Zusammenfassung

Der Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 ist ein gram-negatives, methylotrophes Bakterium, welches ubiquitär verbreitet ist und nach wie vor großes Forschungspotential bietet, da viele Stoffwechselwege und die daran beteiligten Enzyme bis jetzt nicht vollständig aufgeklärt worden sind. Neben einer bereits bekannten NAD ⁺ -unabhängigen, hochspezifischen Formaldehyd-Dehydrogenase besitzt es zudem eine Methylamin-Dehydrogenase. Dehydrogenasen katalysieren zahlreiche Reaktionen und sind auch in der Technik vielseitig einsetzbar, wie beispielsweise in elektrochemischen Biosensoren, die aufgrund ihrer umweltschonenden Arbeitsweise zunehmend an Aufmerksamkeit gewinnen. Die Methylamin-Dehydrogenase, welche für den Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 beschrieben wurde, ist ein lösliches Quinoprotein, das die Umwandlung von Methylamin zu Formaldehyd katalysiert. Es setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen und besitzt den chinoiden Co-Faktor TTQ (Tryptohan Tryptophylquinon). Möglicherweise handelt es sich bei dem Enzym um eine der seltenen α, β-Methylamin-Dehydrogenasen. Wie alle Enzyme katalysiert auch die Methylamin-Dehydrogenase bei umkehrbaren Reaktionen die Gegenreaktion, in diesem Fall die Reduktion von Formaldehyd zu Methylamin. Dies macht sie zu einem potentiellen Kandidaten als Katalysator in einem Biosensor. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Teil der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 kloniert um dadurch einen Ansatzpunkt für weiterreichende Aufklärungen der vollständigen Sequenz und somit auch regulatorischer Elemente für eine Expression zu schaffen. Für die Klonierung wurden drei verschiedene Primer-Paare, welche aus der N-Sequenzierung der bereits isolierten kleinen Einheit der Methylamin-Dehydrogenase M58001 aus dem Organismus Thiobacillus versutus hervorgegangen sind, bei unterschiedlichen Temperaturen mit einem Matrizenstrang hybridisiert. Dabei erhielten die PCR-Produkte einen Adenosin-Überhang und konnten anschließend in einen Vektor, welcher komplementäre Thymidin-Überhänge aufwies, ligiert und in kompetente E.coli Zellen transformiert werden. Nach der Isolierung und anschließenden Sequenzierung der erhaltenen Plasmid-DNA war es möglich eine 64 Aminosäuren umfassende Sequenz zu erhalten, welche eine Homologie von 93 % zu der Sequenz bereits isolierter und kristallisierter Untereinheiten der Methylamin-Dehydrogenase zeigt. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass es sich bei dem Enzym mit hoher Wahrscheinlichkeit um eine kleine Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase handelt.

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Summary

The organism Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 is a gram-negative, methylotrophe bacterium which is spread ubiquitary and still contains lots of potential for research because many ways of metabolism and participating enzymes are not explained completely. Beside a common NAD ⁺ -independent highly specified formaldehyde dehydrogenase it also owns a methylamine dehydrogenase. Dehydrogenases catalyse numerous reactions and are useful in many ways, electrochemical biosensors for example which gain growing attention because of their environmentally friendly functionings. The methylamine dehydrogenase which was described for the organism Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 is a soluble quinoprotein that changes methylamine to formaldehyde through catalyses. It consists of 2 subunits and contains the chinoide cofaktor TTQ (tryptophan tryptophylquinone). Maybe the enzyme is one of the rare α,β-methylamine dehydrogenases. Like all enzymes methylamine dehydrogenases catalyse the reverse reaction during reversible reactions - in this case the reduction from formaldehyde to methylamine. This makes her a potential candidate for a catalyst in a biosensor. Within this work one part of the small subunit of methylamine dehydrogenase of Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 was cloned in order to produce a starting point for further education on the complete sequence and therefore also find out regulatory elements for an expression. For cloning 3 different primerpairs, which came from the N-sequencing of the already isolated small unit of methylamine dehydrogenase M58001 from the organism Thiobacillus versutus, were hybridised with a template at different temperatures. At the same time the PCR-products got an adenosine overhang and could be ligated into a vector which showed complementary thymidine overhangs and were also transferred into competent E.coli cells. After isolation and the following sequencing of the received plasmid-DNA it was possible to get a sequence of 64 aminoacids which showed up a homology of 93 % of the sequence of already isolated and crystallized subunits of methylamine dehydrogenases. Therefore this work was able to show that the enzyme is with a high possibility one subunit of methylamine dehydrogenase.

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis   

Zusammenfassung   II

Summary   III

Inhaltsverzeichnis   IV

Abbildungsverzeichnis   VI

Tabellenverzeichnis VII   

Abk  ürzungsverzeichnis.  VIII

1.  Einleitung  1

1.1.  Hyphomicrobium zavarzinii ZV580.  1

1.2.  Dehydrogenasen.  2

1.2.1.  Methylamin-Dehydrogenase.  4

1.2.2.  Anwendung.  6

1.3.  Zielsetzung.  6

2.  Material und Methoden.  7

2.1.  Materialien.  7

2.1.1.  Geräte  7

2.1.2.  Chemikalien  8

2.1.3.  Puffer und Lösungen  8

2.1.4.  Medien  9

2.1.5.  Verbrauchsmaterialien.  10

2.1.5.1.  Nukleinsäuren.  10

2.1.5.2.  Enzyme  11

2.1.5.3.  Kits.  11

2.1.5.4.  Einmalartikel  12

2.1.5.5.  Bakterienstämme  12

2.2.  Methoden.  13

2.2.1.  Mikrobiologische Methoden.  13

2.2.1.1.  Kultivierung von Escherichia coli.  13

2.2.1.2.  Cryokonservierung  13

2.2.1.3.  Herstellung chemisch kompetenter E.coli JM109.  13

2.2.1.4.  Kompetenztest der chemisch kompetenten E.coli JM109  14

2.2.2.  Molekularbiologische Methoden  15

Inhaltsverzeichnis

2.2.2.1.  Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)  15

2.2.2.2.  Aufreinigung der DNA-Fragmente  15

2.2.2.3.  Konzentrationsbestimmung der DNA  16

2.2.2.4.  Ligation.  16

2.2.2.5.  Transformation  17

2.2.2.6.  Blau-Weiß-Selektion  17

2.2.2.7.  Plasmidpräparation  18

2.2.2.8.  Restriktionsverdau  19

2.2.2.9.  Agarose-Gelelektrophorese.  19

2.2.2.10.  Sequenzierung  19

3.  Ergebnisse  20

3.1.  Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und Bestimmung der Größe der PCR-Produkte  

mittels  Agarose-Gel  21

3.2.  Konzentrationsbestimmung der DNA.  25

3.3.  Ligation und Transformation.  26

3.4.  Blau-Weiß-Screening der transformierten Klone  28

3.5.  Plasmidpräparation und Restriktionsverdau.  28

3.6.  Sequenzanalyse  31

4.  Diskussion  34

5.  Literatur.  36

6.  Anhang  38

Abbildungsverzeichnis   

Abbildungsverzeichnis   

Abbildung  1: Lichtmikroskopische Aufnahme von Hyphomicrobium zavarzinii ZV580  

Abbildung  2: Co-Faktor TTQ der Methylamin-Dehydrogenase 13  

Abbildung  3: Mechanismus der Teil-Reaktion I B: Base.  

Abbildung  4: Primer-Anordnung  

Abbildung  5: Gel-Analyse der PCR-Produkte aus Ansatz A  

Abbildung  6: Gel-Analyse der PCR-Produkte aus Ansatz B.  

Abbildung  7: Gel-Analyse der PCR-Produkte aus Ansatz C.  

Abbildung  8: Gel-Analyse zur Konzentration der aufgereinigten PCR-Produkte.  

Abbildung  9: Gel-Analyse zur Kontrolle des Restriktionsverdaus I.  

Abbildung  10: Gel-Analyse zur Kontrolle des Restriktionsverdaus II.  

Abbildung  11: Nukleotidsequenz und Restriktionsenzyme von Fragment 1/9.  

Abbildung  12: Vergleich der Aminosäuresequenzen.  

Abbildung  13: Primer für RACE-PCR.  

Abbildung  14: pGEM -T Vektorkarte  

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Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Systematische Einordnung von Hyphomicrobium ................................................. 1 Tabelle 2: Konzentration und Reinheit der verwendeten genomischen DNA........................ 10

Tabelle 3: Primer ................................................................................................................. 11 Tabelle 4: PCR-Ansätze mit den jeweils verwendeten Primern und eingesetzter genomischer

DNA ................................................................................................................... 21 Tabelle 5: Berechnete Insert-Menge für den Ligationsansatz ............................................... 27 Tabelle 6: Transformationseffizienz..................................................................................... 27 Tabelle 7: Anzahl der positiven und negativen Klone nach der Transformation ................... 28 Tabelle 8: Gewünschte Insert-Größe.................................................................................... 29 Tabelle 9: Berechnung der Konzentration der Plasmid-DNA ............................................... 31

VII

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare cfu colony forming unit DNA Desoxyribonukleinsäure ds DNA double stranded Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli EDTA N, N, N’, N’-Ethylendiamintetraacetat GD genomische DNA IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosid NADP Nicotinamidadenindinukleotidphosphat OD Optische Dichte PCR Polymerase-Ketten-Reaktion rpm rounds per minute SDS Natriumdodecylsulfat TTQ Tryptohan Tryptophylquinon X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

VIII

1. Einleitung

Abbildung 1: Lichtmikroskopische Aufnahme von Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 Dargestellt sind Schwärmerzellen zu verschiedenen Zeiten während der Rosettenbildung [2].

Als methylotrophes Bakterium ist Hyphomicrobium in der Lage C 1 -Verbindungen wie Methan, Methanol, Methylamin und Formiat zu verwerten. Ihm fehlt das Enzym Pyruvat-Dehydrogenase. Daher ist es nicht fähig Pyruvat in Acetyl-CoA umzuwandeln und somit die Energie aus Kohlenstoffverbindungen mit 3 oder mehr Kohlenstoffatomen zu nutzen [3]. In neueren Untersuchungen [4] stellte man fest, dass Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 beim Wachstum auf Methylamin als Kohlenstoffquelle neben der bereits bekannten NAD ⁺ -unabhängigen, hochspezifischen Formaldehyd-Dehydrogenase auch eine Methylamin-Dehydrogenase aufweist, welche die Umwandlung von Methylamin zu Formaldehyd katalysiert.

Hyphomikrobien kommt eine besondere Bedeutung bei der Aufreinigung von Trinkwasser zu, da sie in der Lage sind Nitrate aus diesem zu entfernen [5]. Des Weiteren werden einige spezielle Hyphomicrobium-Stämme in Biosensoren für die Detektion von Methanol, Methylsulfaten und Trimethylaminen eingesetzt [6].

1.2. Dehydrogenasen

Enzyme sind natürliche Katalysatoren biologischer Systeme. Sie ermöglichen Reaktionsabläufe bei niedrigen Temperaturen und beschleunigen diese ohne dabei selbst verbraucht zu werden. Dabei beruht das Wirkungsprinzip nicht auf der Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes sondern lediglich auf der Herabsenkung der Aktivierungsenergie.

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1. Einleitung

Oftmals kann dieser Effekt durch die Ausbildung eines entatischen Zustandes im Enzym-Substrat-Komplex erklärt werden. Enzyme haben wichtige Funktionen im Stoffwechsel aller lebenden Organismen und führen dazu, dass viele Reaktionen überhaupt erst in einem biologisch sinnvollen Ausmaß ablaufen können. Sie sind im Bezug auf die katalysierte Reaktion und die Wahl des Reaktionsteilnehmers, dem Substrat, hochspezifisch. Je nach der von ihnen katalysierten Reaktion werden sie in verschiedene Klassen eingeteilt [7]. Transferasen übertragen funktionelle Gruppen von einem Substrat auf ein anderes. Hydrolasen hingegen spalten Bindungen unter Aufwendung von Wasser. Die Lyasen bilden die vierte Gruppe der Enzymklassen. Sie katalysieren die Spaltung oder Synthese komplexer Produkte und bilden Doppelbindungen durch Hinzufügen oder Entfernen von Gruppen. Isomerasen beschleunigen intramolekulare Gruppenübertragungen und Ligasen katalysieren die Verbindung zweier Substrate unter ATP-Hydrolyse. Die sechste und letzte Gruppe der Enzymhauptklassen bilden die Oxidoreduktasen. Sie katalysieren Redoxreaktionen [8] und werden wiederum eingeteilt in Monooxygenasen, Dioxygenasen, Oxydasen, Reduktasen, Peroxygenasen und die Dehydrogenasen. Die Gruppe der Dehydrogenasen soll etwas näher betrachtet werden. Allgemein kann man Dehydrogenasen in solche unterteilen, die für die Oxidation von Enzymsubstraten NAD(P)H als Elektronenakzeptor benötigen [9] und solche, die unabhängig von derartigen Co-Faktoren sind [10]. Bei den Pyridinnukleotid-abhängigen Dehydrogenasen werden zwei Elektronen und ein Proton in Form eines Hybrid-Ions (H ^- ) auf das C-4 Atom von NAD ⁺ bzw. NADP ⁺ übertragen, welches daraufhin in seine reduzierte Form übergeht. Diese sind essentiell für zahlreiche Abbauprozesse (NAD ⁺ ) sowie Biosynthesen (NADP ⁺ ). Einen weiteren Co-Faktor stellen die Flavine dar. Sie können 2 e ^- - und 1 e ^- - Redoxreaktionen katalysieren und dadurch mit O 2 reagieren. Zu den NAD(P)H-unabhängigen Dehydrogenasen zählen die so genannten farbgebundenen Dehydrogenasen. Aus dem Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 konnte eine Formaldehyd-Dehydrogenase isoliert werden, welche die Bildung von Formaldehyd ohne Anwesenheit von NAD(P)H katalysiert [11, 23]. Das als Tetramer beschriebene Enzym besitzt einen kovalent gebundenen Quinon-Co-Faktor, welcher bisher nicht genau definiert wurde. Jedoch weiß man bereits, dass er zu den B-Vitaminen gezählt werden kann. Oft handelt es sich bei den Dehydrogenasen um so genannte Metalloenzyme [12]. Diese Enzyme koordinieren durch spezifische Aminosäurereste Metallionen, die für den Reaktionsablauf essentiell sind. Ein Beispiel für ein Metalloenzym ist die Alkohol-Dehydrogenase, welche zwei Zinkionen pro Untereinheit besitzt. Von den zahlreichen Dehydrogenasen soll nun die Methylamin-Dehydrogenase genauer betrachtet werden.

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