1 Vorwort

Es war für mich von Anfang an klar, dass ich meine Maturitätsarbeit im Fach Biologie machen würde, da ich später auch etwas Naturwissenschaftliches studieren möchte. Aus diesem Grund habe ich Frau Spielmann, meine Biologie-Lehrerin, früh darauf angesprochen. Meine erste Idee war es, etwas mit dem Nährstoffgehalt von Nahrungsmitteln zu machen. Aber wenige Zeit später verwarf ich diese Idee. Doch schon bald kam uns die Idee vom biologischen Abbau durch Bakterien. Und nachdem der Vorschlag gekommen war, Bakterien aus der Umgebung speziell auf dem Öl-Abbau zu untersuchen, habe ich beschlossen in diesem Bereich etwas zu machen. Da das Thema die Möglichkeit für viel praktische Arbeit im Labor gab, und die meisten dazu benötigten Mittel an der KZU zur Verfügung standen, wurde das Vorgehen bald konkretisiert. Ich war mir unter anderem bewusst, dass die Arbeit nicht einfach sein würde und viel Geduld beanspruchen würde. Jedoch war es für mich auch wichtig viel dazuzulernen und wertvolle Erfahrungen zu sammeln. Nicht nur das Resultat der Arbeit sollte im Vordergrund stehen sondern auch der Weg dorthin.

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2 Einleitung

In dieser Arbeit wurden Bakterien, die aus einem mit Heizöl verseuchten Boden isoliert wurden, auf ihre Abbaufähigkeit von Heizöl und Stärke untersucht. Das Ziel ist es ölabbauende Bakterien zu finden, die sich schnell vermehren können und Heizöl in grossen Mengen abbauen. Solche spezielle Bakterien könnten zur Beseitigung von Erdöl und Erdöl-Produkten bei Katastrophen beispielsweise in Gewässern zum Einsatz kommen. Insgesamt kann die Arbeit in drei Teile gegliedert werden. Im ersten und grössten Teil geht es darum zu untersuchen, ob die Bakterien Heizöl als Kohlenstoffquelle verwerten können und wenn ja, in welcher Menge sie es abbauen. Im mittleren Teil werden Bakterien aus einem mit Heizöl verseuchten und normalen Boden hinsichtlich des Heizöl-Abbaus miteinander verglichen. Im letzten Teil wird untersucht, welche von den Kohlenstoffquellen Heizöl und Stärke die Bakterien bevorzugen, wenn beide zur Verfügung stehen.

2.1 Die verschiedenen Teile der Arbeit

2.1.1 Der Heizöl-Abbau

In diesem Teil wurden zunächst durch verschiedene Kulturtechniken Bakterien aus einem seit über 20 Jahren mit Heizöl verseuchten Boden isoliert und zum Wachstum gebracht. Danach wurden die Bakterien hinsichtlich des Öl-Abbaus untersucht. Zur Messung einer Öl-Abnahme in den Kulturen wird das UV-Spektrometer benutzt und die Technik „Greasy-Spot-Test“ angewendet. Dabei soll folgende Hypothese verifiziert oder falsifiziert werden:

2.1.2 Bakterien aus ölverseuchtem und normalem Boden im Vergleich

Hier werden Bakterien aus einem normalen und einem ölverseuchten Boden isoliert. Danach wird beiden Bakterienarten nur Heizöl als Kohlenstoffquelle zur Verfügung stehen. Es soll zunächst qualitativ untersucht werden, ob Bakterien aus einem normalen Boden Heizöl verwerten können. Anschliessend erfolgt auch eine quantitative Untersuchung durch den sogenannten Stempelversuch. Meine Hypothese lautet:

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2.1.3 Kulturen mit Heizöl und Stärke

In diesem letzten Teil wird untersucht werden, ob Bakterien, die aus einem ölverseuchten Boden stammen, Heizöl oder Stärke als Kohlenstoffquelle abbauen. Sollte es Bakterien geben, die Heizöl bevorzugen, würde das bedeuten, dass sie hochspezialisiert sind und sich für einen Einsatz bei Öl-Katastrophen am besten eignen würden. Die Stärkemessung wird durch das UV-Spektrometer erfolgen. Meine Hypothese lautet:

2.2 Theoretische Grundlagen

2.2.1 Bakterien

2.2.1.1 Aussehen und Aufbau

Bakterien sind sehr kleine Lebewesen, die aus nur einer Zelle bestehen. Da ihre Grösse nur wenige Mikrometer beträgt (Abb. 1), sind sie nur mit Hilfe eines Mikroskops sichtbar. [1]

Es existieren sehr viele verschiedene Bakterienarten, wobei sich unter dem Mikroskop drei Grundformen unterscheiden lassen:

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Bakterien sind Prokaryoten, das bedeutet, ihre Erbsubstanz, die DNS (Desoxyribonukleinsäure), befindet sich nicht in einem Zellkern, der vom Cytoplasma durch eine Doppelmembran abgegrenzt wird, wie bei Eukaryoten. Bei Ihnen liegt die DNS wie bei allen Prokaryoten frei im Cytoplasma, als ringförmiger verknäuelter Molekülfaden (Nucleoid). Bei allen Bakterien sind immer Zellwand, Cytoplasma, Cytoplasmamembran, Nucleoid sowie Ribosomen vorhanden (Abb. 3). Andere Organellen sind je nach Art des Bakteriums verschieden. [1]

2.2.1.2 Vermehrung

Bakterien vermehren sich ungeschlechtlich durch Zellteilug. Das kann durch Querteilung (Abb. 4), durch Knospung, durch Sporenbildung oder auf andere Weise erfolgen. Alle Nachkommen weisen die identische Erbinformation auf und bilden daher einen Klon. Sind die Lebensbedingungen gut, teilen sie sich sehr schnell. So verdoppelt sich beispielsweise das Darmbakterium

Escherichia coli in einem geeigneten Nährmedium alle 20 Minuten. Bakterien sind nicht wie Viren auf eine Wirtszelle angewiesen. [1]

2.2.1.3 Lebensweise

Lebensweise und Stoffwechsel von Bakterien sind sehr unterschiedlich ausgeprägt. So gibt es Bakterien, die Sauerstoff benötigen (aerobe Bakterien), Bakterien, für die Sauerstoff Gift ist (obligat anaerobe Bakterien), und Bakterien, die tolerant gegenüber Sauerstoff sind (fakultative Anaerobier). Die meisten Bakterien sind chemotroph, das heisst, sie gewinnen Energie durch chemische Stoffumsetzungen. Der Grossteil der Chemotrophen ist heterotroph. Sie haben die Eigenschaft den Kohlenstoff, den sie zum Aufbau ihrer Körperbausteine benötigen, aus bereits vorhandenen organischen Verbindungen zu beziehen.

Die meisten Bakterien leben in der Natur in Form von Biofilmen zusammen. Diese bestehen aus einer dünnen Schleimschicht (Film), in der Mikroorganismen eingebettet sind. Biofilme entstehen, wenn Mikroorganismen sich an Grenzflächen (Fläche zwischen zwei Phasen) ansiedeln. Sie bilden sich überwiegend in wässerigen Systemen, entweder auf der Wasseroberfläche oder auf einer Grenzfläche zu einer festen Phase.

Manche Bakterien bilden bei ungünstigen und extremen Lebensbedingungen Dauerstadien, so genannte Sporen aus (Abb. 5). In einem solchen Zustand können die Bakterien für sie ungünstige Umweltbedingungen überstehen und mehrere Jahre überdauern. Denn die Sporen sind in diesem inaktiven Zustand ausserordentlich widerstandsfähig und haben praktisch keinen Stoffwechsel. Kommen sie wieder in ein günstiges Umfeld, werden sie wieder aktiv und vermehren sich. [2]

Allerdings existieren auch Bakterien, die ihre Strategie geändert und ihren Stoffwechsel an extreme Umweltbedingungen angepasst haben.

2.2.1.4 Bakterien als Destruenten

Bakterien gehören wie z.B. Würmer und Pilze zu den Destruenten, oder auch Reduzenten genannt. Diese lebenden Organismen schliessen die Nahrungskette zu einem Stoffkreislauf, denn sie zersetzen die organischen Stoffe, die vorher von den autotrophen (sich selbst ernährend) Produzenten erzeugt und von den heterotrophen (sich von anderen ernährend) Konsumenten umge-wandelt wurden, wieder in anorganische Stoffe. Um die tote Biomasse oxidativ abzubauen, verbrauchen sie den von den Pflanzen bei der Photosynthese produzierten Sauerstoff und geben Kohlendioxid an die Atmosphäre ab. In jedem beliebigen Ökosystem kommen Bakterien vor, denn sie sind für dessen Gleichgewicht von ungeheurer Bedeutung.

2.2.1.5 Noch unbekannte Bakterien

Obwohl die erste Beschreibung von Bakterien über dreihundert Jahre zurückliegt und bisher unzählige Arten schon beschrieben und katalogisiert wurden, nimmt man heute an, dass die grosse Mehrheit, circa 95 bis 99%, aller auf der Erde existierenden Bakterienarten noch nicht näher bekannt ist. Aus diesem Grund ist es nicht ungewöhnlich, dass immer wieder neue und aufregende Entdeckungen gemacht werden.

2.2.2 Kultivierung

Bei der Kultivierung im biologischen Sinne geht es darum, Bedingungen zu schaffen, die einem bestimmten Organismus ein optimales Wachstum gewährleisten. Ein typisches Beispiel dafür ist die Kultivierung von Bakterien in verschiedenen Nährmedien. Die Grundzusammensetzung eines solchen Nährmediums besteht meistens aus einem Hauptanteil Wasser und einer für den jeweiligen Organismus verwertbaren Energiequelle, wie organische Stoffe oder Schwefel. Im Nährmedium müssen auch von Bakterien benötigte Nährstoffe vorhanden sein. Dies können beispielsweise organische oder anorganische Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phosphatquellen sowie andere essentielle Nährstoffe sein. Um ein Nährmedium herzustellen werden die Nähr- und Zusatzstoffe entsprechend einer Rezeptur zusammengegeben und in destilliertem Wasser gelöst. Anschliessend wird das Ganze sterilisiert. Verwendet wird dafür meistens ein Autoklav, ein gasdicht verschliessbarer Druckbehälter, der für die thermische Behandlung von Stoffen im Überdruckbereich eingesetzt wird. Thermolabile Substanzen, die durch die Hitzesterilisierung zerstört würden, werden auf kaltem Weg sterilisiert, was meist durch Filtration durch einen Sterilfilter erfolgt. Diese Stoffe werden dem Nährmedium erst nach dessen Hitzebehandlung und Erkalten hinzugegeben. [3]

2.2.3 Kulturtechniken

In der Mikrobiologie sind verschiedene Kulturtechniken bekannt. Zu den Bedeutendsten gehören die Reinkultur, die Anreicherungskultur, die Flüssigkultur und die Kultur auf Gel-Nährböden. [3]

2.2.3.1 Reinkultur

Bei einer Reinkultur geht es darum, dass ein Klon von einem bestimmten Organismus unter Ausschluss jeglicher Individuen von anderen Arten oder Stämmen wächst. Nur diese Art von Kultur erlaubt es, einen Mikroorganismus auf ihre metabolischen und physiologischen Eigenschaften hin zu untersuchen. [3]

2.2.3.2 Anreicherungskultur

Bei einer Anreicherungskultur herrschen für einen bestimmten Mikroorganismus oder einer bestimmten Gruppe von Mikroorganismen günstigere Wachstumsbedingungen als für andere Organismen. Ziel dieser Methode ist es, diese Mikroorganismen selektiv anzureichern, während das

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Wachstum anderer Mikroben verlangsamt oder gehemmt wird. Beispielsweise können gezielt anaerobe Bakterien in Bodenproben angereichert werden, indem man Techniken anwendet, bei denen kein Sauerstoff vorhanden ist. [3]

2.2.3.3 Flüssigkultur

Im Vordergrund steht bei dieser Methode die Kultivierung von Organismen in grossen Mengen. Die Mikroorganismen werden in flüssige Nährmedien kultiviert. Für ein optimales Wachstum und Belüftung werden die Kulturgefässe meist automatisch geschüttelt. Mit dieser Kulturtechnik werden Mikroorganismen oft auf bestimmte Stoffwechselleistungen geprüft. [3]

2.2.3.4 Kultur auf Gel-Nährböden

Gel-Nährböden werden hergestellt, indem man einem Kulturmedium eine gelierende (verfestigende) Substanz hinzugibt, die dem jeweiligen Mikroorganismus nicht als Nahrungsquelle dient. Verwendet wird dafür meist Agar. Die Organismen wachsen und vermehren sich dann auf der Oberfläche oder im Innern des Gels. Der Vorteil eines solchen Mediums besteht darin, dass sich die vermehrenden Mikroorganismen nicht frei im Medium verteilen können, so dass sie auf oder in Gel-Nährböden Kolonien bilden. Die Anzahl dieser Kolonien entspräche somit im Idealfall der ursprünglichen Anzahl von Mikroorganismen. Diese Tatsache wird meist genutzt, um Reinkulturen herzustellen, um kleinere Mengen von Mikroorganismen für Untersuchungen zu gewinnen und um Mikroorganismen zu quantifizieren. Auch haben viele Kolonien ein charakteristisches Aussehen, was zur Identifizierung von Mikroorganismen herangezogen werden kann. [3]

2.2.4 Öl-Abbau

2.2.4.1 Chemische Zusammensetzung von Speiseöl

Speiseöle bestehen aus verschiedenen hydrophoben Fettsäuremolekülen und einem Glycerin als Trägermolekül. Ihr Nährwert wird durch die Fettsäuren (Abb. 6a) bestimmt. Diese dienen dem Körper als Energiespeicher und Energiequelle, denn sie bestehen hauptsächlich aus den Elementen Kohlenstoff und Wasserstoff. Darüber hinaus enthalten Fettsäuren das Element Sauerstoff, welcher entscheidend für deren Verdaulichkeit ist. Durch den Sauerstoff ist auch die chemische Bindung zwischen Fettsäuen und Glycerin möglich (Esterbindung). [4]

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2.2.4.2 Chemische Zusammensetzung von Erdöl und Erdöl-Produkten

Erdöl und daraus gewonnene Produkte wie zum Beispiel Heizöl bestehen grösstenteils (circa 85%) aus Kohlenwasserstoffen. Wie der Name schon sagt, bestehen diese Verbindungen ausschliesslich aus den Elementen Kohlenstoff und Wasserstoff, die auf verschiedene Arten mitein-ander verbunden sind. Für Mensch und Tier sind Kohlenwasserstoffe unverdaulich und oft giftig. Ein häufiges Kombinationsprinzip sieht man in der Abbildung 6bc, wo Kohlenstoffatome zu verschieden langen Ketten miteinander verbunden sind. Die Kohlenstoffatome am Kettenende sind von zwei, die übrigen von drei Wasserstoffatomen umgeben. Die Ähnlichkeit mit den Fettsäuen ist sehr augenfällig. Der einzige Unterschied sind die fehlenden Sauerstoffatome bei den Kohlenwasserstoffen. Werden Kohlenwasserstoffe an der Luft entzündet, verbrennen sie unter starker Hitzeentwicklung. Dies ist der Grund, warum sie als Energieträger verwendet werden. Die Verbrennung kommt durch den Sauerstoff der Luft zustande. Dieser reagiert mit dem Kohlenstoff zu Kohlendioxid und mit dem Wasserstoff zu Wasser. [4]

2.2.4.3 Erdölabbauende Bakterien

Bei Erdöl-abbauenden Bakterien, die bei der Beseitigung von Öl nach Unfällen eine Rolle spielen könnten, handelt es sich um aerobe Organismen. Diese Bakterien verfügen über besondere Enzyme, mit denen sie Kohlenwasserstoffe in Fettsäuren umwandeln. Für Lebewesen wie Mensch, Tier und die meisten Bakterien sind Kohlenwasserstoffe unverdaulich, weil sie diese Enzyme nicht haben. Wie Abbildung 6 zeigt, müssen nur zwei Sauerstoffatome in den Kohlenwasserstoff eingebaut werden, damit eine normal verdauliche Fettsäure entsteht. Genau diese Aufgabe übernehmen die Spezial-Enzyme. Die gebildeten Fettsäuren werden dann durch Zellatmung in den Bakterien verbrannt, genauso wie Mensch und Tier die üblichen Fettsäuren aus ihrer Nahrung veratmen. Auf diese Weise erhalten die Bakterien ihre Energie zum Leben. Öl-abbauende Bakterien können also das, was sonst nur ein Verbrennungsmotor kann, nämlich Kohlenwasserstoffe als Energiequelle nutzen. [4]

3 Material und Methode

3.1 Herstellung des Agar-Mediums

Zunächst ging es darum ein Nährboden herzustellen, auf dem sich die zu untersuchenden Bakterien vermehren bzw. Kolonien bilden können. Dafür wurden folgende Materialien benötigt:

Im ersten Schritt wurde 500ml fünffach konzentrierte Minimallösung (Stocklösung) hergestellt. Hierfür wurde mit Hilfe des Messzylinders 400ml destilliertes Wasser in einen grossen Erlenmeyerkolben gegeben. Danach wurden 32g Na 2 HPO 4 -7H 2 O, 7.5g KH 2 PO 4 , 1.25g NaCl und 2.5g NH 4 Cl hinzugefügt und auf dem Magnetrührer vermischt, bis sich alles gelöst hat. Anschliessend wurde die Lösung mit destilliertem Wasser auf 500ml ergänzt. Als nächstes wurde je 100ml davon auf fünf Schottflaschen verteilt. Die Flaschen, die vorher mit Autoklavierband bei 100ml und 500ml markiert worden waren, wurden so verschlossen, dass Wasserdampf trotzdem entweichen konnte. Dies war für das spätere Autoklavieren wichtig.

Die fünf Schottflaschen wurden danach mit fünf weiteren Schottflaschen, die mit Wasser gefüllt waren, im Autoklav auf einer Heizplatte bei 121°C und 1bar mindestens 20 Minuten lang sterilisiert (Abb. 10 und 11). Dass die Stoffe wirklich steril geworden waren, erkannte man daran, dass sich die Streifen des Autoklavierbandes dunkel gefärbt hatten (Abb. 12).

50ml MgSO 4 und 50ml CaCl 2 , die in Falcon-Tuben gefüllt worden waren, wurden für die weitere Verwendung mit dem Sterilfilter sterilisiert.

3.2 Ausplattieren der Bodenprobe

Nun ging es darum die Bakterien, die man untersuchen wollte, auf die Platten zu bringen. Hierzu wurden folgende Materialien gebraucht: ƒ Falcon-Tube ƒ Waage

ƒ Eppendorfröhrchen (im Autoklav sterilisiert) ƒ 1000μl-Pipette ƒ 100μl-Pipette (Abb. 15) ƒ Pipetten-Spitzen (im Autoklav sterilisiert) ƒ Wasserfester Filzstift ƒ Becherglas für Wasser ƒ Drigalski-Spatel ƒ Glasschale mit Deckel für das Ethanol ƒ Kerze ƒ Zündholzschachtel

ƒ Erde aus einem mit Heizöl verseuchten Boden ƒ Leitungswasser ƒ Ethanol ƒ 4 Agar-Platten mit Heizöl ƒ 4 Agar-Platten mit Glucose

Es sollten Bakterien untersucht werden, die aus einem mit Heizöl verseuchten Boden stammen. Die Bodenprobe wurde bei einer Heizölfirma in Dielsdorf geholt. Der Boden (Abb. 16) kam seit über 20 Jahren mit Heizöl in Kontakt. Das in den Experimenten verwendete Heizöl stammt ebenfalls von dieser Firma ab.

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Es wurden 20g Erde (Abb. 17) und 20 ml Leitungswasser in einer Falcon-Tube zusammengegeben und gut geschüttelt. Wurde das ganze ruhen gelassen, bildete sich unten ein Niederschlag und oben eine trübe Suspension. Nun wurde eine Verdünnungsreihe von dieser Suspension hergestellt. Dazu wurden zunächst vier Eppendorfröhrchen mit „1:1“, „1:10“, „1:100“ und „1:1000“ angeschrieben. Jetzt wurde eine volle 1000μl-Pipette von der Flüssigkeit in das erste Eppendorf- röhrchen(1:1) gegeben. Danach nahm man von diesem Röhrchen 100μl weg, gab sie ins zweite und füllte dieses mit Leitungswasser auf 1000μl auf. Vom zweiten Eppendorfröhrchen nahm man wiederum 100μl und gab sie in das dritte, das danach auf 1000μl gefüllt wurde. Zum Schluss wurde das vierte Röhrchen mit 100μl vom dritten gefüllt und mit Wasser auf 1000μl ergänzt. Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt, sodass man am Ende acht Eppendorfröhrchen mit vier verschiedenen Konzentrationen zur Verfügung hatte.

Im nächsten Schritt wurde je 500μl vom Inhalt der acht Eppendorfröhrchen auf vier Heizöl-Platten und vier Glucose Platten aufgetragen werden. Mit dieser Methode sollten Bakterien selektioniert werden, die sich vom Heizöl bzw. von Glucose ernähren.

3.3 Übertragung der Kolonien auf neue Platten

Da die Kolonien auf der Heizöl-Platte „1:100“ am besten erschienen wurden sie auf vier neue Platten übertragen, davon zwei mit Heizöl und zwei mit Glucose. Mit dieser Methode konnten die verschiedenen Kolonien noch weiter voneinander getrennt werden. Material

ƒ „1:100“-Heizöl-Platte mit Kolonien ƒ 2 frische Agar-Medien mit Heizöl (schon vorher hergestellt) ƒ 2 frische Agar-Medien mit Glucose (schon vorher hergestellt) ƒ Glasschale mit Deckel für das Ethanol (Abb. 19) ƒ Kerze ƒ Impföse

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