Nachdem eine deutliche Schaumbildung eingetreten war, wurden einige Tropfen Octanol zugesetzt, um den Schaum aufzulösen. Anschließend wurde auch hier die Glimmspanprobe durchgeführt. 3. Ergebnisse

Sowohl beim ersten als auch beim zweiten Teilversuch ist die Glimmspanprobe positiv ausgefallen, d.h. bei beiden Reaktionen konnte Sauerstoff nachgewiesen werden. 4. Diskussion

Da bei beiden Reaktionen Sauerstoff entstanden ist, muss das Wasserstoffperoxid zersetzt worden sein. Wasserstoffperoxid ist bei Zimmertemperatur metastabil, d.h. seine Zerfallsgeschwindigkeit ist sehr gering. Deshalb kann es nur durch Erhitzen oder mithilfe eines Katalysators zersetzt werden. Da in unserem Versuch die Temperatur stabil war, muss die Reaktion im ersten Teilversuch durch den Katalysator Mangan(IV)-oxid und im zweiten Teilversuch durch das Enzym Katalase, das in Kartoffeln vorhanden ist, gemäß der Gleichung 2 H2O2 → 2 H2O + O2 zersetzt worden sein. Der Versuch zeigt, dass Wasserstoffperoxid sowohl von einem anorganischen Katalysator (Mangan(IV)-oxid) als auch von einem Biokatalysator (Katalase) abgebaut werden kann. V 3b Phenoloxidasen

1. Einleitung

In diesem Versuch soll die Funktion der Phenoloxidasen unter verschiedenen Gesichtspunkten untersucht werden. Phenoloxidasen sind meistens in den Plastiden lokalisiert, während ihr Substrat in den Vakuolen vorliegt. Wird die Zelle nun so verletzt, dass Vakuolen und Plastiden beschädigt werden, so kommen Phenoloxidase und ihr Substrat zusammen. Die Phenoloxidase oxidiert dabei je nach Typ unterschiedliche Phenole in die entsprechenden, teils farbigen, Chinone. Diese Chinone wirken vermutlich funghi- und bakterizid. Die Dunkelfärbung von verletzten Pflanzenteilen beruht auf einer nicht-enzymatischen Weiterreaktion der Chinone in Melanine.

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Phenoloxidasen sind relativ unspezifisch. In ihrem aktiven Zentrum befindet sich 2wertiges Kupfer und sie sind mit den Hämocyanen verwandt. In dieser Versuchsreihe sollte die Phenoloxidase der Kartoffelknolle im ersten Versuch gehemmt werden. In den folgenden Versuchen wurden noch Denaturierungserscheinungen durch Hitze und niedrigen pH-Wert untersucht. Als Substrat wurde hierbei DOPA verwendet, die Hemmung geschah mit Natriumdiethyldithiocarbaminat. 2.1 Nachweis und Hemmung der Phenoloxidasen in vitro 1. Material und Methode

Als erstes wurden 25ml einer Lösung hergestellt, die 10 ^-2 mol/l DOPA in Phosphatpuffer (pH 7,5) enthielt.

Diese wurde zu je 5ml auf 3 Reagenzgläser aufgeteilt. Danach wurde in Reagenzglas b) 1ml des Enzymhemmer Natriumdiethyldithiocarbaminat-Lösung gegeben. Dann wurden in Reagenzglas a) und b) ein Kartoffelextrakt (50g geschälte Kartoffel mit Phospatpuffer gemixt und filtriert) hinzugegeben. Reagenzglas 3 verblieb als Kontrollprobe ohne Zusatz. 2. Ergebnisse

Reagenzglas a): Die Lösung verfärbte sich zunächst komplett dunkel. Nachdem sie über einige Stunden gestanden hatte, entfärbte sie sich weitgehend und eine dunkle Schicht setzte sich an der Oberfläche ab. Durch Schütteln konnte diese Schicht wieder aufgelöst werden, so dass die Lösung wieder dunkel wurde. Reagenzglas b): Die Lösung wurde durch Zugabe des Extraktes leicht milchig, verfärbte sich jedoch nicht wie Reagenzglas a). Die Farbe änderte sich über die gesamte Versuchsdauer nicht und behielt die gleiche Farbe wie Reagenzglas c). Reagenzglas c): DOPA Kontrolllösung; Es war keine Verfärbung zu beobachten. 3. Diskussion

Die Verfärbung in Reagenzglas a) deutet die Anwesenheit von Phenoloxidasen an, die das DOPA (ein Diphenol) zunächst in das dazugehörige Chinon umgewandelt hat:

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O H

2

O H

DOPA (3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin)

2-Amino-3-(3,4-benzochinon)propansäure

Dieses Chinon kann nicht-enzymatisch mit dem Luftsauerstoff zu braunschwarzem Melanin weiterreagieren, was wir in diesem Versuch beobachten. Damit erklärt sich auch, warum die dunkle Schicht an der Oberfläche auftritt, denn hier ist der meiste Luftsauerstoff verfügbar. 2.2 Verfärbung des Extraktes beim Stehenlassen 1. Material und Methode

In diesem Versuchsteil wurde je ein Teil (5ml) des Kartoffelextraktes aus Versuchsteil 1 in Reagenzglas d) und der andere in ein flaches Schälchen gefüllt und über die Kurszeit hinweg beobachtet. 2. Ergebnisse

Die Lösung ist zunächst gelblich und trüb, wird aber direkt beim Hantieren innerhalb von Minuten dunkler. Die Lösung im Reagenzglas wurde innerhalb einer Stunde sehr dunkel, nach zwei Stunden (vgl. Abb. 1) ist die Lösung größtenteils gelblich trüb und an der Oberfläche hat sich ähnlich wie in Versuchsteil 2.1 eine dunkle Schicht gebildet.

In dem großflächigen Schälchen ist die Lösung bereits seit dem Eingießen durchgehend dunkel (Abb. 2). Es lässt sich keine Phasenbildung beobachten. 3. Diskussion

Die dunkle Farbe wird durch die im Kartoffelextrakt enthaltenen Phenoloxidasen verursacht, die diverse Phenole in Chinone umsetzen, die wiederum selbstständig zu den farblich dunklen Melaninen weiter reagieren. Durch das Mixen wurden die Zellen und ihre Organellen stark verletzt, so dass aus den Vakuolen die phenolischen Verbindungen austreten konnten, die mit den aus den zerstörten Plastiden austretenden Phenoloxidasen in Wechselwirkung treten. Die Umsatzprodukte sind die schon erwähnten teils farbigen Chinone bzw. die aus ihnen hervorgehenden farblichen Melanine, die wir beobachten. Da für diese Reaktionen molekularer

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Sauerstoff nötig ist, treten diese Reaktionen hauptsächlich an Stellen auf, die mit molekularem Sauerstoff in Kontakt kommen. Daher verfärbt sich in dem Reagenzglas hauptsächlich die Oberfläche dunkel während in der Schale die Flüssigkeit mit einer größeren Oberfläche in Kontakt mit dem molekularen Luftsauerstoff tritt. Eine vergleichbare Reaktion lässt sich z.B. bei einem angebissenen, dunkel anlaufenden Apfel beobachten. 2.3 Hitzeempfindlichkeit der Enzyme 1. Material und Methode

Von dem bereits für die vorigen Versuchsteile hergestellten Kartoffelextrakt wurden etwa 2ml in Reagenzglas e) fünf mal aufgekocht. Von diesem aufgekochten Extrakt wurden 0,1ml mit 5ml DOPA Lösung gemischt. 2. Ergebnisse

Die Lösung wurde komplett dunkelgrau und war weitgehend klar. Allerdings ließ sich keine dunkle Schicht an der Oberfläche beobachten, wie sie bei den anderen Versuchsteilen beobachtbar war. 3. Diskussion

Durch das Erhitzen werden Proteine denaturiert, da die Moleküle durch die Energiezufuhr derart ins Schwingen geraten, dass sich einige Bindungen wie Wasserstoffbrückenbindungen, Disulfidbindungen und hydrophobe Effekte lösen, was zu einer Konformationsänderung führt und somit die Funktion der Enzyme stört. Dabei werden häufig die im Inneren des Proteins gelegenen Abschnitte nach außen gekehrt. Die Proteine sind nicht mehr löslich und fallen aus. Kovalente Bindungen werden hierbei nicht getrennt und die Primärstruktur bleibt erhalten. Hitzedenaturierungen sind oft reversibel, wobei hier die Einwirkzeit und die Höhe der Temperatur entscheidend und für die einzelnen Enzyme unterschiedlich sind. Nach den Versuchsergebnissen zu urteilen wurde in der Lösung das DOPA umgesetzt. Nach der Denaturierung durch Hitze sollte man eigentlich vermuten, dass die Phenoloxidase nicht mehr aktiv ist. Es ergeben sich daher 3 Möglichkeiten: 1. Die Phenoloxidase wurde nicht lang genug erhitzt und ist daher nicht vollständig denaturiert und war noch funktionsfähig.

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2. Die Denaturierung war reversibel und nach dem Abkühlen kehrte sie von dem denaturierten Zustand in die funktionsfähige Form zurück, sodass DOPA umgesetzt werden konnte.

3. In der Extraktlösung herrschen Bedingungen, die DOPA reagieren lassen, wobei Enzyme keine größere Rolle spielen.

Punkt 3. Würde allerdings mit Versuchsteil 1 kollidieren, wenn man dort davon ausging, dass die Enzyme durch Natriumdiethyldithiocarbaminat gehemmt werden, was sich in dem Versuch auch demonstrieren ließ.

Um dies zu klären, müsste man das Erhitzen verstärken oder verlängern. Wenn der Versuch dann immer noch eine Verfärbung zeigen würde, könnte man davon ausgehen, dass die Phenoloxidasen wirklich durch Hitze reversibel denaturierbar sind. Wir können aus diesen Beobachtungen immerhin schließen, dass die Phenoloxidasen ziemlich hitzestabil sind und sich mit Hitze kaum oder zumindest reversibel denaturieren lassen. 2.4 Enzymdenaturierung durch Säure 1. Material und Methode

1ml Kartoffelextrakt wurde in Reagenzglas f) mit 1ml 100%iger Essigsäure zusammengegeben. 2. Ergebnisse

Die Lösung wurde milchig weiß und trüb. Nach dem sie einige Minuten stand, wurde sie nach unten hin trüber. Am Ende des Kurstages hatten sich zwei Phasen gebildet. Die eine bestand aus einem milchig weißen flockigen Niederschlag, darüber setzte sich eine farblose, klare Phase ab. 3. Diskussion

Durch das Einwirken der Säure wurden die im Extrakt enthaltenen Proteine denaturiert, koagulierten und fielen als flockiger Niederschlag aus. Die Säure bzw. die von ihr freigesetzten H ⁺ -Ionen sorgen für eine Ladungsverschiebung, vor allem an den Aminogruppen, was dazu führt, dass innen liegende Abschnitte im Protein nach außen gekehrt werden können, was schlussendlich zum Ausfällen des Proteins führt.

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