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Inhaltsverzeichnis

1  Einleitung  

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2  RNA-Interferenz in der Zelle  

   7

2.1  Die Entdeckung der RNA-Interferenz  7

2.2  Die Rolle der RNA-Interferenz in der Zelle  7

2.3  Mechanismus der RNA-Interferenz  8

2.3.1  Dicer und die Spaltung von dsRNA in siRNAs  8

2.3.2  RISC und PTGS  9

2.3.3  RITS und TGS  10

2.3.4  miRNAs als natürliche Auslöser von RNA-Interferenz  10

2.4  Kriterien für effiziente siRNAs  13

3  Versuch zur Stummschaltung von ROCK-1 in humanen  

Nierenzellen   

   14

3.1  Übersicht über Rho-Kinase 1  14

3.2  Methoden  15

3.3  Ergebnisse  19

3.4  Diskussion der Ergebnisse  21

4  Diskussion des potentiellen Nutzens von siRNA bei der  

Behandlung  von Krankheiten  

   21

4.1  Vorteile von Medikamenten auf siRNA-Basis  21

3

4.2 Probleme und ihre Lösungsansätze bei der Entwicklung von

4.3 Aktueller Stand der Entwicklungen von Medikamenten auf

siRNA-Basis 25

4.4 Die Frage der Sicherheit 25

4.5 Die Zukunft der RNA-Interferenz 26

5 Zusammenfassung 27

6 Schlussgedanken 28

7 Danksagungen 29

8 Literaturverzeichnis 30

9 Anhang 34

9.1 Übersicht über die verwendeten Begriffe 34

9.2 Übersicht über das Praktikum 36

9.3 Erläuterungen der verwendeten Chemikalien 37

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„Zuerst ein paar Anmerkungen. Erstens, die ganze

Geschichte des Gene-Stummschaltens zu erzählen wäre

eine Mammutaufgabe, für die man viele Jahre schreiben

müsste und die Sie nächtelang aufbleiben lassen würde.

Deswegen werde ich die Geschichte mehr als ein bisschen

abkürzen. Zweitens sind wir, wie Sie sehen werden, erst in

der Dämmerung unseres Wissens. Sehen Sie deswegen

das Folgende bitte als vorläufig an, das Beste, was wir bis

hierhin schaffen konnten“

Andrew Z. Fire, Nobelpreisträger für Physiologie und

Medizin 2006 in seiner Rede vor dem Nobelpreiskomitee [1]

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1. Einleitung

Seit der Entdeckung der modernen Genetik war es immer ein Traum der Forscher, bestimmte Gene spezifisch und ohne Nebenwirkungen beeinflussen zu können, ein Traum der nach der Entzifferung des menschlichen Genoms und der Entdeckung der darin vorhandenen Onkogene nichts an Aktualität verloren hat. In der heutigen Zeit, in der viele Erkrankungen wie Krebs, Herz-Kreislauferkrankungen oder Demenz noch immer oft nur unzureichend behandelt werden können, und verschiedene Infektionskrankheiten sogar wieder auf dem Vormarsch sind, ^[2] ist es wichtiger als jemals zuvor komplett neuartige Therapeutika zu finden. Heutige Medikamente wirken in aller Regel, indem sie in den Stoffwechsel oder in Signalsysteme des Körpers eingreifen und damit Vorgänge auf der Ebene der Proteine oder Rezeptoren beeinflussen. ^[3] Damit lässt sich zwar schon eine weite Reihe von Effekten erzielen, aber die grundlegende genetische Steuereinheit der Zelle, die Nukleinsäuren im Zellkern, bleiben weitgehend unangetastet. Dabei ließe sich gerade hier, aufgrund dieser Steuerrolle, die größte Vielfalt an möglichen Effekten erzielen. Eine komplett neue Klasse von Therapeutika könnte sich diese Rolle zu Nutze machen, um ganz neue und effektivere Arten der Krankheitsbekämpfung zu erschließen. Dabei besäßen sie gleichzeitig den Vorteil, dass sie sich mit nur wenigen Modifikationen am grundlegenden System gegen viele verschiedene Krankheiten einsetzen ließen und man nicht für jede Krankheit ein völlig neues Arzneimittel entwickeln müsste. [3]

Als Hoffnungsträger hierfür galt lange die Gentherapie, bei der durch Viren fremde Gene ins Wirtsgenom übertragen werden und dort Krankheiten heilen, indem sie neue Gene einführen oder die Expression von bereits vorhandenen verändern. Aufgrund von vielen Problemen, die von unerwarteten Immunantworten bis hin zur Aktivierung von krebsauslösenden Genen, so genannten Onkogenen, durch unkontrollierte Integration in das Wirtsgenom reichen ^[4] , konnte dieser Therapieansatz allerdings die in ihn gesteckten Erwartungen bisher noch nicht erfüllen. Von daher wird er wohl noch auf absehbare Zeit lediglich Zukunftsmusik bleiben.

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Den Durchbruch erlebt momentan ein anderer Ansatz, für dessen Entdeckung im Jahr 2006 Craig Mellow und Andrew Z. Fire den Nobelpreis erhielten ^[5] , die so genannte RNA-Interferenz mithilfe von „short-interfering-RNAs (siRNAs). Dabei ist es möglich, durch Applikation von kurzer, doppelsträngiger RNA gezielt die aus dem Zellkern kommende messenger RNA (mRNA) in der Zelle zu zerstören. Damit kann die Transkription aus dem Genom zum jeweiligen Protein gezielt unterbrochen, und so Einfluss auf die Konzentration bestimmter Proteine genommen werden. Im Gegensatz zur klassischen Gentherapie bietet dieses Verfahren viele Vorteile. So ist zum Beispiel keine nicht mehr rückgängig machbare Integration verabreichter DNA ins eigentliche Genom notwendig, wodurch man ungewollte Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Leukämie, ^[3,4] vermeidet. Diese mögliche Anwendung der RNA-Interferenz zur Krankheitsbekämpfung wurde zuerst an mit Hepatitis infizierten Mäusen nachgewiesen. So schützte die Zugabe einer bestimmten siRNA diese Mäuse gegen Leber-Fibrose, eine Folgeerscheinung der Hepatitis. ^[6] Schon 2004, nur 6 Jahre nach der Entdeckung der RNA-Interferenz begannen die ersten klinischen Tests für ein Medikament auf siRNA-Basis. Mittlerweile werden schon verschiedene weitere Medikamente gegen eine Reihe von Krankheiten, die von Atemwegserkrankungen bis AIDS reichen, auf siRNA-Basis entwickelt, wobei das eigentliche Potenzial nach wie vor nicht ausgeschöpft ist. [7]

Aber wird die RNA-Interferenz tatsächlich eine Revolution in der Krankheitsbekämpfung einläuten oder wird sie, ähnlich wie die Gentherapie in ihren Kinderschuhen stecken bleiben?

In der folgenden Facharbeit will ich unter Einbeziehung eigener Ergebnisse erläutern, wie die RNA-Interferenz funktioniert und diskutieren was für ein Potenzial bei der Bekämpfung von verschiedenen Krankheiten in ihr zu sehen sein könnte. Dabei möchte ich zuerst auf den grundlegenden Mechanismus und danach auch auf Probleme eingehen, die einem breiten Einsatz nach wie vor im Wege stehen, und mögliche, derzeit diskutierte Lösungsvorschläge aufzeigen.

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2 RNA-Interferenz in der Zelle

2.1 Die Entdeckung der RNA-Interferenz

Die RNA-Interferenz wurde als erstes in Pflanzen entdeckt, denen man zusätzliche mRNA Kopien für einen Blütenfarbstoff einbrachte. Anstatt dadurch aber noch mehr Farbstoff zu bilden und sich noch mehr zu färben, bleichten die behandelten Pflanzen aus, ein Phänomen das sich damals niemand erklären konnte ^[5] . Später stießen Wissenschaftler um Craig Mellow und Andrew Z. Fire bei Versuchen mit Fadenwürmern auf ein ähnliches Phänomen. Die beiden experimentierten mit so genannter antisense-RNA, mit der sie spezifische Gene ausschalten konnten. Allerdings zeigten auch Würmer, die als Kontrolle mit zusätzlichen mRNA-Kopien (sense-RNA) behandelt worden waren, dieselben Reaktionen. Fire und Mellow postulierten daraufhin, dass weder die sensenoch die antisense-RNA für das Ausschalten der Gene und damit für die Reaktion der Würmer verantwortlich war, sondern eine dritte Form von RNA, die bei beiden als Verunreinigung vorkam, nämlich doppelsträngige RNA (dsRNA). In einer Reihe von bahnbrechenden Versuchen konnten sie diese Vermutung beweisen und gleichzeitig ein Modell für den dahinter stehenden Mechanismus aufstellen. ^[1,5] So stellt dieses „Genstummschalten“ letztlich eine enzymatische Reaktion auf doppelsträngige RNA dar. Den zugrunde liegenden Mechanismus tauften die beiden „RNA-Interferenz“. In der Folge konnte diese auch bei vielen anderen Eukaryoten wie Pflanzen, Pilzen und Einzellern nachgewiesen werden. ^[7] Die weitere Aufklärung der Wirkungsweise erlaubte es dann Forschern um den Deutschen Thomas Tuschl, dieses Phänomen auch bei Säugetieren nachzuweisen. ^[11] Tatsächlich gibt es nur wenige Eukaryoten, denen die typischen Enzyme für eine RNA-Interferenz Antwort auf dsRNA fehlen. [5]

2.2 Die Rolle der RNA-Interferenz in der Zelle

Die weite Verbreitung der RNA-Interferenz, und die Tatsache dass Knock-out- Mutationen, die die verantwortlichen Enzyme deaktivieren, oft letal sind, lassen

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darauf schließen, dass die RNA-Interferenz eine wichtige Rolle bei für die Zelle überlebenswichtigen Prozessen spielt. Ursprünglich wurde in ihr eine urtümliche, aber effiziente Strategie zur Bekämpfung von Viren gesehen, von denen die meisten während ihres Lebenszyklus in einer Form mit doppelsträngiger RNA vorliegen. RNA-Interferenz kann dann dafür sorgen, dass die viralen Gene nicht mehr abgelesen werden und das Virus sich nicht mehr vermehren kann. Bei höheren Organismen sorgen zwar komplexere Mechanismen für die Virusabwehr, aber auch sie brauchen die RNA-Interferenz, um so genannte „springende“ Gene in Schach zu halten. Das sind „Schmarotzer“-Gene, die sich im Erbgut eingenistet haben und sich von Zeit zu Zeit an andere Stellen kopieren. Das tun viele über eine dsRNA Zwischenstufe, was es der RNA-Interferenz erlaubt, regulierend einzugreifen. Dadurch wird ein Ausufern der Kopien verhindert. Erstaunlicherweise stellte sich aber heraus, dass Zellen den gleichen Mechanismus auch nutzen, um ihre eigenen Gene zu regulieren. Dabei existieren im Erbgut Pläne für so genannte Mikro-RNAs (miRNAs), die so aufgebaut sind, dass ihr vorderer und hinterer Teil komplementär sind. Dadurch können sie Haarnadelstrukturen mit doppelsträngiger RNA bilden, die wie körperfremde dsRNA behandelt werden und so die Expression körpereigener Gene kontrollieren können. Es wurde sogar nachgewiesen, dass derartige miRNAs eine wichtige Rolle bei Wachstums- und Entwicklungsvorgängen spielen. [5,8]

2.3 Der Mechanismus der RNA-Interferenz

2.3.1 Dicer und die Spaltung von dsRNA in siRNAs

RNA-Interferenz tritt auf, wenn in einer Zelle lange, doppelsträngige RNA auftaucht. Da diese in der Zelle normalerweise nicht vorkommt, wird sie von Dicer, einer Endonuklease vom RNAse III Typ erkannt und in 19 Basenpaare (bp) lange Duplexe geschnitten, wobei sich auf jeder 3’ Seite jeweils ein 2 bp langer Überhang befindet, sodass die Gesamtlänge eines Stranges 21 bp beträgt. Diese so aufgebauten RNA-Duplexe werden als „small“ oder „short interfering“-RNAs (siRNAs) bezeichnet. ^[4,10] (siehe Abbildung 1 (1)). Bei Säugetierzellen existiert Dicer zwar auch, dort führt allerdings eine