphatase und Tensin Homolog) zu nennen, welches die Umwandlung von PIP 3 zu PIP 2 fördert und somit eine Aktivierung von PKB/AKT verhindert [6]. Die Möglichkeit zur Inaktivierung bzw. Regulierung des Signalweges ist wichtig, um die Homöostase (Gleichgewicht) der verschiedenen zellulären Prozesse aufrecht zu erhalten.

Das Protein AKT spielt innerhalb des PI3K-Signalweges eine zentrale Rolle und ist wichtig bei der Vermittlung der PI3K-Effekte. Es handelt sich dabei um eine 57kD Ser/Thr-Kinase und das zelluläre Homologon des viralen Onkoproteins v-Akt. Es ist verwandt mit den Proteinkinasen A und C bei Säugetieren und wird deshalb auch häufig als Proteinkinase B bezeichnet [3]. Es gibt drei verschiedene AKT-Isoformen, die von unterschiedlichen Genen codiert werden: Akt1 (PKBα), Akt2 (PKBβ) und Akt3 (PKBγ). Akt1 wird ubiquitär in hohem Maße exprimiert, Akt2 kommt vorrangig in insulinsensitivem Gewebe einschließlich Leber, Skelettmuskulatur und Fettgewebe vor und Akt3 wird am stärksten im Gehirn exprimiert.

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Jede Isoform besteht aus drei funktionellen Domänen: eine N-terminale PH-Domäne für die Bindung von Inositol-Phospholipiden und die Rekrutierung von AKT an die Plasmamembran, eine zentrale Kinase-Domäne und eine C-terminale regulatorische Domäne. Nach seiner vollständigen Aktivierung wird AKT in das Zytoplasma und den Zellkern translokalisiert, wo sich viele seiner Substrate befinden.

Der PI3K-Signalweg und somit auch AKT spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen Prozessen wie z.B. der Apoptose, genauer gesagt bei der Hemmung der Apoptose. Zum einen schützt AKT durch die Inaktivierung proapoptotischer Faktoren Krebszellen vor apoptotischen Eingriffen. Zu diesen Faktoren gehören u.a. BAD (BCL2antagonist of death), procaspase-9 und Forkhead Transkriptionsfaktoren [28, 29]. Zum anderen aktiviert AKT Transkriptionsfaktoren, die zur Hochregulation anti-apoptotischer Gene wie cyclic-AMP- response element-binding protein (CREB) führen.

Eine weitere bedeutende Rolle kommt AKT bei der Regulierung der Zellproliferation zu. Die Stimulation der Zellteilung wird durch die Aktivierung von mTor (mammalian target of rapamycin) durch AKT vermittelt. Ein wichtiger Bindungspartner von mTOR ist proline-rich Akt substrate 40 kDa (PRAS40). Unterphosphoryliertes PRAS40 hemmt die mTOR Kinaseaktivität [30, 31]. Daraufhin werden die ribosomale Proteinkinase p70S6k

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durch mTOR phosphoryliert. Das führt zu erhöhter Translation existierender mRNA Transkripte [32].

Solange der PI3K/AKT-Signalweg nicht von Mutationen oder anderweitigen Veränderungen betroffen ist, trägt er zur Aufrechterhaltung wichtiger physiologischer Prozesse bei. Allerdings ist er der am häufigsten von Veränderungen wie z.B. Amplifikationen, Mutationen und Rearrangements betroffene Signalweg, die dann im Endeffekt zur Entwicklung von Krebserkrankungen führen können [3]. Welche pathologischen Veränderungen Einfluss auf die Entstehung von Krebs haben, soll im nächsten Abschnitt besprochen werden.

1.3 Pathologische Veränderungen im PI3K/AKT Signalweg

Die Störung des Gleichgewichts zwischen Zellteilung und programmiertem Zelltod (Apoptose) ist die Ursache für die Entwicklung und das Fortschreiten von Krebserkrankungen. Der PI3K-Signalweg spielt bei beiden Prozessen eine wichtige Rolle.

Viele Komponenten dieses Signalwegs sind bei einer großen Anzahl von Tumoren dereguliert [5] und eine Überaktivierung des Signalwegs führt zudem zur Resistenz gegenüber verschiedenen Krebstherapien [7, 8]. Zum einen kann eine Veränderung des Signalweges bereits oberhalb von PI3K und AKT stattfinden, andererseits können die Moleküle PI3K, AKT und PTEN selbst betroffen sein.

Die Überexpression des erbB2 Tyrosin-Kinase-Rezeptors als ein Resultat von Genamplifikation ist ein gut untersuchtes Beispiel für die Überexpression von Zelloberflächenrezeptoren, was in der Folge zu einer verstärkten Aktivierung von downstream-Signalwegen u.a. auch des PI3K-Signalweges führt [3].

Bei der Betrachtung von PI3K, AKT und PTEN ist festzustellen, dass es Mutationen bei PI3KCA, welches für eine der p110 α Untereinheiten von PI3K codiert, gibt. Zudem führen Mutationen von PTEN und auch dessen vollständige Inaktivierung dazu, dass PIP 3 nicht mehr zu PIP 2 dephosphoryliert werden kann. Das vollkommene Ausschalten von PTEN wird oft in primären Tumoren und Krebszelllinien beobachtet [9, 10, 11]. Die genannten Veränderungen führen zu erhöhter Aktaktivität. Ebenso resultieren Abwandlungen von Wachstumsfaktorrezeptoren und Ras in Hyperaktivität von AKT in Tumorzellen [12] und vermitteln dadurch antiapoptotische Wirkungen auf Krebszellen.

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Großangelegte Sequenzierungen konnten zur Identifizierung von

Keimbahnpolymorphismen und somatischen Mutationen bei AKT2 und AKT3 beitragen [13, 14]. Es gibt in der PH-Domäne von AKT1 eine Mutation, die sehr selten ist und zunächst für Brust-, Kolorektal- und Eierstockkrebs beschrieben wurde [15] Später wurde diese Mutation auch für andere Krebserkrankungen nachgewiesen [16, 17, 18].

Die folgende vereinfachte Abbildung zeigt, dass alle entscheidenden Moleküle des PI3K-Signalweges von genetischen Veränderungen bei Krebserkrankungen betroffen sein können.

Die Überaktivierung bzw. unkontrollierte Aktivierung von AKT durch Genamplifikation von PI3K, AKT in Hirntumoren [20, 21, 22, 23] und anderen Tumorerkrankungen [24, 25, 5] oder durch Mutation bzw. Funktionsverlust von PTEN [20, 26, 27] steht mit der Entwicklung von Krebserkrankungen in Zusammenhang. Diese Tatsache führt zu dem Schluss, dass Möglichkeiten der Inaktivierung des PI3K/AKT-Signalweges durch Inhibitoren wie Wortmannin, LY294002 oder auch durch die gezielte Ausschaltung der Gene durch Transfektion mit siRNA, einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Krebserkrankungen darstellen können [3].

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