Inhaltsverzeichnis

Abk  ürzungsverzeichnis  v

Abbildungsverzeichnis   viii

Tabellenverzeichnis   x

1  Einleitung  1

1.1  Xenotransplantation  1

1.1.1  Mangel an Allotransplantaten  1

1.1.2  Alternativen zur Allotransplantation  2

1.1.3  Risiken der Xenotransplantation  4

1.1.3.1  Immunologische Abstoßungsreaktionen  4

1.1.3.2  Physiologische Inkompatibilität  6

1.1.3.3  Potentielle Übertragung von porzinen Mikroorganismen  7

1.2  Retroviren  8

1.2.1  Taxonomie der Retroviren  9

1.2.2  Morphologie der Retroviren  10

1.2.3  Retrovirale Genomstruktur  11

1.2.4  Retrovirale Replikation  12

1.2.5  Porzine endogene Retroviren (PERVs)  15

1.3  RNA-Interferenz  19

1.4  Zielsetzung  21

2  Material und Methoden  23

2.1  Material  23

2.1.1  Bakterienstämme  23

2.1.2  Enzyme  23

2.1.3  Oligonukleotide  24

Seite   i

Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________

2.1.4  Plasmide  27

2.1.5  Antikörper  28

2.1.6  Eukaryotische Zellen  29

2.1.7  Versuchstiere  29

2.1.8  Nährmedien und Lösungen  29

2.1.9  Kommerzielle Kits  32

2.1.10  Hersteller  32

2.2  Methoden.  33

2.2.1  Mikrobiologische Methoden  33

2.2.1.1  Stammhaltung von Bakterien  33

2.2.1.2  Kultivierung von Bakterien  34

2.2.1.3  Herstellung kompetenter Bakterien und Transformation durch  

Hitzeschock.   34

2.2.2  Molekularbiologische Methoden  34

2.2.2.1  Isolierung von Plasmid-DNA  34

2.2.2.2  Isolierung genomischer DNA aus eukaryotischen Zellen  35

2.2.2.3  Phenol-Chloroform-Extraktion  35

2.2.2.4  Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen  36

2.2.2.5  Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren  36

2.2.2.6  Restriktion von DNA  37

2.2.2.7  Ligation von DNA-Fragmenten  37

2.2.2.8  Agarosegelelektrophorese  37

2.2.2.9  Gelextraktion linearer DNA-Fragmente  38

2.2.2.10  PCR (Polymerase Chain Reaction)  38

2.2.2.11  one-step RT (Reverse Transcriptase) PCR  39

2.2.2.12  one-step RT (Reverse Transcriptase) real-time PCR.  40

2.2.2.13  DNA-Sequenzierung  42

2.2.3  Proteinchemische Methoden  42

2.2.3.1  Isolierung von Gesamtprotein aus eukaryotischen Zellen  42

Seite   ii

Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________

2.2.3.2  Bestimmung der Proteinkonzentration  42

2.2.3.3  SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)  43

2.2.3.4  Western Blot-Analyse  44

2.2.4  Zellbiologische Methoden  45

2.2.4.1  Kultivierung eukaryotischer Zellen  45

2.2.4.2  Kryokonservierung eukaryotischer Zellen  45

2.2.4.3  Zellzählung und Vitalitätsbestimmung mit Trypanblau  46

2.2.4.4  Transfektion eukaryotischer Zellen mit Plasmid-DNA  46

3  Ergebnisse  47

3.1  Hemmung der PERV-Expression in Fibroblasten Pol2-shRNA-transgener  

Schweine.   47

3.1.1  Generierung shRNA-transgener Schweine mittels Nukleus-Transfer  47

3.1.2  Nachweis der Transgen-Integration mittels Fluoreszenz  48

3.1.3  Nachweis der Transgen-Integration mittels PCR  50

3.1.4  Etablierung einer one-step RT real-time PCR zur Quantifizierung der PERV-  

mRNA   51

3.1.5  Qualitativer Nachweis von PERV in primären Fibroblasten transgener  

Schweine.   54

3.1.6  Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in primären Fibroblasten  

transgener  Schweine  56

3.2  Hemmung der PERV-Expression in PK15- und PERV-A/C infizierten 293-Zellen  

mittels  neu synthetisierter shRNAs  58

3.2.1  Selektion eines PERV-A/C infizierten 293-Klons zur Generierung einer Zelllinie  

mit  gleicher Provirusintegration  58

3.2.2  Generierung und Klonierung neuer Expressionskassetten für PERV-  

spezifische  -shRNAs  59

3.2.3  Stabile Transfektion von PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen mit  

shRNA  -Expressionskassetten  62

3.2.4  Nachweis der shRNA-Expressionskassetten in PK15- und PERV-A/C-infizierten  

293-Zellen   63

Seite   iii

Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________

3.2.5  Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in shRNA-transgenen Zellen auf  

Molekularebene   64

3.2.6  Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in shRNA-transgenen PK15-  

Zellen  auf Proteinebene  67

4  Diskussion  69

4.1  shRNA-spezifische Hemmung der PERV-Expression in transgenen Schweinen  70

4.2  Effizienzsteigerung der PERV-Expressionshemmung durch neu generierte  

shRNAs.   75

5  Zusammenfassung  78

Literaturverzeichnis   I

Danksagung   XI

Seite   iv

Abkürzungsverzeichnis

A Adenin AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome APC Antigen-Presenting Cell as AntiSense ATP Adenosin Triphosphate BaEV Baboon endogenous virus BCA Bicin-Choninic Acid BHQ Black Hole Quencher bp Base Pair C Cytosin cDNA Copy Desoxy Ribonucleic Acid CMV Cytomegalievirus Threshold Cycle C ^T ddH 2 O Double Distilled H 2 O DEPC Diethylene Pyrocarbonate DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide DNA Desoxy Ribonucleic Acid dNTP Desoxy Nucleotide Triphosphate DPF Designated Pathogen Free dsRNA Double-stranded RNA DSO Deutsche Stiftung Organtransplantation ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid FeLV Feline Leukemia Virus FKS Fötales Kälberserum G Guanin GALV Gibbon Ape Leukemia Virus GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase GFP Green Fluorescent Protein HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Acid HERV Human Endogenous Retrovirus HIV Human Immunodeficiency Virus HRP Horseradish Peroxidase

Seite | v

Abkürzungsverzeichnis

HTLV Human T-Lymphotropic Virus HuPAR Human PERV-A-Receptor ICTV International Committee On Taxonomy Of Viruses Ig Immune Globulin JEV Japanese Encephalitis Virus KoRV Koala Retrovirus Lysogeny Broth LB LTR Long Terminal Repeat miRNA Micro Ribonucleic Acid MMTV Mouse Mammary Tumor Virus MHC Major Histocompatibility Complex mRNA Messenger Ribonucleic Acid MuLV Murine Leukemia Virus nt Nucleotide PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PCV Porcine Circovirus PERV Porcine Endogenous Retrovirus POD Peroxidase PPV Porcine Parvovirus PVDF Polyvinylidene Fluoride RIPA Radio Immuno Precipitation Assay RISC RNA Induced Silencing Complex RNA Ribonucleic Acid RNAi Ribonucleic Acid Interference RT Reverse Transcriptase, Raumtemperatur s Sense SARS Servere Acute Respiratory Syndrome SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFV Simian Foamy Virus siRNA Small interfering Ribonucleic Acid shRNA Small hairpin Ribonucleic Acid SVDV Swine Vesicular Disease Virus T Thymin TAE Tris-Acetate-EDTA Seite | vi

Abkürzungsverzeichnis

TPG Transplantationsgesetz Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane tRNA Transfer Ribonucleic Acid U Uracil UV Ultraviolet VIS Visible Spectrum VSV Vesicular Stomatitis Virus

Seite | vii

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Aufbau eines γ-Retrovirus .............................................................................10 Abbildung 1.2: Genomstruktur der Retroviren .......................................................................12 Abbildung 1.3: Bildung doppelsträngiger DNA aus einzelsträngiger RNA im Zuge der

Retrovirus-Replikation ..........................................................................................................14 Abbildung 1.4: Rasterelektronische Aufnahme von porzinen endogenen Retroviren (PERVs)

.............................................................................................................................................18 Abbildung 1.5: Schematische Darstellung des RNAi-Mechanismus......................................20 Abbildung 2.1: pSuper [Oligoengine, Seattle, WA, USA] ......................................................27 Abbildung 2.2: RNAi-Ready pSiren-RetroQ [Clontech, Mountain View, CA, USA] ................28 Abbildung 2.3: Funktionsweise der TaqMan-Sonden Hydrolyse ...........................................41 Abbildung 3.1: Schematische Darstellung des lentiviralen Vektors plVTHM .........................48 Abbildung 3.2: shRNA-transgene Ferkel unter Bestrahlung mit VIS- und UV-Licht ...............48 Abbildung 3.3: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen primärer porziner Fibroblasten .......49 Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Position der verwendeten Primersets im Vektor

.............................................................................................................................................50 Abbildung 3.5: Transgennachweis im Genom primärer porziner Fibroblasten mittels PCR

unter Verwendung der GFP-Primer ......................................................................................50 Abbildung 3.6: Transgennachweis im Genom primärer porziner Fibroblasten mittels PCR

unter Verwendung der 3’LTR-Primer ....................................................................................51 Abbildung 3.7: Transgennachweis im Genom primärer porziner Fibroblasten mittels PCR

unter Verwendung der shRNA-Pol2-Primer ..........................................................................51 Abbildung 3.8: Bestimmung der Effizienz in einer one-step RT real-time PCR .....................53 Abbildung 3.9: Qualitativer Nachweis der PERV Provirus-Integration in primären porzinen

Fibroblasten, PK15- und PERV-A/C-inf. 293-Zellen ..............................................................54 Abbildung 3.10: Qualitativer Nachweis der PERV-Expression in primären porzinen

Fibroblasten, PK15- und PERV-A/C-inf. 293-Zellen ..............................................................55 Abbildung 3.11: Quantitativer PERV-Expressionsnachweis in Fibroblasten transgener

Schweine ..............................................................................................................................57 Abbildung 3.12: Provirusnachweis in de novo PERV-A/C-infizierter 293-Zellen ....................58 Abbildung 3.13: Bindungsstellen der generierten shRNAs auf der mRNA von PERV ...........59 Abbildung 3.14: Schematische Darstellung der Klonierungsstrategie ...................................61 Abbildung 3.15: Nachweis der shRNA-Expressionskassetten in PK15- und PERV-A/C-

infizierten 293-Zellen ............................................................................................................64 Abbildung 3.16: Relative PERV-Expression einzelner Zelllinien ...........................................65

Seite | viii

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 3.17: shRNA-induzierte Hemmung der PERV-Expression in PK15-Zellen ...........66 Abbildung 3.18: shRNA-induzierte Hemmung der PERV-Expression in PERV-A/C-infizierten

293-Zellen ............................................................................................................................67 Abbildung 3.19: Hemmung der p60Gag-Expression durch stabil transfizierte shRNAs in

PK15-Zellen .........................................................................................................................68

Seite | ix

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Charakteristische Vertreter der Retroviren (modifiziert nach Modrow, 2003) ...... 9 Tabelle 2.1: Komponenten und Temperaturprogramm einer Standard-PCR .........................39 Tabelle 2.2: Komponenten und Temperaturprogramm einer one-step RT-PCR....................40 Tabelle 2.3: Komponenten und Temperaturprogramm einer one-step RT real-time PCR .....41 Tabelle 2.4: Komponenten und Temperaturprogramm einer Sequenzierungs-PCR .............42 Tabelle 2.5: Komponenten eines Sammel- und Trenngels für die diskontinuierliche SDS-

PAGE ...................................................................................................................................43 Tabelle 3.1: Komponenten und Temperaturprogramm der duplex one-step RT real-time PCR

.............................................................................................................................................53 Tabelle 3.2: Auflistung der transfizierten shRNA-Expressionskassetten ...............................62

Seite | x

1 Einleitung

1.1 Xenotransplantation

1.1.1 Mangel an Allotransplantaten

Die Allotransplantation (gr. allos: anders), d. h. die Übertragung von Zellen, Geweben und Organen zwischen genetisch verschiedenen Individuen derselben Spezies, hat sich in der Medizin inzwischen zu einer weit verbreiteten Methode etabliert. Schon 1906 gelang dem österreichischen Augenarzt Zirm die erste erfolgreiche Hornhauttransplantation mit einer menschlichen Hornhaut [1]. Zu Beginn des 20. Jahrhunderts entwickelten sich mit ausgedehnten Fortschritten auf dem Gebiet der Gefäßchirurgie die Voraussetzungen zur Transplantation von Organen. So führte der Ukrainer Voronoy 1933 die erste Nierentransplantation von einem verstorbenen Spender durch, die jedoch aufgrund von immunologischen Abstoßungsreaktionen des Empfängers nicht erfolgreich war [2]. Erst die Entwicklung von Immunsuppressiva Anfang der sechziger Jahre verhalf der Transplantationstechnologie zum Durchbruch. 1967 erfolgte die erste erfolgreiche Herztransplantation durch den südafrikanischen Herzchirurgen Banard [3], der damit einen Meilenstein in der Geschichte der Allotransplantation setzte.

In Deutschland gibt es zurzeit 50 Einrichtungen, die für die Übertragung von Organen zugelassen sind. Von 1963 bis 2007 wurden fast 89 000 Organe transplantiert, darunter hauptsächlich Nieren und Leber, aber auch Herz, Lunge, Pankreas und Dünndarm [Deutsche Stiftung Organtransplantation (DSO) 2007]. Das deutsche Transplantationsgesetz (TPG), welches 1997 in Kraft trat, regelt die Spende, Entnahme, Vermittlung und Übertragung von Organen, die nach dem Tod oder zu Lebzeiten gespendet werden. Trotz europaweiter Koordination und Verteilung von geeigneten Transplantaten [Eurotransplant International Foundation], herrscht ein akuter Organmangel. Im Jahr 2007 warteten ca. 8 000 Dialysepatienten in Deutschland auf eine geeignete Spenderniere. Die Zahl war damit fast dreimal so hoch, wie die der im selben Jahr transplantierten 2907 Nieren. Rund 30 % der Patienten auf der Warteliste verstarben, weil das gewünschte Transplantat nicht zur Verfügung stand [DSO, 2007]. Die schon ohnehin abnehmende Spendenbereitschaft vieler potentieller Organspender wird zusätzlich durch die öffentliche Diskussion des Hirntodes, der in vielen Ländern den Zeitpunkt der Organentnahme festsetzt und die damit verbundene Angst vor einer vorzeitigen Extransplantation [4] erschwert. Zudem fördert das Defizit an

Seite | 1

1 Einleitung

Spendertransplantaten den kriminellen Handel mit Organen, vor allem in Ländern, in denen dieser nicht gesetzlich verboten ist [5].

Um dem eklatanten Mangel an Allotransplantaten zumindest zeitweise beizukommen, ist es notwendig, geeignete Alternativen zu finden.

1.1.2 Alternativen zur Allotransplantation

In der modernen Medizin wurden bis heute mehrere Ansätze entwickelt, von denen einige vielversprechende Alternativen zur klassischen Allotransplantation darstellen. Eine Möglichkeit bieten künstliche Transplantate, die die Aufgaben von Organen oder Teile davon übernehmen. Der Herzchirurg DeBakey implantierte schon 1966 einer Mexikanerin eine Pumpe, die temporär die linke Herzkammer unterstützte [6]. Drei Jahre später wurde durch den Amerikaner Cooley erstmals ein total implantierbares, pneumatisch betriebenes Kunstherz einem Patienten eingesetzt, welches für 64 Stunden die Perfusion übernahm, bis dann die Herztransplantation durchgeführt werden konnte [7]. Verschiedene Probleme haben jedoch über Jahrzehnte die Entwicklung der Kunstherzen begleitet, und teilweise sind befriedigende Lösungen bis heute noch nicht vollständig realisiert. Seit 1945, als es dem Internisten Willem Kolff gelang, eine Patientin mit akutem Nierenversagen mit einer eigens entwickelten Trommelniere aus Zellophanröhren zu dialysieren [8], sind auch im Bereich der Dialysebehandlung mit Hilfe der künstlichen Niere große Fortschritte gemacht worden. Dennoch ist die Dialyse keine Dauerlösung, da sich mit der Zeit große Mengen an Schadstoffen im But ansammeln, die zu schweren Folgeerkrankungen führen können. Organe mit komplexen Stoffwechselmechanismen, wie beispielsweise der Leber, sind zurzeit durch maschinelle, künstlich geschaffene Transplantate nicht zu ersetzen. Eine weitere Möglichkeit stellt die Züchtung von morphologisch ähnlichen Organen aus humanen Stammzellen dar. Durch „tissue-engineering“ lassen sich bereits heute einfache autologe Zellverbände im großen Maßstab produzieren. Mit diesem gezüchteten Gewebe können Heilungsprozesse (beispielsweise offene Wunden) unterstützt, funktionsuntauglich gewordenes Gewebe (beispielsweise Knorpelgewebe in den Gelenken) regeneriert, sowie zerstörte Gewebe (beispielsweise verbrannte Haut) ersetzt werden [9]. Auch die Reparatur geschädigter Herzklappen oder der Luftröhre durch „tissue-engineering“ zeigt ermutigende Fortschritte [10]. Das Fernziel ist die Züchtung von komplexen Geweben und Organen. Dafür ist es notwendig, alle für die Ausdifferenzierung notwendigen Faktoren der Zelle zu kennen, um beispielsweise auch das Entstehen von Karzinomen zu unterbinden.

Seite | 2

1 Einleitung

Eine weitere sehr erfolgsversprechende Alternative stellt die Xenotransplantation (gr. xénos: Fremder) dar, bei der es sich um die Übertragung von lebens- und funktionstüchtigen Zellen oder Zellverbänden sowie ganzer Organe zwischen verschiedenen Spezies handelt. Bereits im 17. Jahrhundert gab es Experimente, zerstörte menschliche Haut durch Gewebe von Tieren zu ersetzen. Erste Versuche der Nierentransplantation vom Tier auf den Menschen gab es 1906 durch Mathieu Jabouly, die jedoch scheiterten. Ebenso vergeblich versuchte Unger 1910 die Übertragung einer Rhesusaffenniere auf den Menschen. Bis zur Entwicklung der ersten Immunsuppressiva waren alle weiteren Versuche einer Xenotransplantation aufgrund der hyperakuten Abstoßung des Immunsystems erfolglos. Erst 1964 gelang den Chirurgen Oscar Creech und Keith Reemtsma die Transplantation der Nieren eines Schimpansen [11]. Der Patient lebte noch neun Monate nach der Operation. 1984 verpflanzte der amerikanische Arzt Leonard Bailey ein Pavianherz in ein mit schwerem Herzfehler neugeborenes Mädchen [12], welches nach 21 Tagen an multiplem Organversagen verstarb. In den Jahren 1992 und 1994 folgten weitere Transplantationsversuche mit Herz und Leber, die jedoch erneut zu einer hyperakuten Abstoßung mit letalem Ausgang führten [13]. Trotz fortschreitender Weiterentwicklung der Immunsuppressiva und stetig wachsendem Wissen über immunologische Abstoßungsreaktionen, können solide Xenotransplantate derzeit nicht übertragen werden. Wesentlich weiter ist man schon im Bereich der Transplantation von tierischen Zellen und Zellverbänden auf den Menschen. So verspricht der Einsatz von verkapselten, fötalen porzinen Inselzellen bei Diabetes mellitus Typ I Patienten eine deutliche Verbesserung der Blutzuckerkontrolle [14]. Die Einbettung der Inselzellen in Alginat und die damit verbundene räumliche Trennung des Immunsystems des Rezipienten und des xenogenen Transplantats verhindert die für gewöhnlich auftretende starke Immunantwort, was den Einsatz von Immunsuppressiva überflüssig macht. Zusätzlich wird die Übertragung von porzinen endogenen Retroviren und weiteren Mikroorganismen stark eingeschränkt [15] (1.1.3). Auch bei Parkinson- und Huntington-Patienten wurden klinische Studien zur Transplantation porziner Neurone durchgeführt, die zu positiven Ergebnissen führten [16, 17]. Des Weiteren wurden schon porzine Hepatozyten als unterstützende Therapie in bioartifiziellen ex vivo Reaktoren eingesetzt, um die lebensbedrohliche Situation nach akutem Leberversagen zu überbrücken [18, 19].

Seite | 3

1 Einleitung

1.1.3 Risiken der Xenotransplantation

In der Vergangenheit wurden nicht-humane Primaten aufgrund der nahen Verwandtschaft zum Menschen als Spendertiere für die Xenotransplantation in Erwägung gezogen. Gerade bei Schimpansen weisen Anatomie und Physiologie der Organe sowie die Blutgruppen eine hohe Übereinstimmung mit denen des Menschen auf. Zudem ist die immunologische Abstoßungsgefahr des Rezipienten nach der Organverpflanzung im Vergleich zu anderen Spendertieren nur gering. Allerdings erweist sich die geringe Nachkommenschaft und die lange Tragezeit der Primaten als erheblicher Nachteil, da keine geeignete Anzahl an Spendertieren zu gewährleisten ist. Neben den ethischen Bedenken und dem strengen Artenschutz kommt hinzu, dass die DPF (designated pathogen free)-Haltung und Aufzucht der Tiere extrem kostspielig ist. Das Hauptproblem stellt aber die hohe mikrobielle Durchseuchung der Primaten dar. Aufgrund der phylogenetischen Nähe zum Menschen ist die Gefahr von Zoonosen (Übertragung von Infektionskrankheiten von Tier auf Mensch) besonders groß, insbesondere wenn das Immunsystem des Rezipienten durch Immunsuppressiva geschwächt ist. So wurde in klinischen Studien bei einer Transplantation von einer Pavianleber auf den Menschen die Übertragung des Simian Foamy Virus (SFV), des endogenen Pavian Retrovirus (BaEV) und des Cytomegalievirus (CMV) nachgewiesen [20, 21].

Momentan werden daher Schweine als Organquelle für die Xenotransplantation favorisiert. Ihre Physiologie und Organgröße ist denen des Menschen ähnlich [22, 23], die Tragezeit ist kurz und die Zahl der Nachkommen liegt etwa bei 10 bis 18 Tieren. Darüber hinaus sind die Kosten für DPF-Haltung und Aufzucht wesentlich geringer. Des Weiteren lassen sich gentechnisch veränderte und transgene Schweine leicht generieren. Dennoch gibt es auch beim Schwein als Spendertier noch einige Hürden zu überwinden, um eine komplikationslose Transplantation zu garantieren.

1.1.3.1 Immunologische Abstoßungsreaktionen

Das erste ernst zu nehmende Problem stellen die Abstoßungsreaktionen durch das Immunsystem des humanen Organempfängers dar. Was ansonsten bei der Abwehr pathogener Keime wie Parasiten, Bakterien und Viren erwünscht ist, führt bei der Transplantation zu einer Zerstörung des xenogenen Organs. Verantwortlich dafür sind unter anderem die T-Zell-Antworten des Menschen gegen die hochpolymorphen MHC (major histocompatibility complex)-Moleküle. Diese unterscheiden sich bei Schweinen deutlich von

Seite | 4

1 Einleitung

denen des Menschen, weswegen das Ausmaß der Abstoßungsreaktion im Vergleich zur Allotransplantation noch größer ist.

Die erste Stufe der Abstoßungsreaktion erfolgt schon innerhalb von 24 Stunden nach der Transplantation und wird als hyperakute Abstoßung bezeichnet. Spezifische Immunglobuline (IgGs) des humanen Organismus erkennen Epitope von Galactosyl-α-1,3-galactosyl-Resten auf der Oberfläche von Bakterien und binden an diese. Das daraufhin aktivierte Komplementsystem führt zur Zerstörung der Pathogene. Unglücklicherweise richten sich diese Antikörper auch gegen Epitope von porzinen Endothelzellen der Organgefäße, welche auf der Oberfläche der Zellen aller Säuger mit Ausnahme des Menschen und der Altwelt-Affen zu finden sind [24]. Dabei kommt es durch die Komplement- und Gerinnungskaskade zum Gefäßverschluss im Transplantat und damit zum Absterben des Organs. Um die hyperakute Abstoßung zu verhindern, wurden porzine Oligosaccharide verwendet, die die präformierten Antikörper gegen Gal-α-1,3-gal binden und deren Zytotoxizität vermindern [25]. Mittlerweile ist jedoch gelungen, transgene α-1,3-Galactosyltransferase knock-out-Schweine zu züchten, die das Gal-α-1,3-gal-Epitop nicht mehr auf der Oberfläche von Endothelzellen tragen. Zusätzlich konnten die porzinen Komplement-regulatorischen Proteine wie CD46, CD55 und CD59 durch humane Varianten ersetzt werden [26-28]. Einige Tage nach der Xenotransplantation tritt die akut vaskuläre Abstoßung auf, die ebenfalls durch humane Antikörper gegen Kohlenhydrat-Epitope ausgelöst wird. Daraufhin setzt erneut die Komplementaktivierung mit den oben beschriebenen Auswirkungen ein. Zusätzlich kommt es zu einer starken Bildung von Adhäsionsmolekülen, wie Selektinen und Integrinen, was eine vermehrte Anlagerung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und Monozyten als Folge hat und zu einem Verlust der ansonsten antithrombogenen Eigenschaft des Endothels führt [29]. Zudem wurde ein erhöhter Titer von anti-porzinen IgMs im Blut beobachtet. Diese lassen sich inzwischen mittels IgM-Depletion oder mit Einsatz von monoklonalen anti-IgM-Antikörpern neutralisieren.

Da sich MHC-Moleküle bei Schweinen und Menschen auf der Oberfläche von Zellen stark unterscheiden, lösen die fremden MHC-Moleküle auf dem Transplantat eine weitere Immunreaktion aus. Dies führt zur akuten T-Zell-vermittelten Abstoßung des Organs. Die direkte Erkennung des übertragenen Organs erfolgt über T-Zellen, deren Rezeptoren für das xenogene MHC-Klasse-I- oder Klasse-II-Molekül in Kombination mit einem Peptid spezifisch sind. Dabei werden die T-Zellen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) des Spenders, die gleichzeitig auch kostimulierend wirken, aktiviert. Bei einem zweiten Mechanismus führt die Aufnahme von xenogenen Proteinen durch APCs des Empfängers und Präsentation durch eigene MHC-Moleküle zur Aktivierung der T-Zellen (indirekte Erkennung). In beiden Fällen kommt es zur Degeneration des xenogenen Transplantats und somit zur Abstoßung innerhalb weniger Tage oder Wochen. Obwohl xenogene Zellen vom Schwein auf T-Zellen Seite | 5

1 Einleitung

weitaus immunogener wirken als allogene, sind die gesammelten Erfahrungen auf dem Gebiet der Immunsuppressiva auch bei der Xenotransplantation von großem Nutzen [30, 31].

Die Hauptursache für ein nach Monaten oder Jahren eintretendes Organversagen ist die chronische Abstoßung, die durch konzentrische arteriosklerotische Ablagerung in den Blutgefäßen des Transplantats, begleitet von glomerulärer und tubulärerer Fibrose und Atrophie, gekennzeichnet ist. Durch xenoreaktive T-Zellen freigesetzte Mediatoren stimulieren die Expression von Adhäsionsmolekülen im Endothel und locken Monocyten an, die zu Makrophagen reifen. Die Produkte der Leukozyten führen zu einer weiteren Mobilisierung von Makrophagen. Die Mediatoren wirken zusammen und verursachen eine chronische Entzündung mit Narbenbildung, sodass es schließlich zum irreversiblen Organversagen kommt. IgG-Antikörper rufen zudem in den übertragenen soliden Organen eine beschleunigte Arteriosklerose hervor.

1.1.3.2 Physiologische Inkompatibilität

Eines der weiteren Probleme ist die physiologische Inkompatibilität des porzinen Spender-organs und des humanen Rezipientenorganismus. Während einige physiologische Mechanismen, wie z. Bsp. die Insulinproduktion beim Schwein und beim Menschen sehr ähnlich ablaufen, gibt es andere, die vollkommen inkompatibel sind und keine Interaktion erlauben. Freigesetzte Mediatoren, wie z. Bsp. Hormone, Zytokine, Adhäsionsmoleküle sowie Selektine und Integrine, aber auch Enzyme sind meist artspezifisch und können evtl. nur schwer mit dem Zielorgan wechselwirken [32]. Unterscheiden sich die Aminosäuresequenzen um mehr als 20 %, sind sie für den Empfänger sogar antigen [33]. Proteasen der Gerinnungskaskade sind artspezifisch und somit inkompatibel, was zu einer ungehinderten Koagulation mit letalem Effekt führt. Auch das porzine Parathormon unterscheidet sich in der Aminosäurezusammensetzung signifikant vom menschlichen Pendant. Im Falle einer Nieren-Xenotransplantation führt dies zu einer Hypophosphatämie im Serum, die für den Menschen lebensbedrohlich werden kann. Die Leber, mit sehr komplexen Stoffwechselfunktionen, benötigt eine optimal eingestellte Steuerung der metabolischen und hormonellen Signale und stellt eine besondere Herausforderung an die moderne Medizin dar. Auch im Bereich der Blutgruppen, Blutgerinnung und Blutviskosität sind noch Hindernisse zu überwinden. Ebenfalls ungeklärt ist die Frage der Anpassung der unterschiedlichen Alterungsgeschwindigkeit porziner und humaner Organe. Herz und Niere scheinen dennoch, gerade wegen der relativ wenigen systemisch hormonellen und enzymatischen Funktionen, die ersten Organe zu sein, die in Zukunft klinisch verwendet werden können.

Seite | 6

1 Einleitung

1.1.3.3 Potentielle Übertragung von porzinen Mikroorganismen

Ein weiteres großes Risiko bei der Xenotransplantation stellt die mögliche Übertragung von porzinen Bakterien, Pilzen, Parasiten und Viren auf den Empfänger dar. Bei der Verpflanzung von Organen werden die physikalischen Barrieren des Organismus als Schutz vor Pathogenen umgangen und das Immunsystem supprimiert, was das Infektionsrisiko des Patienten stark erhöht. Infektionskrankheiten, die auf natürlichem Wege vom Tier auf den Menschen übertragen werden, bezeichnet man als Zoonosen. Im Bereich der Xenotransplantation hat man diesen Begriff auf Xenozoonosen oder kurz Xenosen erweitert. Viele der heute bekannten Infektionskrankheiten sind aus Zoonosen hervorgegangen [34]. Die meisten dieser Mikroorganismen sind im natürlichen Wirt apathogen, können jedoch nach der Übertragung auf den humanen Wirtsorganismus z. Bsp. Leukämien oder Immundefizienzen hervorrufen, während andere asymptomatisch bleiben [35]. Das durch humane Immundefizienzviren (HIV) hervorgerufene Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) [36] und das durch humanpathogene Coronaviren ausgelöste schwere akute Atemnotsyndrom (SARS, servere acute respiratory syndrome) [37], aber auch das Ebola Virus, das Marburg Virus und das H5N1-Influenza Virus sind bekannte Beispiele für eine Transspeziesübertragung.

Viele nicht-virale humanpathogene Erreger des Schweins, wie Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Trichinella spiralis, Strepptococcus suis, Campylobacter coli, Mycobacterium avium, Leptosira interrogans, Brucella suis, Listeria und Erysipelothrix rhusiopathiae [38, 39], lassen sich durch spezielle Zucht und Haltung unter DPF-Bedingungen aus den Schweinen eliminieren [40].

Eine viel größere Gefahr, im Hinblick auf die Xenotransplantation, geht von Viren aus. So sind Schweine Wirte von einer Vielzahl von Viren, von denen einige beim Menschen Infektionen mit letalem Ausgang hervorrufen können. Ein Schweineinfluenzavirus steht beispielsweise unter dem Verdacht Auslöser der Spanischen Grippe zu sein, der in den Jahren 1918 und 1919 in Europa über 50 Millionen Menschen zum Opfer fielen [41]. Viele weitere humanpathogene Viren, wie das Nipah-Virus, das Enzephalitis Virus (JEV), das Vesicular Stomatitis Virus (VSV), das Swine Vesicular Virus (SVDV), das Tollwutvirus, das Vacciniavirus, das Schweinepapovirus (PPV), das Schweinepockenvirus, das porzine Enzephalomyocarditisvirus und das Herpesvirus lassen sich jedoch auch durch keimfreie Züchtung und Haltung, aus den für die Xenotransplantation vorgesehenen Schweinen, eliminieren. Schwieriger gestaltet sich dies beispielsweise für die Schweinecircoviren PCV 1 und 2, die wahrscheinlich transplazentar übertragen werden können [42]. Zusätzlich besteht das große Risiko einer Infektion mit unbekannten Erregern, die aufgrund ihrer asymptotischen Merkmale im natürlichen Wirt nicht erkannt werden. Die Folgen einer Seite | 7

1 Einleitung

Infektion mit bis dato unbekannten Viren werden am Beispiel des Ebola- und Marburg-Virus [43] sowie des SARS- und HI-Virus [44] verständlich. Porzine endogene Retroviren (PERVs), die im Genom aller Schweine integriert sind, lassen sich ebenfalls nicht durch Zucht und Haltung unter DPF-Bedingungen eliminieren und stellen somit eine zusätzliche Gefahr der Transspeziesübertragung vom Schwein auf den Menschen bei der Xenotransplantation dar [45].

1.2 Retroviren

Viren sind genetische Elemente, die sich unabhängig von den Chromosomen einer Zelle replizieren können, aber nicht unabhängig von Zellen selbst. Die Klasse der Retroviren (lat. retro: rückwärts) verdankt ihren Namen aufgrund der Tatsache, dass diese eine Art umgekehrte Nukleinsäurereplikation haben. Dabei wird ihre RNA mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in ein DNA-Zwischenprodukt umgeschrieben und in das Wirtsgenom integriert.

Vor fast 100 Jahren wurden Retroviren zum ersten Mal beschrieben. 1908 konnten die dänischen Pathologen Ellermann und Bang zeigen, dass die Leukämie einer Maus durch Ultrafiltrate auf andere Mäuse übertragbar war. Drei Jahre später gelang es dem Pathologen Rous bei gesunden Hühnern mit dem Ultrafiltrat aus Geflügelsarkomen, Tumore zu induzieren [46]. Einen weiteren Hinweis auf das pathogene Potential der Retroviren und ihre Assoziation mit Tumorerkrankungen wurde 1936 von John J. Bittner mit seinen Untersuchungen zur Entstehung von malignen Milchdrüsenerkrankungen der Maus, verursacht durch das mouse mammary tumor virus (MMTV), erbracht. So fand er heraus, dass MMTV nicht nur konventionell durch exogene Partikel übertragen werden konnte (horizontale Transmission), sondern auch als endogener Bestandteil von Zellen der Keimbahn an nachfolgende Generationen (vertikale Transmission). Die ersten und bis jetzt einzigen humanpathogenen Retroviren wurden Anfang der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts entdeckt. Dazu zählen die humanen T-Zell-Leukämie-Viren (HTLV-I und HTLV-II) sowie die humanen Immundefizienzviren (HIV-I und HIV-II) [47-49]. Retrovirus-induzierte Erkrankungen sind mit einer Vielzahl unterschiedlicher Symptome assoziiert, wobei Immundefizienzen, Tumore (Lymphome, Sarkome) und neurologische Defekte am häufigsten auftreten. Die Ursachen der Krankheitsbilder sind vielschichtig und vom Genus der Viren abhängig. Heute gehören die Retroviren zu den intensivsten beforschten Erregern in der Virologie und sind von großer Bedeutung für die Gesundheitswissenschaften.

Seite | 8