gesamte Erbinformation, was heißt, drei aufeinander folgende Basen codieren für eine Aminosäure, die in weiterer Folge die Proteine und somit Zellen und einen Organismus selbst mitsamt seinen Funktionen aufbauen. Ein DNA-Strang läuft antiparallel zum anderen, wobei sich zwei Basen immer via Wasserstoffbrückenbindungen zusammenlagern. Dass auch diese Zusammenlagerung fix ist, heißt, dass die Information eigentlich redundant ist. Hierin birgt sich aber die Möglichkeit der Verdoppelung der DNA und somit der Zellteilung. Die Watson-Crick-Paarung, dass sich Adenin A immer gegenüber von Thymin T, Guanin G hingegen immer gegenüber von Cytosin C befindet, ist die sterisch und thermodynamisch stabilste Paarungsvariante. Diese Basen heißen jeweils zueinander komplementär. (8a) Dieses Wissen ermöglicht Sequenzierungs- und künstliche, gezielte Synthesemethoden und bildet die Basis der molekularbiologischen Revolution.

1977 - Die Revolution weitet sich aus: Sequenzierung nach Sanger - das Didesoxyverfahren

Das Prinzip ist aber nicht der Abbau der DNA, also dass man, wie man es sich vielleicht vorstellen könnte (und wie es in anderen Analysemethoden auch der Fall ist), die DNA Schritt für Schritt abbaut, sondern eigentlich auch hier eine DNA-Synthese. Man geht von einem DNA-Einzelstrang aus und synthetisiert den Doppelstrang á la Watson-Crick-Paarung dazu. Damit die Syntheseprodukte später nachgewiesen werden können, müssen die Ausgangsstoffe, die Nukleotide, vorher entweder radioaktiv oder mittels Fluorophoren (Fluoreszenzfarbstoffen) markiert werden. Die Synthese lässt man dann in vier verschiedenen Ansätzen parallel laufen. Benötigt werden bloß die vier verschiedenen Nukleotide (jedes Nukleotid enthält jeweils eine der vier Basen, aber auch einen Teil des DNA-Rückgrades, über welches die eigentliche Synthese, also das „Zusammenkleben“ zu einer Nukleotidkette, dem DNA-Strang, verläuft) und ein Enzym, die Polymerase, also der Maurer, der für den Zusammenbauvorgang verantwortlich ist. Jedes Nukleotid enthält weiters an einer bestimmten Stelle eine OH-Gruppe (Hydroxygruppe), über die das DNA-Rückgrat aufgebaut wird. Fehlt diese OH-Gruppe, so kann die DNA-Synthese nicht weiter gehen, sondern stoppt (daher auch der Name „Terminationsverfahren“). Da dieses Fehlen des Sauerstoffs also wesentlich für das Verfahren ist, nennt man es Desoxyverfahren. „Didesoxy“ soll nur darauf hinweisen, dass es sich bei der DNA, im Gegensatz zur RNA, ohnehin schon um eine spezielle, stabilere Nukleinsäure-Form handelt. Jeder der vier Ansätze enthält nun also die vier Sorten an „normalen“ Nukleotiden (also mit dieser OH-Gruppe), wobei bei jedem Ansatz jeweils ein kleiner Teil (1:200) eines der vier normalen Nukleotide durch die Didesoxy-Variante des Nukleotids ersetzt ist. Startet die Reaktion, so stoppt sie wieder, sobald sie auf ein Didesoxy-Nukleotid trifft. In einem Ansatz ist das nun also nur bei As der Fall, beim nächsten nur bei Ts, bei einem bei Gs, bei einem bei Cs. In jedem Ansatz enstehen verschieden lange DNA-Strang-Gemische. Hier spielt die Statistik eine wesentliche Rolle. Je größer natürlich der Anteil der Didesoxy-Variante des Nukleotids wäre, desto kürzer wären im Durchschnitt die Syntheseprodukte. Bis zu 1000

Nukleotide können so aneinandergebaut werden. (Also kann ein Genom natürlich nie in einer Reaktion durchsequenziert werden!)

Mittels Gelelektrophorese werden die vier Ansätze nun nebeneinander nach der Größe aufgetrennt. Die kurzen DNA-Stränge wandern im elektrischen Feld schneller als die langen. Für jeden Ansatz ergibt sich so ein Strichcode, alle Ansätze gemeinsam ergeben einen Strichcode, an dem man die Sequenz einfach ablesen kann. Jede DNA-Länge kommt insgesamt in allen Ansätzen ja nur einmal vor; an der Höhe (also wie weit der DNA-Strang gewandert ist) bzw. „Zeile“ sieht man nun, an welcher Stelle der DNA man ist, an der „Spalte“ um welches Nukleotid, also welche der vier Basen es sich an eben dieser Stelle handelt.

Verwendet man Fluorophore zur Markierung ergeben sich zwar einige neue Probleme, allerdings gibt es dann den großen Vorteil, dass man nur mit einem Ansatz arbeiten kann, weil man verschiedene Farbstoffe verwenden kann. (1a)

1986 - Die Revolution nimmt ihren Lauf: Polymerasekettenreaktion PCR

Benötigt man bei anderen Analyseverfahren etwa 10 ¹⁰ oder vielleicht auch nur 10 ⁸ DNA-Moleküle, so ist das für einige Anwendungen zu viel. Die PCR bietet (zumindest theoretisch) die Möglichkeit von einem einzigen (!) Molekül auszugehen. Binnen weniger Stunden können 10 ¹² Kopien vorhanden sein. Der Kopiervorgang verläuft zu einem Großteil exponentiell.

Es ist hier nicht notwendig, die gesamte DNA-Sequenz zu kennen. Notwendig ist bloß zu wissen, was man kopieren will. Man kopiert nämlich nie alles, sondern nur bestimmte Abschnitte der DNA, die in etwa 1000 Basen lang sind, für die jeweilige Anwendung aber reichen. Außerdem muss man einen kurzen Teil der Sequenz davor und danach kennen, damit sie möglich ist. Ein gewisses Wissen über die DNA ist also vorausgesetzt - ein Wissen, zu dem die Sanger-Methode wesentlich beigetragen hat.

Prinzip ist Folgendes: Die DNA liegt als Doppelstrang vor. Dieser wird in zwei Einzelstränge aufgetrennt, damit in der Folge zu jedem dieser Stränge ein neuer komplementärer Strang daran ansynthetisiert werden kann. Dieser Vorgang wiederholt sich dann, es handelt sich um eine exponentielle Kettenreaktion. Ein Zyklus dauert nur wenige Minuten. Das wichtigste an einer PCR ist die Wahl der sogenannten Primer. Dies sind ca. 20 Basen lange Nukleinsäure-Stückchen, die die oben genannten Grenzen des zu vervielfältigenden DNA-Abschnittes vorgeben (demnach gibt es standardmäßig zwei verschiedene Primer pro PCR). Durch sie erreicht man die Spezifität, dass nur der Abschnitt, den man auch wirklich haben will, kopiert wird und nicht alles. Für die Wahl der Primer gibt es Programme, die die passenden berechnen, so es keine Standardanwendungen sind. Sie werden synthetisch hergestellt und für die jeweilige Anwendung angekauft.