Inhaltsverzeichnis

Abk  ürzungsverzeichnis  

1  Einleitung.  1

1.1.  Aufbau der ATP-Synthase.  1

1.2.  Die Untereinheiten der F o F 1 -ATP-Synthase.  4

1.3.  Die Assemblierung der ATP-Synthase.  11

1.4.  Zielsetzung der Arbeit.  13

2  Material und Methoden.  15

2.1.  Stämme, Plasmide und Primer.  15

2.2.  Medien und Anzuchtsbedingungen.  17

2.2.1.  Zellanzucht in Luria Bertani-Vollmedium.  17

2.2.2.  Zellanzucht in TYPGN-Medium.  18

2.2.3.  Zellanzucht in Tanaka Minimalmedium.  18

2.2.4.  Fermentation.  19

2.2.5.  Präparation von Dauerkulturen.  19

2.2.6.  Komplementationstest.  19

2.3.  Molekularbiologische Methoden.  20

2.3.1.  Polymerase-Kettenreaktion.  20

2.3.2.  Konstruktion neuer Plasmide.  20

2.3.3.  Präparation von Plasmid-DNA.  21

2.3.4.  Restriktion von Plasmid-DNA.  21

2.3.5.  Agarose-Gelelektrophorese.  21

2.3.6.  Gel-Extraktion.  22

2.3.7.  Ligation.  22

2.3.8.  Herstellung kompetenter Zellen mittels CaCl 2  22

2.3.9.  Transformation durch Hitzeschock.  23

2.3.10.  Elektrokompetente Zellen.  23

2.3.11.  Transformation durch Elektroporation.  24

2.3.12.  Konstruktion der Deletionsmutante DP2.  24

2.3.13.  Konstruktion der „knock-out“ Mutante DP1  25

2.4.  Biochemische Methoden.  25

2.4.1.  Präparative Methoden.  25

2.4.1.1.  Präparation von invertierten Membranvesikeln und der Cytoplasma-  

Fraktion.   25

2.4.1.2.  Präparation von F 1 -freien Membranvesikeln.  26

2.4.1.3.  Präparation von Wildtyp-F 1 aus SK1/pBWU13.  27

2.4.1.4.  Ablösung der F 1 -Komplexe von DK8/pBH7.1-Membranvesikeln.  28

2.4.1.5.  Reinigung von F 1 -Komplexen mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie.  28

2.4.1.6.  Reinigung von δ und ε mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie.  29

2.4.1.7.  Rückbindung von F 1 an F 1 -freie Membranvesikel.  30

2.4.2.  Analytische Methoden.  31

2.4.2.1.  BCA-Proteinbestimmung.  31

2.4.2.2.  ATPase-Aktivitätsmessung.  31

2.4.2.3.  ATPase-getriebene Protonentranslokation durch ACMA-Fluoreszenz.  32

2.4.2.4.  SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese.  33

2.4.2.5.  C oomassie-Färbung.  34

2.4.2.6.  Immunoblotanalyse.  34

2.4.2.7.  Analyse von Proteinen durch Massenspektrometrie.  35

3  Ergebnisse.  37

3.1.  Charakterisierung der c-defizienten Mutanten.  37

3.1.1.  Funktionelle Charakterisierung der Mutante DK8/pBWU13. c-His.  38

3.1.2.  “Knock-out“ der F 1 -Untereinheit c.  42

3.1.3.  Funktionelle Charakterisierung der Mutante DP1.  43

3.1.4.  Rückbindung der aus dem Cytoplasma gereinigten F 1 -Komplexe an F 1 -freie  

Membran.   47

3.1.5.  Präparation von Wildtyp-F 1  51

3.2.  Untersuchungen zur Defizienz von δ.  52

3.2.1.  Ablösung des F 1 -Komplexes von DK8/pBH7.1.  53

3.2.2.  Expressionssteigerung von δ.  54

3.2.2.1.  Konstruktion von pCDFduet-atpH.  56

3.2.2.2.  Ermittlung der erforderlichen IPTG-Konzentration  56

3.3.  Reinigen der Untereinheiten δ und ε.  59

3.3.1.  Reinigung von δ.  59

3.3.2.  Reinigung von ε.  62

4  Diskussion.  65

4.1.  Charakterisierung der c-defizienten Mutanten.  65

4.2.  Untersuchungen zur Defizienz von δ.  70

5  Zusammenfassung.  73

6  Literaturverzeichnis  73

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei all jenen Menschen bedanken, die mir diese Arbeit ermöglicht haben und mir mit Rat und Tat zur Seite standen. Daher gilt zunächst großer Dank Dr. Gabriele Deckers-Hebestreit für die Ermöglichung dieser Arbeit, für die überaus gute Betreuung und die anregenden Gespräche. Besonderer Dank gebührt Brigitte Herkenhoff, die jedem und jederzeit hilfsbereit sowie unterstützend zur Seite stand und immer wieder ein nettes Wort übrig hatte. Des Weiteren möchte mich für das gute Arbeitsklima in der Arbeitsgruppe bedanken, im Speziellen bei Diana, die mir viel Freude bereitet hat.

Ich möchte diese Arbeit meinem im April verstorbenen Vater widmen, meiner Mama und meinem Bruder Adel. Auch meine biologischen Eltern möchte ich an dieser Stelle erwähnen, die niemals vergessen sind. Ich danke meinem Freund Sascha für all das Gute was er in mein Leben bringt und meinen Mädels Nadine, Kathrin und Melanie, weil ich mich immer auf sie verlassen kann. Auf jeden Fall möchte ich noch Lars sehr danken, dass er in meiner stärksten Krankheitsphase immer wieder auf mich aufgepasst hat und ich nur deshalb manche Abende durchstehen konnte.

Im Speziellen möchte ich unbedingt noch Wieland und der Familie Hemesath danken, die mir ermöglicht haben, das Studi um zu Ende führen zu können.

Abkürzungsverzeichnis

Amp Ampicillin

BCA Bicinchoninsäure

BSA bovines Serumalbumin

bp Basenpaar

Carb Carbenicillin

DCCD N, N’-Dicyclohexylcarbodiimid

EDTA Ethylendinitrilo

Kan Kanamycin

LB Luria Bertani (Medium)

ME β-Mercaptoethanol

MM Minimalmedium

MV Membranvesikel

NMR kernmagnetische Resonanzspektroskopie

OD Optische Dichte

PAP Probenauftragungspuffer

PCR Polymerase-Ketten-Reaktion

anorganisches Phosphat P i

SDS Natriumdodecylsulfat

Sm Streptomycin

TCA Trichloressigsäure

TAE Tris-Acetat-EDTA

TEMED N,N,Nʹ,Nʹ-Tetramethylethan-1,2-diamin

TMG Tris-Magnesium-Glycerin

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

TYPGN Trypton-Yeast-Phosphat-Glycerin-Nitrat

ÜN über Nacht

WT Wildtyp

1 Einleitung Daniela Prätorius

1 Einleitung

1.1 Aufbau der FOF1-ATP-Synthase

Die ATP-Synthase ist ein hochkonserviertes Enzym und ein Schlüsselenzym in der zellulären Energieumwandlung. Sie wird zu den ATPasen vom F-Typ gezählt und gehört zu den kleinsten Nanomotoren überhaupt. Sie besitzt zwei strukturelle Bereiche: zum einen die F 1 -Untereinheit, wobei der Index 1 sich auf den ersten Faktor bezieht, der als essentiell beschrieben wurde und zum anderen die F o -Untereinheit, wobei o ursprünglich für Oligomycin-empfindlich steht. Die F o F 1 -ATP-Synthase ist in ähnlicher Struktur in der inneren Membran von Mitochondrien, in der Thylakoidmembran von Chloroplasten und bei Eubakterien zu finden und besitzt ein Molekulargewicht von 550-650 kDa (Capaldi & Aggeler, 2002). Bei Bakterien ist sie innerhalb der Cytoplasmamembran lokalisiert, wobei der F 1 -Teil in Richtung des Cytoplasmas ausgerichtet ist. Bei Escherichia coli besteht der protonentransportierende, membranintegrale F o -Teil aus den Untereinheiten a, b und c, die mit einer Stöchiometrie von 1:2:10 vorliegen (Capaldi & Aggeler, 2002). Das Molekulargewicht des F o -Komplexes beträgt 148kDa. Der hydrophile periphere F 1 -Teil g y p p p

1

besteht aus den Untereinheiten α, β, γ, δ und ε und liegt mit einer Stöchiometrie von 3:3:1:1:1 vor (Abb.1). Das Molekulargewicht des F 1 -Bereiches beträgt 382kDa. Diese beiden Subkomplexe, F o und F 1 , können mittels diverser Waschschritte in Puffer mit geringer Salzkonzentration und einem Chelatbildner, der die vorhandenen zweiwertigen Kationen abfängt, leicht voneinander getrennt werden. Nativ liegt F o und F 1 bei der ATP-Synthase aber in gekoppeltem Zustand vor, wobei diese Kopplung innerhalb des Enzyms durch zwei Strukturen sichergestellt wird. Zum einen handelt es sich hierbei um den „pheripheral stalk“, der sich aus den Untereinheiten δ und b zusammensetzt und zum anderen um den „central stalk“ der aus den Untereinheiten γ und ε besteht (Capaldi &

Aggeler, 2002). Funktionell lässt sich die ATP-Synthase ebenfalls in zwei Sektoren unterteilen. Dabei handelt es sich um die Statordomäne, die aus den Untereinheiten α 3 β 3 δab 2 besteht und die Rotordomäne, die aus den Untereinheiten γεc 10 gebildet wird (Junge et al., 2009). Die Rotordomäne wird durch den Protonenfluss angetrieben, welcher durch das elektrochemische Protonenpotential der Membran ermöglicht wird. Aufgebaut wird der elektrochemische Protonengradient (pmf) aus dem Membranpotential und dem pH-Gradienten durch eine Reihe von membranintegralen Transportsystemen der Atmungskette unter Ausnutzung des vektoriellen Transports von Elektronen innerhalb der Membran, wobei sukzessive Protonen nach außen transportiert werden (Abb. 2). Nach dem chemiosmotischen Modell von Peter Mitchell wird der Protonengradient in ATP umgesetzt und zwar abhängig von der protonenmotorischen Kraft.

1

1 Einleitung Daniela Prätorius

Dabei fließen die Protonen durch einen Protonenkanal in die Zelle zurück. Dieser Kanal ist Teil der ATP-Synthase, die durch den Fluss angetrieben wird, das elektrochemische Protonenpotential der

Membran in energiereiche Phosphosäureanhydridbindung umsetzt und aus Adenosindiphosphat (ADP) und anorganischem Phosphat, Adenosintriphosphat (ATP) synthetisiert. Dabei ist ATP die universelle chemische Energieform und besteht aus der Base Adenin, dem Monosaccharid Ribose und drei Phosphatresten (Abb. 3) und kann abgesehen von der oxidativen Phosphorylierung zum anderen auch mittels Substratkettenphosphorylierung gebildet werden. Bei der Substratkettenphosphorylierung wird ATP aus phosphorylierten organischen Verbindungen unabhängig von der ATP-Synthase gebildet, wobei der energiereich gebundene Phosphatrest der organischen Verbindung auf ADP übertragen

wird. Durch die Hydrolyse der endständigen Phosphatsäureanhydridbindung des ATP kann die gespeicherte Energie der Zelle verfügbar gemacht werden.

ATP + H 2 O ADP + P ⁱ . mol ^-1 frei und kann so für

Dabei wird unter Standardbedingungen eine Energie von etwa -30,5 kJ

energetisch ungünstige Reaktionen benutzt werden, welche an die ATP-Hydrolyse gekoppelt sind. Schätzungsweise werden im Menschen pro Tag 40kg ATP umgesetzt.

Neben der Synthese von ATP ist die ATP-Synthase auch dazu in der Lage als ATPase zu fungieren und ATP zu hydrolysieren. Infolgedessen wird dann gleichzeitig ein Protonengradient aufgebaut. Der Zustand der ATP-Hydrolyse findet bei Bakterien beispielsweise unter anaeroben Bedingungen statt, um so das Membranpotential aufrecht zu erhalten. Bei der bakteriellen ATP-Synthase ist die ATPase-Aktivität von inhibierendem Mg-ADP, dem transmembranen elektrochemischen Gradienten sowie von Konformationsänderungen in ε abhängig (von Ballmoos et al., 2008). Bei Anwesenheit von ATP liegt ε in der „closed“ Konformation vor, bei welcher sowohl Synthese als auch Hydrolyse von ATP möglich ist. Steigende ADP- bzw. niedrige ATP-Konzentrationen führen zum „open“- Zustand, der eine Rotation der γ Untereinheit in Hydrolyse-Richtung inhibiert (Yagi et al., 2007; von Ballmoos et al., 2008).

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1.2 Untereinheiten der FoF1-ATP-Synthase

Wie zuvor erwähnt besteht die ATP-Synthase von E. coli aus acht Untereinheiten, deren codierenden Gene in einem Operon vorliegen. Das atp-Operon befindet sich bei ca. 84min auf dem Chromosom in der Nähe des Replikationsursprungs oriC (Gay & Walker, 1981) und besitzt eine Größe von 6,8kb. Es codiert die Gene atpIBEFHAGDC, welche so angeordnet sind, dass angesehen von atpI, als erstes die Gene für den F o -Teil transkribiert werden und anschließend die Gene für den F 1 -Teil der ATP-Synthase. Darüber hinaus besitzt das Operon drei verschiedene Promotoren unterschiedlicher Stärke. Der stärkste von ihnen liegt 73bp stromaufwärts des Gens atpI, die anderen beiden schwächeren innerhalb dieses Gens (von Meyenburg et al., 1982). Die Transkriptionstermination des Operons erfolgt ungefähr 50bp stromabwärts des atpG Gens (Nielsen et al., 1984). Da die Stöchiometrie der Untereinheiten innerhalb der ATP-Synthase stark variieren, müssen dementsprechend die Untereinheiten ungleich stark synthetisiert werden. Das wird durch translationelle Kopplung zwischen den einzelnen Cistronen erreicht, sodass die Translation der Cistrone innerhalb der polycistronischen mRNA in unterschiedlichem Maß erfolgt.

Das Gen atpI codiert die Untereinheit i, dessen Funktion in Escherichia coli nach wie vor nicht eindeutig geklärt werden konnte. Es konnte aber nachgewiesen werden, dass das hydrophobe Protein nicht essentiell für die Funktionalität der ATP-Synthase in E. coli ist. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass bei Propionigenium modestum die Untereinheit i essentiell ist und mit ihrer chaperonähnlichen Funktion Anteil an einer erfolgreichen

Assemblierung c-Ringes hat.

Die ebenfalls hydrophobe Untereinheit a, welche von atpB codiert

wird, besitzt ein Molekulargewicht von 30kDa. Über die Struktur als auch den dreidimensionalen Aufbau ist jedoch wenig bekannt. Insgesamt besitzt sie fünf transmembranen α-Helices (TMH). Die Orientierung wurde mittels Cysteinsubstitutionen untersucht, wobei der C-Terminus zum Cytoplasma und der N-Terminus dem Periplasma zugewandt ist (Long et al., 1998; Valiyaveetil & Fillingame, 1998). Weitere Crosslinkstudien zeigten, dass die THM 2-5 von a als 4-Helixbündel vorliegen, welche über hydrophile Schleifen miteinander verbunden sind (Schwem & Fillingame, 2006). Es bilden

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sich zwei cytoplasmatische Schleifen in den Regionen aK66-aH95 und aK169-aE196 sowie zwei periplasmatische Schleifen in den Regionen aV110-aE131 und aL229-aI246 aus (Björbaek et al., 1990; Lewis et al., 1990; Greie et al., 2001).

Mit Hilfe von Mutagenesestudien konnte eine direkte Beteiligung von a am Protonenfluss über die Membran gezeigt werden und zwar anhand von zwei Halbkanälen. Dabei wurden die Aminosäuren der vierten transmembranen Helix identifiziert, welche für die Bildung des cytoplasmatischen Kanals wichtig sind. Besonders essentiell ist der hochkonservierte Aminosäurerest Arginin an der Position 210 in der vierten TMH, da jede Substitution dieser stark konservierten Aminosäure die Protonentranslokation beeinträchtigt (Vik et al., 1994). Der periplasmatische Halbkanal wird von den Aminosäuren der fünften Transmemebranhelix gebildet (Angevine & Fillingame, 2003; Schwem & Fillingame, 2006, Angevine et. al., 2007, Moore et al., 2008). Neuere Studien von Moore et al. (2008) lassen vermuten, dass eine pH-abhängige Konformationsänderung der TMH5 eine zentrale Rolle beim Protoneneintritt in den periplasmatischen Halbkanal spielt. Mit Hilfe von molekulargenetischer Cystein-Substitutionen in allen TMH wurde die Zugänglichkeit der hydrophilen Halbkanäle für wasserlösliche Substanzen wie Ag ²⁺ und NEM untersucht. Crosslinkstudien konnten zudem eine Interaktion zwischen TMH4 von a und der TMH2 von c nachweisen. Dabei liegt das aR210 parallel zu cD61 (Fillingame et al., 2000) und interagieren über eine transiente Salzbrücke miteinander (Deckers-Hebestreit et al., 2000). Gleichzeitig interagiert a mit Aminosäuren der vierten und fünften TMH mit der „tether“-Domäne der Untereinheit b. Crosslinkstudien zeigten Wechselwirkungen von aV239 und aA242 mit bG9 (Brandt, 2007) sowie aV239 mit bL16, was sich auch als eine geeignetere ab- Interaktionspositionin den Studien erwies (Vorwerk, 2009). Untermauert werden konnte diese Erkenntnis der Interaktion noch durch Reinigung von a mittels His-tag, da dabei ein ab 2 -Komplex gewonnen werden konnte. Dieser Komplex ist sogar stabil genug, um bei der Affinitätschromatographie in verschiedenen Detergenzien bestand zu haben (Stalz et al., 2003).

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Auch c, welche mit 8,3 kDa die kleinste Untereinheit der ATP-Synthase

ist, ist eine stark hydrophobe Untereinheit und wird auch gerade wegen dieses extrem hydrophoben Charakters auch Proteolipid genannt, da es wie Phospholipide durch Chloroform/Methanol Extraktion gereinigt werden kann. Girvin et al. (1998) konnte die Struktur von c in einer Chloroform/Methanol/Wasser Lösung mit Hilfe der NMR-

Spektroskopie bestimmen. Insgesamt besitzt die Untereinheit zwei transmembrane, antiparallel angeordnete α-Helices und bildet damit

und einer dem Cytoplasma zugewandten „loop“-Region eine Haarnadelstruktur aus. Diese „loop“-Region besitzt im Gegensatz zu den α-Helices hydrophile Aminosäuren (Jones et al., 1998; Girvin et al., 1998). Die hydrophobe Struktur der α-Helices wird durch einen polaren Carboxylrest am Aspartat 61 innerhalb der zweiten Helix unterbrochen, wodurch eine Protonenbindestelle geformt wird (Fillingame & Dimitriev, 2002, Steed & Fillingame, 2009). Dies ist essentiell für den Protonentransport über die Membran. Grundsätzlich liegt c in oligomerer Form in F o F 1 -ATPasen vor, dabei variiert aber die Anzahl der Monomere von Organismus zu Organismus und besitzt eine Bandbreite von 8 bis 15 Monomeren. In Rinderherzmitochondrien kommen zum Beispiel 8 c-Monomere vor (Watt et al., 2010), 10 Monomere in Saccharomyces cerevisiae (Stock et al., 1999) sowie in E. coli (Ballhausen et al., 2009) und 11 c-Monomere in Ilyobacter tartaricus (Meier et al., 2005). Des Weiteren sind in Spinacea oleracea 14 dieser Monomere zu finden (Seelert et al., 2000) und in Spirulina platensis sogar 15 (Pogoryelov et al., 2005). Die Anzahl der c-Monomere ist abhängig vom Membranpotential sowie dem pH-Gradienten, wobei weniger Monomere dann energetisch günstiger sind, wenn das Membranpotential überwiegt und mehr Monomere, wenn der Protonengradient größer ist. Grundsätzlich lässt sich mittels Kristallstruktur und AFM sagen, dass die c-Monomere eine Ringstruktur bilden, bei der die Monomere so angeordnet vorliegen, dass jeweils die N-terminale Helix nach innen und die C-terminale Helix nach außen orientiert ist. Dadurch entsteht ein konzentrischer Ring. Der Innenraum des Rings ist höchstwahrscheinlich zur periplasmatischen Seite hin mit Phospholipiden gefüllt, um einen unkontrollierten Ionenfluss über die Membran zu verhindern (Watt et al., 2010).

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Die 17,3kDa große amphiphile Untereinheit b der ATP-Synthase von Escherichia coli ist ebenfalls wie a und c in der Cytoplasmamembran verankert. Neben dem membranintegralen Teil besitzt sie außerdem eine große cytoplasmatische Domäne und liegt in dimerer Form im Enzymkomplex vor, wobei die Dimerisierung sowohl für die Funktionalität, als auch für die Assemblierung des Enzyms notwendig ist (Wood & Dunn, 2007). Insgesamt bestehen die Monomere jeweils aus 156 Aminosäuren und bilden wahrscheinlich durch superspiralisierte Anordnung ein Homodimer aus,

welches

Cytoplasmamembran bis hin zur Spitze des F 1 -Komplexes erstreckt (Capaldi et al., 2000). Die Monomere der b-Untereinheit können durch zahlreiche Deletions- und Crosslinkstudien in vier funktionale Domänen eingeteilt werden. Es handelt sich hierbei um eine Nterminale

Aminosäureresten 1-24 der monomeren b-Untereinheit besteht, eine „tether“-Domäne mit den Resten 25-52, sowie eine Dimerisierungsdomäne (Reste 53-122) und eine C-terminale δ-Bindedomäne mit den restlichen Aminosäuren 123-156 (Dunn et al., 2004). Der cytoplasmatisch gelegene Teil des Proteins ist hydrophil, abgesehen von einem kurzen hydrophoben Bereich am C-Terminalen Ende (Aminosäuren 124-132). Insgesamt kann außerdem mit Hilfe des Circulardichroismus (Greie et al., 2000) und analytischer Ultrazentrifugation ein α-helicaler Anteil im Gesamtprotein von 75% ausgemacht werden. Durch Deletionen in der b-Untereinheit

bis zu 11 Aminosäuren sowie Insertionen bis zu 14 Aminosäuren kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei der b 2 -Untereinheit um ein flexibles Konstrukt handelt, da das Enzym dadurch nicht in seiner Funktion beeinträchtigt ist (Sorgen et al., 1998; 1999).

Darüber hinaus wird die Vorstellung einer flexiblen Untereinheit dadurch unterstützt, dass das b-Dimer nicht aus zwei identischen Monomeren bestehen muss. Es können Heterodimere gebildet werden, die aus einem verkürzten als auch einem verlängerten Monomer bestehen (Grabar & Cain, 2003; 2004). Es wird davon ausgegangen, dass die b 2 -Untereinheit mit ihrer Flexibilität als energiespeicherndes Element die Subkomplexe F 1 und F o verbindet und so für die elastische Kopplung bei der Protonentranslokation verantwortlich ist (Junge, 2001). Die Membrandomäne besteht aus einer α-Helix, wobei zwischen den Resten 23 und 26 eine Abänderung ihres Verlaufs um 23° stattfindet und ab Rest 27,28 ein weiterführender Verlauf mit einem Winkel von 20° bezogen auf die Anfangshelix. Die „tether“-Domäne verbindet die Transmembrandomäne sowie die Dimerisierungsdomäne und interagiert mit der Untereinheit a des Proteins. Die

Kristallstruktur der Dimerisierungsdomäne im Bereich der Enden 62-122 am monomeren b konnte vollständig aufgeklärt werden. Es handelt sich hierbei um eine komplette α-helicale Struktur. Durch Disulfid-Crosslinkstudien konnte außerdem ein Versatz um ca. 5,5 Aminosäuren in diesem Bereich nachgewiesen werden, da durch die asymmetrische Anordnung das Dimer stabiler wird. Zudem ist es gelungen nachzuweisen, welches b-Monomer signifikant für die Interaktion mit δ ist und ist auch ein

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Indiz für die mögliche Asymmetrie. Dies gelang durch Einbau von Mutationen in die Nähe des C-Terminus der Untereinheit. Die Mutationen wurden entweder in das Monomer, welches durch „offset“-Crosslinks näher am N-Terminus positioniert ist (b ^N ) oder in das C-terminal verschobene Monomer eingebaut (b ^C ), um die jeweilige Auswirkung auf die F 1 -Bindung zu ermitteln. Bei Deletionen der letzten vier C-terminalen Aminosäuren des b ^N -Monomers lies dessen Bindung mit F ¹ nach. Im Gegensatz dazu waren die Auswirkungen der gleichen Deletionen bei b ^C gering. Ebenso verursachte BPM (Benzophenon-4-Maleimid), welches am C-Terminus von b ^N eingesetzt wurde eine Quervernetzung mit δ (Wood & Dunn, 2007). Daher ist die C-terminale δ-Bindedomäne essentiell für die Interaktion mit dem F 1 -Komplex. Zudem ist das Dimer mit dieser Bindedomäne stabiler und besitzt eine Schmelztemperatur, welche um 2-5°C höher ist, als die Konstrukte die bei 122 Aminosäuren enden (Del Rizzo et al., 2006) und ist vermutlich an der Stabilität des gesamten Proteins maßgeblich beteiligt. Da Mutationen in der δ-Bindedomäne kaum die Dimerisierung der b- Untereinheitbeeinflussen, sich aber dabei der Sedimentationskoeffizient des Dimers ändert, gehen Dunn et al. (2004) davon aus, dass sich die C-terminale Region zurückfaltet. Dies geschieht vermutlich durch eine Biegung zwischen den Resten 139-141, wodurch ein antiparalleles „right-handed“ Bündel aus vier Helices entsteht. Diese Eigenschaft verleiht der Domäne eine globuläre Struktur, konnte aber in weiteren Studien bisher nicht verifiziert werden.

Die Untereinheit δ der F 1 -Domäne hat eine Größe von 19,6kDa und besteht aus 177 Aminosäureresten. Sie lässt sich in zwei Domänen einteilen, einem N-terminalen Bereich (Abb. 11) von Aminosäure 1 bis 105 und einen C-terminalen Bereich

bestehend aus den Aminosäuren 106 bis 177. Lokalisiert ist δ in der Kronenregion des αβ-Hexamers und verbindet das Hexamer mit dem b-Dimer (Weber et al., 2003). Die Nterminalen Aminosäurereste bilden ein Bündel von sechs α-Helices (Wilkens et al., 1997). Insgesamt ist das Protein im C-terminalen Bereich hoch konserviert sowie in Helices 1 und 5, welche die Interaktionsbereiche zwischen δ und den N-terminalen Enden der α-Untereinheit darstellen. Diese Interaktion wurde quantitativ durch die Rückbindung von Wildtyp- und verändertem δ an δ-freies F 1 anhand von Fluoreszenzsignalen (Weber et al., 2003; 2006), als auch durch NMR-Spektroskopie (Weber et al., 2003; Wilkens et al., 2005) untersucht. Gleichzeitig zeigten die

Untersuchungen auch, dass wenn der cytoplasmatische Teil von b mit in die Studien einbezogen wird, die Bindeaffinität von δ an δ-freies F 1 wesentlich erhöht wird. Dabei interagiert die C-terminale Domäne von δ mit der δ-Bindedomäne des b-Dimers (Swada et al., 1997; Weber et al., 2003; 2006).

Mit 14,7 kDa stellt ε die kleinste Untereinheit des F 1 Subkomplexes dar. Die Struktur wurde mittels NMR-Spektroskopie aufgelöst und zeigt einen Aufbau aus zwei Domänen. Dabei ist die N-terminale Domäne aus zehn β-Faltblättern aufgebaut und der C-Terminus besteht aus einer Haarnadelstruktur, welche aus zwei antiparallelen α-Helices gebildet wird (Wilkens et al., 1995; Uhlin et al. 1997). Demgegenüber zeigte sich aber die C-terminale Domäne in Studien von Rodgers & Wilce (2000) in einer anderen Konformation. Die beiden α-Helices waren nicht haarnadelförmig, sondern voneinander separiert und umgaben die γ-Untereinheit. Dieses Ergebnis zeigt eine gewisse Flexibilität der ε-Untereinheit, welche auch durch Crosslink-Studien bestätigt werden konnte

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(Schulenberg et al. 1997). Durch die Flexibilät ist ε in der Lage eine Strecke 4nm zu überbrücken und somit fähig, sowohl mit der c-Untereinheit auf der cytoplasmatischen Seite der Membran, als auch mit dem αβ-Hexamer zu interagieren (Zhang & Fillingame, 1995; Aggeler & Capaldi, 1996; Schulenberg et al., 1997; Hermolin et al., 1999). Dies bedeutet, dass ε während des katalytischen Zyklus der ATP-Synthase in der Lage ist unterschiedliche Konformationen anzunehmen. In der „closed“-Konformation liegt die Untereinheit in kontrahierter Form vor und besitzt keinen Kontakt zum αβ-Hexamer (Abb. 13 A). Dabei beträgt der Abstand von εS108 zum „turn-helix-turn“-Motiv von β, die als DELSEED-Sequenz bezeichnet wird und für die Öffnung bzw. Verschluss der katalytischen Zentren in β verantwortlich ist, 50 Angström. Es kommt daher keine Interaktion zwischen ε und β zustande. In der „open“-Konformation ist ε langgestreckt (Abb. 13 B), der Abstand von εS108 zum DELSEED-Motiv beträgt nur noch 25 Angström (Buligyn et al., 2004). Neuere Studien von Yagi et al. (2007) konnten zeigen, dass ε darüber hinaus in der Lage ist ATP zu binden. Dabei bilden in Anwesenheit von ATP die beiden α-Helices der C-terminale Domäne die Haarnadelstruktur aus und unter Abwesenheit von ATP separieren sie sich wieder. Daher reagiert ε auf die ATP-Konzentration mit einer Arm-ähnlichen Bewegung und ist somit an der Regulation innerhalb der ATP-Synthase beteiligt.

Die Untereinheit γ, welche mit ε in engem Kontakt steht (Abb. 13), bildet mit ihr ein 45nm langes Verbindungsstück zwischen F o und F 1 aus. Sie besitzt eine Größe von 31,4 kDa und erstreckt sich von der Innenseite der Cytoplasmamembran, wo sie Kontakt zur Untereinheit c hat, bis in das αβ-Hexamer hinein. Durch Abrahams et al. (1994) konnte erstmals ein Teil der Kristallstruktur von mitochondrialem γ bestimmt werden und anschließend bei 2,4 Angström vollständig aufgelöst werden (Gibbons et al., 2000). Durch Rodgers & Wilce (2000) konnte zur gleichen Zeit mit einer Auflösung von 2,1 Angström die zentrale Domäne im γε-Komplex aus E. coli identifiziert werden. Es zeigte sich, dass die N- und C-terminalen Bereiche von γ aus einem Paar von antiparallelen α-Helices besteht, die leicht umeinander gewunden sind und deren Termini sich 45 Angström in die Basis des αβ-Hexamers erstrecken (Hausrath et al., 1999; 2001). Es wird angenommen, dass die Asymmetrie

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der α-Helices für die unterschiedliche Bindeaffinität der katalytischen

Bindetaschen von β von Bedeutung ist. Der mittlere Bereich von γ, unterhalb von α 3 β 3 , bildet ein Bündel aus fünf β-Faltblättern zwischen zwei α-Helices. Bei E. coli ist zudem noch ein weiteres β-Faltblatt, als auch zwei weitere α-Helices gefunden worden. Insgesamt lässt sich sagen, dass auch die Untereinheit γ einen gewissen Grad an Flexibilität aufweist und fungiert somit als elastisches Element bei der Kopplung zwischen der Rotation des c 10 -Rings und der Konformationsänderung in den drei β-Untereinheiten (Menz et al., 2001). Weitere Studien zeigten außerdem, dass die N-terminale Region von γ alleine fähig ist, die Funktion von einem kompletten γ in der ATP-Synthase zu erfüllen, solange er an ε und damit an den Rotor gebunden ist. Daher ist kein direkter Kontakt von γ an den c 10 -Ring für eine funktionelle ATP-Synthase notwendig (Mnatsakanyan et al., 2009).

Das αβ-Hexamer besteht aus jeweils drei alternierend

angeordneten α- und β-Untereinheiten, wobei α mit 55,3kDa die größte Untereinheit des F 1 -Komplexes ist. β besitzt eine atomare Masseneinheit von 50,2 kDa. Diese Untereinheiten machen ca. 80% des Gesamtgewichts von F 1 aus (Walker et al., 1982; 1985). Mittig bildet das Hexamer einen zentralen Hohlraum, in den die α-Helices der

Untereinheit γ hineinragen (Abrahams et al., 1994). Die Gensequenz von α und β zeigt eine hohe Homologie hinsichtlich ihrer Primärstruktur, sodass ihr Aufbau nahezu identisch ist. Die größten homologen Bereiche befinden sich im oberen Nterminalen β-Faltblatt der Untereinheiten. Das Hexamer

Nukleotidbindetaschen, welche im Bereich der Spalten zwischen α und β angeordnet sind. Davon sind aber nur drei katalytisch aktiv, deren Zentren sich hauptsächlich in β befinden. Darüber hinaus sind auch einzelne Aminosäurereste der α-Untereinheit an der katalytischen Aktivität beteiligt. Die α-Untereinheit ist zwar ebenfalls in der Lage ein Nukleotid zu binden, dennoch ist sie katalytisch inaktiv (Greie et al., 2001). Die

genaue Funktion der Bindetasche von α ist unbekannt. Es wird davon ausgegangen, dass der Enzymkomplex durch die Nukleotidbindung stabilisiert wird (Wise et al., 1983), jedoch konnte dies durch Untersuchungen bei Mutanten, die nicht zur Nukleotidbindung in α fähig waren, nicht verifiziert werden (Weber et al., 1995). Die N-terminalen Domänen von α und β bilden mittels β-Faltblätter eine fassartige Struktur aus, welche als Kronenregion bezeichnet wird. Im Gegensatz dazu bestehen die C-terminalen Domänen ausschließlich aus α-Helices. Zwischen beiden Regionen sind sowohl α-Helices, als auch β-Faltblätter vorhanden. Von diesen bilden neun α-Helices und neun β-Faltblätter die Nukleotidbindetaschen aus. Darüber hinaus geht das Hexamer Interaktionen mit γ ein,

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was zu verschiedenen Konformationszuständen unterschiedlicher Substratbindeaffinität in β führt (von Ballmoos et al., 2008).

1.3 Funktionsweise der FOF1-ATP-Synthase

Im Einzelnen wird die ATP-Synthese in den katalytischen β-Untereinheiten nach dem „binding change“-Mechanismus von Paul Boyer (1993) erzeugt. Bei diesem Mechanismus finden Konformationsänderungen in den drei β-Untereinheiten statt, die eine Bindung von ADP + P ⁱ verursachen, die ATP-Synthese ermöglichen und anschließend zur Freisetzung des ATP-Moleküls führen. Diese Änderungen der β-Untereinheiten werden als „open“ (O), „tight“ (T) und „loose“ (L) bezeichnet (Capaldi & Aggeler, 2002), wobei auch im Ruhezustand jede β-Untereinheit jeweils eine dieser Konformationen mit unterschiedlicher Affinität für Nukleotide besitzt, was durch eine Asymmetrie von γ bedingt ist. Im O-Zustand ist die Bindetasche leer und es erfolgt im L-Zustand die Aufnahme von ADP und P i , die eine schwache Bindung mit der Bindetasche eingehen. Im T-Zustand findet die eigentliche Generierung von ATP statt, während der nachfolgende O-Zustand dessen Freisetzung erlaubt. Die Änderungen in der Konformation werden durch Interaktionen mit der sich drehenden γ-Untereinheit verursacht. Die Drehung erfolgt in 120° Schritten, wobei jeweils ein ATP entlassen wird. Jeder dieser 120° Schritte lässt sich in weitere Subschritte einteilen. Bei der Bindung des ATP-Moleküls wird zuerst eine Rotation von γ um 80° ausgelöst und die Freisetzung bewirkt eine weitere Drehung um 40°. So liegen letztendlich nach einer Umdrehung von 360°, bei der insgesamt 3 ATP-Moleküle dissoziieren, die β-Untereinheiten wieder in ihrem Ausgangzustand vor (Greie et al., 2001). Die Hydrolyse von ATP erfolgt ebenfalls in 120° Schritten mit Subschritten von 40° und 80°, wobei die Dauer der Verweilzeit vor dem 80° Subschritt abhängig von der ATP-Konzentration ist (Pu & Karplus, 2008).

Die Energie für die Rotationsbewegung der Untereinheit γ entsteht durch den Protonentransport über die Membran. Daran ist zum einen die Untereinheit a des Stators und zum anderen die Rotorkomponente c 10 beteiligt. Die Untereinheit a fungiert hierbei als Vermittler beim Protonentransport, da sie zwei Halbkanäle besitzt, die nach dem „two-half-channel“-Modell funktionieren (Capaldi & Aggeler, 2002). Bei der ATP-Synthese findet der Protonentransport vom Periplasma zum Cytoplasma statt und entgegengesetzt bei der ATP-Hydrolyse. Nach dem „two-halfchannel“Modell gelangen bei der ATP-Synthese die Protonen entsprechend der pmf aus dem Periplasma durch den ersten Halbkanal bis zur Mitte der Cytoplasmamembran. Durch das Proton

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wird die Carboxylgruppe des Aminsosäure-Restes

Aspartat 61 der Untereinheit c in der Rotor/Stator-Interphase

Ladungsausgleich kommt und die c-Untereinheit in die Lipidinterphase der Membran diffundieren kann. Außerdem kommt es durch nachfolgende Protonierungen weiterer Monomere der c- Untereinheitzur Rotation dieser. Das hat zur Folge, dass protoniertes Asp61 in räumliche Nähe zum zweiten Halbkanal der Untereinheit a gebracht wird. An diesem Halbkanal ist die Aminosäure Arginin 210 der Untereinheit a lokalisiert. aArg210 ermöglicht die Deprotonierung des cAsp61. Gleichzeitig wird mit der nächsten „incoming binding site“ des c 10 -Rings eine transiente Ionenbindung gebildet und das Proton gelangt über den zweiten Halbkanal von a ins Cytoplasma. Bei dem Modell der Drehkrafterzeugung

können auf diese Weise bei E. coli in einem Durchgang von 360° insgesamt zehn Protonen in zehn Schritten transloziert werden, da der c 10 -Ring zehn „incoming binding sites“ besitzt, die jeweils ein Proton verlagern können. Diese Drehung des c-Ringes verursacht dann eine Drehung in γ und ε, die wiederrum eine Änderung der Konformation der katalytisch aktiven β-Untereinheiten zur Folge hat. Dabei wird dann das ATP synthetisiert.

Da die Synthese von ATP bei E. coli in drei 120° Schritten abläuft, die die Protonentranslokation in zehn Schritten à 36° beinhaltet, bedeutet dies, dass pro Synthese eines ATP-Moleküls letztendlich 3,3 Protonen transportiert werden. Dementsprechend liegt ein Verhältnis von ATP zu H ⁺ von 3:10 vor. Das Verhältnis kann von Organismus zu Organismus unterschiedlich sein, was durch die Stöchiometrie des c-Rings und der damit verbundenen Anzahl der „incoming binding sites“ verursacht wird. In den bisher untersuchten Organismen wurde eine variierende Anzahl an c- Untereinheitenvon c 8 bis c 15 festgestellt. Daher muss je nach Organismus eine variable Anzahl an translozierten Protonen an die grundsätzliche 3-Schritt-Rotation des α 3 β 3 -Hexamers gekoppelt sein. Für diese Synchronisation der Protononentranslokation mit der ATP-Synthese werden zur Zeit zwei Modelle diskutiert: zum einen der „elastic-strain-Mechanismus“ und zum anderen der „stepping-Mechanismus“ (Capaldi & Aggeler, 2002). Der „stepping-Mechanismus“ besagt, dass jede Bewegung der c-Untereinheit separat mit einem Zwischenschritt der γε-Rotation verbunden ist und somit eine Teilreaktion der Synthese eines ATP-Moleküls darstellt. Stattdessen wird beim „elastic-strain-Mechanismus“ davon ausgegangen, dass die Energie jeder Bewegung der c-Untereinheiten, in den superspiralisierten, langen α-Helices der γ-Untereinheit sowie des b-Dimers gespeichert wird, bis sie in ausreichender Menge zur Verfügung steht, um γ und ε um 120° zu drehen und damit ein ATP-Molekül zu synthetisieren.

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1.4 Assemblierung der ATP-Synthase

Der exakte Ablauf der Assemblierung der ATP-Synthase von Escherichia coli ist noch nicht ausreichend bekannt. Grundsätzlich ist es dazu notwendig, dass die drei Untereinheiten des F o -Subkomplexes a, b und c in die Cytoplasmamembran inseriert und die übrigen fünf Untereinheiten des F 1 -Subkomplexes an diese peripher assoziiert werden. Dazu sind momentan zwei Modelle in Diskussion. Zum einen handelt es sich dabei um den „separate-sector assembly pathway“ und zum anderen den „integrated membran assembly pathway“. Das erste Modell besagt, dass die Subkomplexe F o und F 1 separat assemblieren und sich anschließend im letzten Schritt zu dem funktionsfähigen Komplex zusammenlagern (Brusilow, 1993). Das zweite Modell hat zur Grundlage, dass die schrittweise Assemblierung unabhängig von F o und F 1 abläuft (Cox & Gibson, 1987), wobei dieses Modell in der Form heute nicht mehr aktuell ist. Darauf basierend wurde das nachfolgende Arbeitsmodell (Abb. 16) entwickelt, wobei die Reihenfolge des sequentiellen Einbaus der

Untereinheiten anhand bestehender Daten erhoben wurde und autark von den Subkomplexen erfolgt. Es konnte nachgewiesen werden, dass sich sowohl das b-Dimer (Becker, 2008), als auch der c 10 -Ring separat in die Membran inserieren (Arechaga et al., 2002). Darüber hinaus zeigten Ballhausen et al. (2009) mittels Quervernetzungsstudien auf Membranvesikelebene, dass es sich dabei auch explizit um einen c 10 -Ring handelt, der auch ohne weitere assemblierte Untereinheiten diese Stöchiometrie besitzt. Ebenso konnte durch Crosslinking für b gezeigt werden, dass es sich in dimerer Form in die Membran inseriert und ebenfalls in dieser Stöchiometrie auch ohne weitere Untereinheiten existiert (Becker, 2008). Beide Untereinheiten liegen aber separat in der Membran

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vor, da keinerlei Interaktion zwischen ihnen nachgewiesen werden konnte, solange keine weiteren Untereinheiten präsent sind. Der nachfolgende Schritt der Assemblierung konnte noch nicht ausreichend präzisiert werden. Es sind zwei verschiedene Varianten denkbar. Zum einen könnte sich γ zuerst an den c 10 -Ring anlagern und dann erst daran α und β und zum anderen ist es auch möglich, dass sich γ, α und β im Cytoplasma zu einem Komplex teilassemblieren und erst dann an den c 10 -Ring binden. Für die letztere Version sprechen eher die Ergebnisse von Garrelfs (2008), die diese teilassemblierten Komplexe aus dem Cytoplasma reinigen konnte. Dies konnte durch Brandt (unveröffentlicht) ebenfalls bestätigt werden. Da aber beide mit Mutanten arbeiteten, deren Gene des atp-Operons auf einem Plasmid lokalisiert sind, muss noch abschließend geklärt werden, ob es sich nun um ein Artefakt der Überproduktion handelt oder ob dies auch auf der Ebene des Genoms der Fall ist. Nach der Assemblierung von α, β und γ an c erfolgt möglicherweise die Anlagerung von ε an den schon bestehenden Komplex. Dabei ist aber auch wiederum fraglich ob ε sich zuerst an γ im Cytoplasma anlagert. Durch die Assemblierung von δ wird schließlich das separate b-Dimer an den teilassemblierten Komplex gebunden. Untersuchungen von Bunge (2009) zeigten, dass wenn b- Defizienzvorhanden ist, δ nicht in der Lage ist am nativen Enzym zu assemblieren, was möglicherweise auf verstärkten proteolytischen Abbau zurückzuführen ist, da δ ohne b möglicherweise instabiler ist. Ob dabei nun δ zuerst an b 2 bindet oder an das αβ-Hexamer ist noch nicht bekannt. Genauso ist noch nicht ausreichend belegt, ob diese letzten Schritte de facto in der dargestellten Reihenfolge ablaufen. Um letzten Endes das vollständige und ATP-Synthese-fähige Enzym zu erhalten, muss noch die Untereinheit a eingebaut werden. Dass dies als finalen Schritt erfolgt, spricht dafür, dass selbst bei fehlendem a das teilassemblierte Enzym hohe Stabilität aufweist. Der Nachweis dafür gelang Ono et al. (2004) indem sie den Teilkomplex ohne a aus B. stearothermophilus PS3 in E. coli exprimierten und er gänzlich aufgereinigt werden konnte. In vitro konnte der Teilkomplex mit gesondert aufgereinigtem a zu einem funktionsfähigen Komplex in Liposomen rekonstituiert werden. Darüber hinaus konnten Hermolin & Fillingame schon 1995 zeigen, dass für den Einbau von a die Untereinheiten c und b notwendig sind. Auch Bunge (2009) konnte dies für b bestätigen, da bei b defizienten Mutanten a nicht in Lage ist am nativen Enzym zu assemblieren und auch nicht mehr in der Membran präsent ist. Gleichzeitig konnte auch durch Brockmann (2009) in vivo nachgewiesen werden, dass auch zeitlich versetzt exprimiertes a in das teilassemblierte Enzym eingebaut wird und das Enzym voll funktionsfähig ist. Auch wenn diese Erkenntnisse nicht vollständig ausreichen die Assemblierung von a als letzten Schritt zu verifizieren, sprechen dennoch noch weitere Aspekte dafür. Zum einen erscheint es nachvollziehbar, da erst durch a die Interphase zwischen a und c entsteht, wodurch die Protonentranslokation ermöglicht wird. Eine frühzeitige Protonentranslokation wäre für die Zelle energetisch ungünstig. Zum anderen konnte in Studien gezeigt werden, dass zwar a unabhängig von b und c in die Membran inseriert werden kann (Yi et al., 2004), aber dass diese dann auch sehr schnell von der ATP-anhängigen Metalloprotease FtsH abgebaut wird und so im separierten Zustand nicht stabil ist (Ito & Akiyama, 2005). Zudem zeigen die im Hintergrund ablaufenden Vorgänge, dass während der Insertion von c, b als auch a keine protonenmotorische Kraft erforderlich ist, abgesehen von der N-terminalen Region von a. Dabei wird c durch die Membraninsertase YidC unabhängig von der Sec-Translokase in die Membran inseriert. Die Insertion von b ist im Gegensatz dazu Sec abhängig und es ist überdies der Signalerkennungspartikel („signal recognition particle“, SRP) erforderlich (Yi et al., 2004). Für die Insertion von a ist sowohl SRP, die Sec-Translokase als auch YidC essentiell (Kol et al., 2009).

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1.5 Zielsetzung der Arbeit

In der Arbeit von Garrelfs (2008) zeigte sich, dass im Cytoplasma einer Mutante mit einem „knockout“ im Gen atpH sowie eines entsprechenden Wildtyps die Untereinheiten α, β, ε und teilweise γ durch Immunoblotanalysen detektiert werden konnten und gleichzeitig bei den Membranvesikeln der c-defizienten Mutante eine Abreicherung dieser Untereinheiten erfolgte (Abb.18). Daher sollte nun mit einem His 6 -tag an β untersucht werden inwieweit die Untereinheiten an β assoziiert vorliegen und infolgedessen aus dem Cytoplasma mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt werden können. In vorausgehenden Untersuchungen von Garrelfs (2008) als auch von Brandt (unveröffentlicht) zeigte sich, dass die Untereinheiten α, β, γ und ε mit dem β-His 6 -tag gereinigt werden konnten und sich dementsprechend möglicherweise während der Assemblierung der F o F 1 -ATP-Synthase als teilassemblierte Intermediate im Cytoplasma anreichern. Da beide dafür mit Mutanten auf plasmidcodierter Ebene arbeiteten, sollten nun ebenfalls die Eigenschaften bei einem Wildtyp und einer ∆c-„knock-out“-Mutante auf chromosomaler Ebene untersucht werden, um so herauszufinden, ob es sich bei den Intermediaten um ein Resultat der Überproduktion handelt.

Im Speziellen sollte dazu die Methode von Datsenko und Wanner (2000) verwendet werden, um eine rpsL-Kan Resistenz-Kassette im atp-Operon mit entsprechender DNA zu ersetzen, welche drei Stoppcodons in atpH an den Positionen 13, 14 und 15 codiert, da vorhergehende „knock-out“ Mutanten mit nur einem Stoppcodon eine höhere Reversionsrate aufwiesen. Diese Codons bewirken einen Abbruch der Translation, sodass die Untereinheit c nicht translatiert wird. Da die Mutante mit dieser rpsL-Kan-Kassette erst bei sehr hohen Konzentrationen an Streptomycin ihre Streptomycin-Sensitivität zeigt, sollte des Weiteren eine Mutante konstruiert werden, deren rpsL-Kan- Resistenzkassetteumgekehrt inseriert ist (Abb. 19B), im Vergleich zur Kassette dieser Mutante (Abb.19A). So kann womöglich die Bindeaffinität des P rpsL-kan zur RNA-Polymerase erhöht werden und die Kassette wird dementsprechend vermehrt abgelesen. Das ist eventuell darauf zurückzuführen,

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dass der Promotor des atp-Operons sich auf die Affinität des Promotors der Resistenz-Kassette auswirkt.

Schließlich sollten die Eigenschaften des Wildtyps und der c-defizienten Mutante mittels Immunoblotanalysen sowie ATPase-Aktivitätsmessungen miteinander verglichen werden, da bei dem Wildtyp auf chromosomaler Ebene wenig teilassembliertes F 1 erwartet wird, als bei der dementsprechenden ∆c „knock-out“-Mutante. Bei dieser findet vermutlich eine Anreicherung der Intermediate statt, da diese nicht an c assemblieren können. Dennoch besitzt der Wildtyp eine höhere Aussagekraft, da es sich dabei um eine native Assemblierung handelt. Um eine Aussage über die Funktionalität der teilassemblierten F 1 -Komplexe erhalten zu können, sollte des Weiteren eine Rückbindung von Wildtyp-F 1 an F 1 -freie Membranvesikel durchgeführt und somit ein Protokoll für Fluoreszenz-Messungen der ATP-getriebenen Protonentranslokation auf Basis von Garrelfs (2008) etabliert werden. Dazu sollten auch F 1 -freien Membranvesikel aus ML308-225 präpariert werden. Die Funktionalität der cytoplasmatischen Intermediate ist deshalb essentiell, da so gezeigt werden kann, ob sie in der Lage sind an den membranintegralen F o -Teil des Enzyms zu binden und so seine native Aktivität wieder herzustellen.

In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte das Fehlen von δ in den Intermediaten untersucht werden. Bei der ∆c-Mutante von Garrelfs (2008) konnte δ in den gereinigten teilassemblierten Komplexen mittels Immunoblot nicht nachgewiesen werden. Die Abwesenheit von δ kann mehrere mögliche Ursachen haben. Sie kann zum einen auf einen sehr schnellen Abbau zurückgeführt werden, da δ als instabil gilt. Da Garrelfs (2008) zeigen konnte, dass der Abbau von δ durch Inhibition von termolysinartigen Proteasen sowie Aspartat-Proteasen vermindert wurde, wurde bei der Präparation Protease-Inhibitor-Mix der Firma Sigma verwendet. Zum anderen könnte darüber hinaus der His 6 -tag von β ein störender Faktor sein, der die Bindung von δ an den Komplex verhindert, da δ an die Kronenregion des αβ-Hexamers bindet, wo auch der His 6 -tag lokalisiert ist. Eine dritte Möglichkeit ist, dass sich δ zuerst an b assembliert, wie bei der Assemblierung der ATP-Synthase bei den entsprechenden Untereinheiten von S. cerevisiae gezeigt werden konnte (Straffon et al., 1998) und dann beide gemeinsam an das αβ-Hexamer. Dementsprechend findet dieser Vorgang nicht im Cytoplasma statt, sondern erst nachdem sich αβγ an den c 10 -Ring in der Membran assembliert hat. Dabei kann möglicherweise auch die Bindeaffinität zu b höher sein als zu der Kronenregion, da bei

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der F 1 -Ablösung vom Wildtyp δ häufig in der Membran verbleibt. Auch Untersuchungen von Weber et al. (2003) sprechen dafür, da sie zeigen konnten, dass sobald der cytoplasmatische Teil von b mit der δ-Bindedomäne in die Interaktionsstudien von δ mit einbezogen wird, die Bindeaffinität von δ an δ defizientes F 1 verstärkt wird. Um die Abwesenheit von δ zu charakterisieren sollte die Synthese von AtpH verstärkt werden, um herauszufinden, ob die Defizienz durch Abbau verursacht wird und so dem entgegengewirkt werden kann. Dabei sollte ein System entwickelt werden, bei dem durch eine bestimmte Zugabe von IPTG die Expression von δ gesteuert wird. Eine weitere Variante ist, dass separat aufgereinigtes δ zu den teilassemblierten Komplexen hinzugefügt werden sollte, um festzustellen, ob das Fehlen von δ so im Komplex komplementiert werden kann. Daher sollte ein Reinigungsprotokoll auf der Basis von Untersuchungen von Bunge (2009) etabliert werden, bei dem atpH und atpC über ein pET-System exprimiert werden. Um schließlich herauszufinden, ob δ überhaupt bei abgelöstem F 1 - bei Präsenz des His 6 -tags an β - vorhanden sein kann, sollte ein plasmidcodierter ATP-Synthase-Wildtyp verwendet werden, von dessen Membranvesikeln das F ¹ abgelöst und durch Immundetektion charakterisiert werden sollte.

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

2 Material und Methoden

2.1 Stämme, Plasmide und Primer

Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in den nachfolgenden Tabellen ersichtlich. In Tabelle 3 sind die während der Arbeit verwendeten Primer angegeben.

Tab. 1: Verwendete Bakterienstämme

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Tab. 2: Verwendete Plasmide

Tab. 3: Verwendete Primer. Rot markierte Basen sind eingebrachte Mutationen gegenüber der Wildtyp-

Sequenz; fett und unterstrichene Basen kennzeichnen Restriktionsschnittstellen.

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2.2 Medien und Anzuchtsbedingungen

2.2.1 Zellanzucht in Luria Bertani-Vollmedium (LB, Sambrook et al., 1989)

0,5% (w/v) Hefe-Extrakt

1% (w/v) Trypton

1% (w/v) NaCl

Für LB-Festmedium wurde zudem noch 1,5% (w/v) Agar hinzugefügt.

Die Zellanzucht im Vollmedium erfolgte unter aeroben Bedingungen bei 37°C unter Zugabe von Antibiotika als Selektionsmarker (s. Tab. 4). Es wurden hierfür kompetente Zellen des E. coli-Stamms DK8 mit den jeweiligen Plasmiden (s. Tab. 2) transformiert. Die Selektion der Transformanden erfolgte auf LB-Festmedium+Antibiotikum. Nach einer Inkubation über Nacht wurde jeweils eine Vorkultur von 5ml LB+Antibiotikum mit Kolonien der jeweiligen Transformanden angeimpft und im Rotator bei 37°C für einige Stunden inkubiert. Anschließend wurde 1ml der Vorkultur in 100ml LB+Amp überimpft und über Nacht im Schüttler inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurde die optische Dichte (OD) der Kulturen bei einer Wellenlänge von 600nm bestimmt, um schließlich 1000ml LB+Antibiotikum mit einer OD 600 von 0,05 durch überimpfen zu erhalten. Die Kulturen wurden dann im Schüttler bis zu einer OD 600 zwischen 0,8 und 1 angezogen. Im Anschluss daran wurden die Zellen für 15 min bei 4 °C und 8500rpm in einer Sorvall-Zentrifuge mit dem Rotor SLA 3000 zentrifugiert und das Zellpellet im Flüssigstickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Bei der Anzucht zur Überexpression der F 1 -Untereinheiten δ und ε und deren Aufreinigung wurden kompetente HB1(DE3) Zellen verwendet, mit den entsprechenden Plasmiden transformiert und während der Zellanzucht bei einer OD 600 von 0,8 für 1h mit 1mM IPTG induziert.

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Tab. 4: Verwendete Antibiotika

2.2.2 Zellanzucht in TYPGN-Medium

1% (w/v) Hefe-Extrakt

1% (w/v) Trypton

0,8% (v/v) Glycerin

0,5% (w/v) Na 2 HPO 4

1% (w/v) KNO 3

Um ein besseres Wachstum zu erzielen, wird bei schlecht wachsenden Mutanten häufig TYPGN bevorzugt, da dieses Medium nährstoffreicher ist als das LB-Vollmedium. Die Zellanzucht von DK8/pBWU13.∆c-β-His/pCDFduet-atpH/pT7Pol26 erfolgte in 5ml TYPGN-Medium+Amp+Kan+Sm, unter Zugabe verschiedener Konzentrationen von IPTG bis hin zu einer OD 600 von etwa 1. Anschließend wurde ein entsprechendes Volumen gewählt um nach der Gleichung OD1 = 1ml = 160μg jeweils 160μg Zellen in jeder Probe zu erhalten. Die Zellen wurden für 1min bei 4000rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert mit 160μl Probenaufgabepuffer resuspendiert und bei 99°C denaturiert. Anschließend wurden die Proben bei -20°C gelagert.

2.2.3 Zellanzucht in Tanaka Minimalmedium (MM, Tanaka et al., 1967)

34mM NaH 2 PO 4 10μM CaCl 2

64mM K 2 HPO 4 50μg/ml Thymin

20mM (NH 4 ) 2 SO 4 50μg/ml Asparagin

50μg/ml Isoleucin 0,3mM MgSO 4

50μg/ml Valin 1μM FeSO 4

2μg/ml Thiamin 1μM ZnCl 2

Für das MM-Festmedium wurde außerdem 1,5% Agar hinzugefügt sowie 0,5% (w/v) Na-Succinat, 0,5% (w/v) Glucose oder 0,5% (v/v) Glycerin als Kohlenstoffquelle verwendet.

Die Zellanzucht in Minimalmedium mit 0,5% (v/v) Glycerin erfolgte ebenfalls unter aeroben Bedingungen und bei 37°C. Dabei wurden 5ml LB-Vollmedium mit einer Kolonie des gewünschten

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Stammes angeimpft und über Nacht inkubiert. Mit 1ml der jeweiligen Vorkultur wurde dann 50ml MM + Glycerin angeimpft und etwa 8 Stunden inkubiert. Um eine vollständige Adaption der Zellen an das MM+Glycerin zu erreichen, wurde vor der eigentlichen Zellanzucht noch eine weitere Vorkultur mit dem Volumen von 100ml verwendet, die mit 1ml der 50ml Kultur angeimpft und über Nacht inkubiert wurde. Mit dieser Übernachtkultur erfolgte dann das Überimpfen auf 1000ml MM + Glycerin auf eine OD 600 von 0,05. Die Zellen wurden dann bis zu einer OD 600 von 0,8-1,0 inkubiert. Die Zellernte sowie Lagerung erfolgte wie unter 2.2.1 beschrieben.

2.2.4 Fermentation

Die Anzucht von SK1/pBWU13 zur Präparation von Wiltyp-F 1 erfolgte in 30l Minimalmedium mit Glycerin. Das Glycerin bewirkt eine erhöhte ATPase Menge in den Zellen, abhängig von der Länge der Generationszeit beim Wachstum (Kasimoglu et al., 1996). Das Medium im Fermenter (Braun, Melsungen) wurde dabei mit einem entsprechenden Vorkultur-Volumen angeimpft, um eine OD ⁶⁰⁰ von 0,1 zu erhalten. Die Zellen wurden bei 39°C fermetiert, da die erhöhte Temperatur Einfluss auf eine höhere Kopienzahl der Plamide in den Zellen hat. Sobald die Wachstumskurve die spätlogarithmische Phase erreicht und zur stationären Phase übergeht, wurde die Zellsuspension mit einem Pellicon Filtrationssystem (Millipore, Bedford) auf ein Volumen von 4l konzentriert und anschließend 30min bei 8500rpm im Sorvall-Rotor SLA 3000 zentrifugiert. Die Zellen wurden dann in Flüssigstickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.

2.2.5 Präparation von Dauerkulturen

Für die Herstellung von Dauerkulturen in Glycerin wurden 885μl einer Übernacht-Kultur mit 115μl 87% (v/v) Glycerin versetzt und nach vortexen in Flüssigstickstoff schockgefroren. Für die Herstellung von Dauerkulturen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kryoprotektant wurden 800μl einer Übernachtkultur verwendet und mit 70μl DMSO gemischt und ebenfalls in Flüssigstickstoff schockgefroren. Die Lagerung der Dauerkulturen erfolgte bei -80°C.

2.2.6 Komplementationstest

Um die Funktionalität der ATP-Synthase zu überprüfen oder um zu kontrollieren, ob es sich um den passenden Phänotyp der Transformanden als auch der konstruierten Mutanten handelt, erfolgten Einzelkolonieausstriche auf diversen Selektionsplatten. Dabei wurde das Wachstum der Zellen in einem Zeitrahmen von ca. 72 Stunden betrachtet. Zur qualitativen Überprüfung der Funktionalität der ATP-Synthase in Syntheserichtung wurden MM + Succinat, MM + Glucose, LB-Festmedium + Carb und LB-Festmedium verwendet. Zur Überprüfung einer erfolgreichen Konstruktion einer Mutante wurden zudem noch LB + Sm in unterschiedlichen Konzentrationen bzw. LB + Kan verwendet. Untersucht wurde das Wachstum immer im Vergleich zu einer geeigneten Positiv- und Negativkontrolle.

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2.3 Molekularbiologische Methoden (Sambrook et al., 1989)

2.3.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Für die Kolonie-PCR wurde das Taq-Polymerase-Kit (Qiagen) verwendet. Das Pipettierschema sowie das PCR-Programm im Thermocycler sind nachfolgend in Tabelle 5 dargestellt. Das Zellmaterial wurde mit einem Zahnstocher von einer Kolonie entnommen, in 30μl H 2 O gelöst und bei 99°C für 5min inkubiert (Template). Für eine Kontroll-PCR von konstruierten Mutanten wurde ebenfalls Zellmaterial von einer Kolonie entnommen und ein halber PCR-Ansatz benutzt.

Für die Gewinnung einer rpsL-Kan-Kassette wurde eine PCR durchgeführt mit einem halbem PCR-Ansatz und Extag Polymerase. Anstelle des Templates 2μl PCR-Produkt verwendet.

Tab. 5: Pipettierschema der Kolonie-PCR und das verwendete PCR-Programm. Die Elongationszeit

variiert abhängig von der Größe des gewünschten PCR-Produktes (1min/kb).

2.3.2 Präparation von Plasmid-DNA

Für die Präparation von Plasmid-DNA wurde das Qiagen Spin Miniprep Kit von Qiagen verwendet. Sie erfolgte nach Angaben des Herstellers aus einer 5ml LB-Übernacht-Kultur + Antibiotikum, wobei für die Elution 30μl steriles H 2 O verwendet wurden.

2.3.3 Restriktion von Plasmid-DNA

Die Restriktion erfolgte mit Restriktionsenzymen und Puffern der Firma

New England Biolabs (NEB), wobei der für jedes Enzym passende Puffer verwendet wurde. Für einige Enzyme ist außerdem die Zugabe von BSA erforderlich. Die Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die bestimmte Sequenzen der dsDNA erkennen können und diese sequenzspezifisch schneiden. So wird das gewünschte DNA-Fragment erhalten. Die Inkubationsdauer der Restriktion betrug 1h bei 37°C. Für die Restriktion von Vektor-DNA wurde nach der Restriktionsspaltung 1μl alkalische

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Phosphatase hinzugefügt (CIP = calf intestinal phosphatase von NEB) und erneut bei 37°C für 30 min inkubiert. Die alkalische Phosphatase dephosphoryliert die DNA-Enden der restringierten Fragmente, um eine Religation zu vermindern. Für die Kontrollrestriktionen wurde jeweils ein halber Restriktionsansatz verwendet.

2.3.4 Agarose-Gelelektrophorese

Für die Auftrennung der

Gelelektrophorese wurde der Restriktionsansatz mit je 1 μl 10-fachem Probenaufgabepuffer (PAP) pro 10 μl versetzt und dann auf ein 1,2% (w/v)iges Agarosegel aufgetragen. Dabei richtet sich die Konzentration der Agarose im Gel nach der Größe der aufzutrennenden Fragmente. Durch den „Siebeffekt“ der verknüpften Agarosepolymere laufen kleine DNA-Fragmente schneller als große. Zum Größenvergleich wurde der Standard „Gene-Ruler“ der Firma Fermentas verwendet. Anschließend wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt, da Ethidiumbromid-Lösung eine in die DNA interkalierende Substanz ist. Bei der Interkalation verändert sich sein Emmissionsspektrum und mittels UV-Licht (320 nm) können die DNA-Fragmente sichtbar gemacht werden. Das Gel wurde photographiert und die zur Ligation oder Sequenzierung benötigten Fragmente ausgeschnitten. Die verwendeten Puffer und Lösungen sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

Tab. 6: Verwendete Puffer, Gele und Lösungen

2.3.5 Gel-Extraktion

Die ausgeschnittenen DNA-Fragmente wurden mittels QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers extrahiert. Die Elution der DNA-Fragmente erfolgte anschließend mit sterilem 30μl H 2 O.

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2.3.6 Ligation

Die Ligation wurde entsprechend des Pipettierschemas angesetzt und

über Nacht bei 16°C im Thermoblock inkubiert. Anschließend wurden mit dem kompletten Ligationsansatz kompetente E. coli DH5α-Zellen transformiert, da dieser Stamm eine gute Kompetenz nach Ca 2 Cl-Behandlung besitzt. Des Weiteren ist auch dessen recA Gen deletiert, wodurch der Stamm nicht zur homologen Rekombination fähig ist. Daher wird eine stabile Ausbeute von rekombinanten Plasmiden ermöglicht. Eine stabile hochfrequente Replikation der Plasmide wird durch Mutationen in Genen von unspezifischen Endonukleasen (endA, hsdR) gewährleistet.

2.3.7 Herstellung chemisch kompetenter Zellen mittels CaCl 2

Bei der Herstellung von chemisch kompetenten DK8-Zellen mittels 50mM CaCl 2 wurden 100ml LB-Medium mit einer DK8-Übernachtkultur im Verhältnis 1:100 angeimpft und bis zu einer OD von 0,4 bei 37°C kultiviert. Die 100ml Kultur wurde danach auf zwei Zentrifugen-Röhrchen verteilt und bei 4°C für 8min mit einer Umdrehung von 3500rpm in der Megafuge 1.0R von Heraeus Instruments zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 2ml 50mM kalten Calciumchloridlösung resuspendiert. Die Calciumionen verändern dabei die Permeabilität der Zellmembran und steigern somit das Aufnahmepotenzial der Bakterienzelle für die DNA. Anschließend erfolgte die Inkubation für 30min auf Eis. Nach erneuter Zentrifugation unter gleichen Bedingungen wurde das Pellet mit 2,5ml 50mM CaCl 2 resuspendiert und 10min auf Eis inkubiert. Danach wurden 650μl 87% (v/v) iges Glycerin dazugegeben, als Kryoprotektant. Es wurden jeweils 150μl Aliquots auf Reaktionsgefäße verteilt und in Flüssigstickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte dann bei -80 °C.

2.3.8 Transformation durch Hitzeschock

Für die Transformation wurden 150μl CaCl 2 -kompetente Zellen mit jeweils 1μl Plasmid (Tab. 2) oder einem gesamten Ligationsansatz versetzt und anschließend 30min auf Eis inkubiert. Die chemische Kompetenz reduziert die abstoßenden Kräfte zwischen negativ geladener Membran und der ebenfalls negativ geladenen DNA. Als Hitzeschock diente im Anschluss daran die Inkubation für 1min bei 37°C. Danach wurden die Bakterien noch für 2min auf Eis gestellt und zur Selektion der gewünschten Transformanden direkt auf LB-Festmedium mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert. Für ein Wachstum der Zellen unter Selektionsdruck wurden die Platten bei 37°C über Nacht inkubiert. Bei der gleichzeitigen Transformation von drei Plasmiden wurden schon von vornherein 2μl der Plasmide verwendet und dann auf LB-Medium mit den notwendigen Selektionsantibiotika ausplattiert. Bei Ligationsansätzen wurde zuvor 1h bei 37°C mit LB-Medium inkubiert, zentrifugiert und dann erst ausplattiert.

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

2.3.9 Konstruktion neuer Plasmide

Aus den bereits vorhandenen Plasmiden pCDFDuet-1 und pET22-atpH erfolgte die Konstruktion des neuen Plasmids pCDFDuet-atpH mittels Umklonierung. Dabei stellte pCDFDuet-1 das Vektorfragment und aus pET22-atpH wurde atpH als Insert verwendet. Von der Plasmid-DNA für das Vektorfragment wurden 5μl und für das Insert 10μl verwendet. Die Plasmide wurden mit AvaI und NdeI restringiert (vgl. 2.3.3) und die erhaltenen Fragmente der Größe 3725bp (Vektorfragment) und 570bp (Insert) ligiert (vgl. 2.3.6). Das fertige Plasmid wurde mittels Restriktionen kontrolliert, wobei es nochmals mit AvaI/NdeI als auch mit HindIII bzw. BssHII geschnitten wurde. Die finale Bestätigung der richtigen Konstruktion erfolgte per Sequenzanalyse, welche extern durch die Firma Sequlab (Göttigen) mit Hilfe des Primers Nr. 9 durchgeführt wurde.

2.3.10 Herstellung elektrokompetenter Zellen

Da die Elektroporation meist effektiver ist als die chemische Transformation, werden sie häufig für schwierigere Transformationen verwendet. Dafür müssen die Bakterien zunächst entsalzt werden, da sonst ein Kurzschluss bei der Elektroporation stattfinden würde. Für die Herstellung elektrokompententer Zellen nach dem Electoporator II Manual (Version 3.0) von Invitrogen wurden zunächst 5ml LB-Medium gegebenenfalls mit Antibiotikum und mit Zellmaterial des gewünschten Stammes angeimpft und bei 37°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurde 1ml der Übernachtkultur auf 100ml LB (+ Antibiotikum) übergeimpft und die Zellen wurden bis zu einer OD ⁶⁰⁰ von 0,5-0,6 bei 37°C angezogen. Die Bakterienkultur wurde auf zwei vorgekühlte Reaktionsgefäße á 50ml verteilt und für 30min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen einigen Waschschritten unterzogen, um die Ionen des Mediums zu entfernen. Die Zellen wurden dazu bei 3500rpm für 15min und 4°C zentrifugiert und das Pellet mit 50ml kaltem, sterilem H 2 O resuspendiert. Es wurde abermals zentrifugiert und dann mit 25ml kaltem, sterilem H 2 O resuspeniert. Nach dem sich daran anschließenden erneuten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand vorsichtig verworfen, da die Zellen in den Pellets zu diesem Zeitpunkt relativ instabil sind. Diese Zellen wurden dann zur Stabilisierung in kalten, sterilen 10% (v/v) igem Glycerin resuspendiert und in einem vorgekühlten 15ml Reaktionsgefäßen vereinigt. Nach einer erneuten Zentrifugation für 15min, 4°C und 4000rpm wurde das Pellet in 200μl kaltem, sterilem 10% (v/v) igen Glycerin durch Vortexen resuspendiert, die Zellsuspension in 80μl Portionen aliquotiert und auf Eis gestellt. Die elektrokompetenten Zellen wurden zum einen direkt für die Elektroporation verwendet und die übrigen Portionen wurden zum anderen für die weitere Verwendung in Flüssigstickstoff schockgefroren und dann bei -80°C gelagert.

2.3.11 Transformation durch Elektroporation

Für die Elektroporation das HindIII/AfeI-Fragments aus pBWU13.∆c-β-His wurde die eluierte DNA im SpeedVac-Konzentartor für 20min auf mittlerer Temperaturstufe getrocknet. Die mit dem SpeedVac-Konzentrator eingedampften linearen Fragmenten wurde mit elektrokompetenten Zellen versetzt oder zu den aliquotierten elektrokompetenten Zellen wurde 1μl Plasmid-DNA gegeben. Der Ansatz wurde anschließend in eine Elektroporationsküvette (BioRad) überführt und auf Eis gestellt. Die Elektroporation erfolgte bei 1,25kV im GenePulser ^TM von BioRad und die Bakteriensuspension wurde daraufhin mit 1ml LB versetzt. Nach Überführung dieser in ein Reaktionsgefäß fand die Inkubation im

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Thermomixer bei 30°C (Plasmid pKD46) oder 37°C für 1h bei 600rpm statt. Anschließend wurden die Zellen bei 4000rpm für 3min zentrifugiert und das Pellet mit dem verbleibenden Medium resuspendiert. Zur Selektion der Transformanden wurde die Suspension auf eine Selektionsplatte ausplattiert und unter dem Selektionsdruck über Nacht bei 30°C (Plasmid pKD46) oder 37°C inkubiert. Wenn das Ereignis einer homologen Rekombination stattfinden sollte, wurde zudem das Pellet noch mit 300μl LB resuspendiert. 150μl davon wurden sofort auf einer Selektionsplatte ausplattiert und die anderen 150μl für 24h bei RT inkubiert und erst danach ausplattiert. Die Selektionsplatten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert.

2.3.12 Konstruktion der Deletionsmutante DP2 (Datsenko & Wanner, 2000)

Für die chromosomale Deletion eines Gens durch Insertion einer Resistenzkassette wurde die von Datsenko und Wanner (2000) beschriebene Methode verwendet. Dabei kann über homologe Rekombination mit Hilfe des Lambda-Red-Rekombinase-Systems DNA in das Chromosom eingebracht werden. Dieses System ist auf dem Helferplasmid pKD46 codiert und befindet sich unter Kontrolle des Arabinose-Promotors P araBAD . Unter Zugabe von Arabinose während des Wachstums werden die darauf codierten Gene γ, β und exo exprimiert. Darüber hinaus ist der Replikationsursprung von pKD46 temperatursensitiv, sodass bei Temperaturen von über 30°C das Plasmid nicht repliziert wird. Somit kann durch eine Inkubation bei höheren Temperaturen die Zahl der Plasmide während des Zellwachstums ausgedünnt werden und das Plasmid geht dadurch verloren. Als Grundlage zur Konstruktion von DP2 wurde der Stamm EB12 verwendet und durch Elektroporation mit pKD46 transformiert. Gleichzeitig wurde das Template rpsL-Kan-Kassette mit den Primern Nr.7 und Nr.8 per PCR vervielfältigt. Das so entstandene PCR-Produkt von 1419bp wurde durch Elektroporation in kompetente EB12/pKD46 eingebracht und zur Selektion auf LB+Kan (12,5μg/ml) ausplattiert. Bei einer homologen Rekombination ist die Folge, dass die Mutante nun eine Kanamycin-Resistenz besitzt und so selektiert werden kann. Im Folgenden wurde mittels Komplementationstests, inkubiert bei 42°C, zum einen der Phänotyp der Transformanden überprüft, als auch das Helferplasmid pKD46 entfernt. Wichtig ist dabei, dass der erste Komplementationstest häufig noch fehlerhafte Ergebnisse liefert, da der Hintergrund der Selektionsplatte enorm hoch ist, da mit hohen Zellkonzentrationen gearbeitet wird, können Zellen beim Einzelkolonieausstrich mitgenommen werden, die nicht den gewünschten Phänotyp haben. Deshalb wurden von der ersten Kan-Komplementationstestplatte Zellen für den zweiten Komplementationstest entnommen. Eine Mutante mit positiv getestetem Phänotyp wurde letzten Endes ausgewählt, mit den Primern Nr. 5 und Nr.6 sowie Nr.5 und Nr.3 per Kolonie-PCR kontrolliert und unter dem Namen DP2 als Dauerkultur zur Plasmidsammlung hinzugefügt. Zudem wurde die Streptomycin-Sensitivität der Mutante mit reverser Kassette getestet, um eventuell die hohen Streptomycin-Konzentrationen bei der Mutante KB3 umgehen zu können, die nur bei 1500μg/ml Sm selektiert werden kann.

2.3.13 Konstruktion der ∆c„knock-out“ Mutante DP1 (Datsenko & Wanner, 2000)

Bei der Konstruktion der „knock-out“ Mutante DP1 wurde ebenfalls die von Datsenko und Wanner (2000) beschriebene Methode verwendet (siehe 2.3.12). Dabei wurde die in KB3 vorhandene rpsL- Kan-Resistenzkassettemit DNA ersetzt, die das ∆c-„knock-out“-Gen mit drei Stopp-Tripletts sowie ein

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

His 6 -tag an β besitzt. Es wurde von dem Plasmid pBWU13.∆c-β-His das Fragment HinIII/AfeI (6061bp), gelelektrophoretisch aufgetrennt und anschließend aus dem Agarosegel extrahiert sowie im SpeedVac eingedampft. Gleichzeitig wurden elektrokompetente KB3 mittels Elektroporation mit pKD46 transformiert und nach Selektion ebenso elektrokompetent gemacht. Diese elektrokompetenten KB3/pKD46 Zellen wurden dann mit dem DNA-Fragment versetzt und elektroporiert. Das Fragment sollte sich in die homologen Bereiche von atpI und atpD im Chromosom integrieren und somit die Kassette ersetzen. Die Selektion der Transformanden erfolgte auf einer LB-Festmediumplatte mit 1500μg/ml Streptomyzin. Da auch hier ein hoher Hintergrund vorhanden ist, wie in 3.2.12, wurde der Komplementationstest ebenfalls mehrfach durchgeführt, ausgehend von der Sm-Platte. Transformanden mit dem übereinstimmenden Phänotyp wurden dann mittels der Primer Nr.1/5, 2/4 und 3/6 per Kolonie-PCR kontrolliert und mit den Primern Nr. 10 und Nr.11 in der Firma Seqlab (Göttigen) sequenziert.

2.4 Biochemische Methoden

2.4.1 Präparative Methoden

2.4.1.1 Präparation von invertierten Membranvesikeln und der Cytoplasma-Fraktion

Für die invertierten Membranvesikel wurden die Zellpellets, welche bei -80°C gelagert wurden, in 25ml TMG-Puffer (bei 1l Anzucht) unter Zugabe einer Spatelspitze DNase für 10min auf Eis resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mittels Zellaufschlussgerät

„constant cell disruption system“ von Daventry mit 1,35kbar aufgeschlossen. Zelltrümmer als auch nicht aufgeschlossene Zellen wurden durch Zentrifugation für 30min bei 4°C mit einer Umdrehung von 17.500rpm im Sorvall-Rotor SS34 pelletiert. Die invertierten Membranvesikel im Überstand wurden dann durch Ultrazentrifugation für 1,5h bei 4°C mit einer Umdrehung von 50.000rpm im Beckman-Rotor Ti50.2 pelletiert. Die Resuspension des Pellets erfolgte in 250μl TMG-Puffer mit einem Marderhaarpinsel. Die Proben wurden in Kryoröhrchen in Flüssigstickstoff schockgefroren und gelagert oder gegebenenfalls direkt die ATPase Aktivität gemessen.

Für die Präparation des Cytoplasmas wurden die bei -80°C gelagerten Zellen in 50ml TMG-Puffer (bei 5l Zellanzucht) oder nacheinander 2x50ml TMG-Puffer (bei 10l Zellanzucht) solubilisiert, mit Protease-Inhibitor-Mix (PI-Mix der Firma Sigma) 1:100 versetzt und ebenfalls eine Spatelspitze DNase hinzugefügt. Nach dem Zellaufschluss wurden die Zentrifugationen wie oben beschrieben durchgeführt. Der Überstand wurde, um restlichen Membranvesikel zu entfernen, anschließend in der Mini-Ultrazentrifuge im MLA-80-Rotor bei 80.000rpm für 1h bei 4°C zentrifugiert. Aus dem so behandelten Überstand wurden dann diverse Untereinheiten der ATP-Synthase mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie (2.4.1.5) gereinigt.

Präparation von F 1 -freien Membranvesikeln (Deckers-Hebestreit et al., 1992) 2.4.1.2

Die angezogenen Zellen wurden wie in 2.2.1 geerntet und zur F 1 -Ablösung in 150ml Puffer 1 resuspendiert. Gleichzeitig wurde zur Zellsuspension eine Spatelspitze DNase hinzugefügt und für

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

10min auf Eis gerührt. Der Zellaufschluss und die Präparation zu invertierten Membranvesikeln erfolgten wie in 2.4.1.1 beschrieben. Das Pellet aus dem Ultrazentrifugationsschritt wurde anschließend in 150ml Puffer 2 resuspendiert und erneut bei 50.000rpm für 2h Ti50.2-Rotor pelletiert. Danach erfolgte die Resuspension des Pellets in 140ml Puffer 3, der die niedrigste Ionenstärke besitzt und der eigentliche F 1 -Ablösepuffer ist. Die Suspension wurde dann über Nacht bei 4°C unter ständigem Rühren inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurde die Lösung jeweils 3x nacheinander 2h Stunden bei 50.000rpm zentrifugiert, dazwischen jeweils in Puffer 3 resuspendiert und 1h bei RT gerührt. Zum Schluss wurde das Pellet aus der letzten Zentrifugation in 4ml Puffer 1 resuspendiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren sowie gelagert. Während jedes einzelnen Zwischenschritts wurde jeweils eine Probe abgenommen, um den Verlauf der Ablösung zu kontrollieren, den Proteingehalt zu bestimmen und die ATPase-Aktivität zu messen.

Tab. 7: Verwendete Puffer für die F 1 -Ablösung

Präparation von Wildtyp-F 1 aus SK1/pBWU13 (modifiziert nach Wise, 1990) 2.4.1.3

100g Zellen wurden in 360ml Puffer W1 mit einer Spatelspitze DNase resuspendiert und mittels Homogenisator resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen im Zellaufschlussgerät „constant cell disruption system“ von Daventry mit 1,35kbar durch zweimalige Passage aufgeschlossen. Durch Zentrifugation für 30min mit 20.000rpm im Sorvall-Rotor SS34 oder mit 17.000rpm im SA600-Rotor bei 4°C wurde die Suspension von größeren Zelltrümmern bzw. nicht aufgeschlossenen Zellen befreit und der Überstand für 1,5h bei 50.000rpm im Ti50.2 (Beckman) bei 4°C pelletiert. Das Pellet wurde mit jeweils 560ml Puffer W3 bzw. W4 gewaschen, unter denselben Parametern wie bei dem vorhergehenden Schritt zentrifugiert und dann ÜN bei 4°C gelagert. Am nächsten Tag erfolgte die F 1 -Ablösung mit Hilfe von 560ml Puffer W5 . Nach erneuter Zentrifugation wurde der Überstand, bei dem es sich um den EDTA-F 1 -Rohextrakt handelt, mit 1mM ATP und 1mM MgCl 2 versetzt, auf eine Säule mit DEAE-650S-Säulenmaterial (Toyopearl, TOSOH, Japan) zur Durchführung einer Ionenaustauschchromatographie gebracht. Dabei wirkt die Diethylaminoethyl-Gruppe, die an die Matrix gekoppelt ist, als schwacher Anionen-Austauscher, an den das negativ geladene F 1 bindet. Nach Waschen der Säule mit Puffer WA wurde der F 1 -Komplex mittels verschiedener ^- stärkere Affinität zum posi-Konzentrationen des Puffers WB eluiert, wobei das darin enthaltene SO 4

tiv geladenen Ionenaustauscher besitzt und dadurch die Elution erfolgt.

Zur Konzentrierung des gereinigten F 1 wurde es ÜN bei 4°C mit 70% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt und am nächsten Tag zentrifugiert. Das dabei erhaltene Pellet wurde in 500μl End-Puffer resuspendiert und nach Protein- sowie Aktivitätsbestimmung in Flüssigstickstoff gelagert.

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Tab. 8: Verwendete Puffer für die F 1 -Präparation

Präparation von F 1 aus DK8/pBH7.1-Membranvesikeln 2.4.1.4

Die Ablösung erfolgte nach der Vorschrift zur F o -Präparation von Schneider und Altendorf (1984) mit einigen Abänderungen, um schließlich F 1 zu erhalten. Dabei wurden dieselben Puffer wie in 2.4.1.2 verwendet. Die Präparation erfolgte, inklusive der ÜN-Inkubation, ebenfalls wie in 2.4.1.2 beschrieben, wobei aber jeweils nur 1h in der Ultrazentrifuge zentrifugiert wurde. Ab dem zweiten Tag wurde dann das Protokoll abgeändert. Die MV in Puffer 3 wurde nun für 1,5h im Ti50.2-Rotor (Beckman) zentrifugiert und der dabei erhaltene Überstand wurde in der Mini-Ultrazentrifuge (Beckman) im MLA-80 Rotor für 1h mit 80.000rpm zentrifugiert. Vom Überstand wurde dann das Volumen und der Proteingehalt bestimmt und mit Hilfe des Puffers A aus 2.4.1.5 auf 1mg/ml verdünnt, nachdem die Suspension auf 20mM Imidazol eingestellt wurde. Anschließend wurde, wie in 2.4.1.5 beschrieben, das F 1 durch eine Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt.

2.4.1.5 Reinigung von F 1 -Komplexen mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie

Für die Reinigung der teilassemblierten F 1 -Komplexe, als auch für das abgelöste F 1 aus 2.4.1.4, mit Hilfe der Ni-NTA-Affinitätschromatographie ist es notwendig, dass die F 1 -Komlexe His-Tags besitzen die affin an die Ni ²⁺ -Ionen der Ni-NTA-Sepharose binden. Der His 6 -Tag befindet sich am N-Terminus der β-Untereinheit, sodass bei Assemblierung der anderen Untereinheiten mit β der Komplex gereinigt werden kann. Zur Reinigung wurde entsprechend vorbereitete (Tab. 10) Ni-NTA-Sepharose (NiSepharose 6 FastFlow, GE Healthcare) verwendet, mit einem Bettvolumen von 1ml. Das Säulenmaterial wurde in eine Leersäule gegeben und mit 30ml Puffer A äquilibriert. Das auf 20mM Imidazol und auf einen Proteingehalt von 1mg/ml mittels Puffer A eingestellte Cytoplasma wurde über Nacht per peristaltischer Pumpe bei 4°C über die Säule gepumpt, damit das Protein an die Matrix binden kann. Die beladene Säule wurde dann an die „Fast protein liquid chromatography“-Anlage (FPLC, ÄKTA Prime, Amersham Pharmacia Biotech) angeschlossen und mit Puffer A bis zum Erreichen der Basislinie gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein zu entfernen. Um das

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

spezifisch gebundene Protein zu eluieren, wurde Puffer B mit einer Konzentration von 300mM Imidazol und einer Flussrate von 1mg/min verwendet. Das Eluat wurde in Fraktionen von 1ml aufgefangen. Die erforderliche Imidazolkonzentration im Puffer B wurde in Vorversuchen anhand eines linearen Gradienten bestimmt. Das darin enthaltene Imidazol verdrängt die Proteine mit den His-tags, da Imidazol eine höhere Affinität, als auch eine höhere Konzentration besitzt als Histidin. Damit überprüft werden kann, in welchen Fraktionen sich die gereinigten Proteine befinden, wurde die gesamte Zeit die Absorption bei 280nm des Eluats gemessen. Die detektierten Fraktionen wurden anschließend auf ATPase Aktivität getestet, um zu bestätigen, dass es sich um aktive F 1 -Komplexe handelt. Die relevanten Fraktionen wurden vereinigt, mit PI-Mix (Sigma) 1:100 versetzt und mit Hilfe eines Zentricons (Amicon Ultra-4, Millipore, 100kDa) mit 3000rpm auf ein Endvolumen von 500μl ultrafiltriert. Über eine entsprechend vorbereitete (Tab. 10) Nap5-Säule (GE Healthcare) wurde im Anschluss daran das Imidazol ausverdünnt. Dazu wurde die Probe aufgetragen und mit 800μl TMG-Puffer eluiert. Nach jedem einzelnen Zwischenschritt wurde eine Probe abgenommen und erneut die ATPase-Aktivität bestimmt, damit der Verlust an Gesamtaktivität [U]=[μmol/min] , spezifischer Aktivität [U/mg]=[ μmol/(min*mg)] oder auch Protein verzeichnet werden konnte. Die Endprobe wurde in Flüssigstickstoff schockgefroren sowie gelagert. Zuvor wurde noch eine Probe abgenommen und zur Detektion der einzelnen Untereinheiten sowohl eine SDS-PAGE (2.4.2.4) als auch eine Immunoblotanalysen (2.4.2.6) durchgeführt.

Tab. 9: Vorbereitung der Ni-NTA-Sepharose, Nap5-Säule und verwendete Puffer

2.4.1.6 Reinigung von δ bzw. ε mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Bei der Aufreinigung von δ bzw. ε wurde das Cytoplasma aus jeweils 5l HB1/pET22-atpC-His oder HB1/pET22-atpH-C-His wie in 2.4.1.1 beschrieben präpariert, abzüglich des Ultrazentrifugationsschrittes mit 80.000rpm. Das Cytoplasma wurde auf 5mM Imidazol sowie 150mM NaCl eingestellt und mit dem vorbereiteten Säulenmaterial (Tab. 11), welches auf zwei 50ml Reaktionsgefäße verteilt wurde, vereinigt. Die Bindung der Proteine an die Matrix mittels His-tag erfolgte im „batch“-Verfahren bei dem 1h lang bei 4°C „end over end“ inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurde für 8min bei 4000rpm das beladene Säulenmaterial pelletiert und der Überstand bis auf 5ml pro Reaktionsgefäß verworfen. Beide Proben wurden vereinigt, in eine Leersäule gegeben und mit 10ml Bindepuffer äquilibriert, sowie an die FLPC-Anlage angeschlossen (ÄKTA Prime, Amersham Pharmacia Biotech). Anschließend wurde die Matrix mit 10ml Puffer A gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Die spezifisch gebundenen Proteine wurden dann mit Hilfe eines linearen Gradienten mit Konzentrationen von 0-100% Puffer B eluiert. Dabei betrug das Volumen 20ml, die Flussrate 1mg/min und die Fraktionsgröße 1ml. Um sicher zu gehen, dass alle Proteine von der Säule eluiert wurden, wurde zum Schluss mit Puffer C eingesetzt. Während der Reinigung wurde die gesamte Zeit die Absorption des Eluats bei 280nm gemessen, damit die einzelnen Fraktionen mit Protein identifiziert werden konnten. Diese Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die, die das gewünschte Protein δ bzw. ε enthielten, wurden vereinigt, konzentriert mittels Zentricon (Amicon Ultra-4, Millipore, 10kDa) unter Zugabe von PI-Mix (Sigma), wobei 2x mit 4ml TMG-Puffer ausverdünnt und erneut konzentriert wurde zur Entfernung des Imidazols. Die Ultrafiltration erfolgte bei 2000rpm statt, bis jeweils auf ein Probenvolumen von 500μl. Im Anschluss daran wurde eine Probe zur Proteinbestimmung und Immunoblotanalyse abgenommen. Die gereinigten Proteine wurden in Flüssigstickstoff schockgefroren und gelagert.

Tab. 10: Präparation der Ni-NTA-Sepharose und verwendete Puffer

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Rückbindung von F 1 an F 1 -freie Membranvesikel (Deckers-Hebestreit et al., 1992) 2.4.1.7

Zur Rekonstitution der ATP-Synthase wurden 1mg F 1 -freien ML308-225 Membranvesikeln mit 12,5U teilassemblierte F 1 -Komplexe aus 2.4.1.2 versetzt. Dies erfolgte in 2,5ml

Rekonstitutionspuffer. Der Ansatz wurde anschließend bei 37°C für 20min inkubiert. Nach der Inkubation wurden 4,5ml des Puffers hinzugefügt. Um nicht gebundenes F 1 von der Membran zu trennen erfolgte die Zentrifugation für 1,5h bei 70.000rpm in der Ultrazentrifuge (Beckman). Das Pellet wurde dann in 7ml Rekonstitutionspuffer resuspendiert und erneut in gleicher Weise pelletiert. Zum Schluss wurde das nun von ungebundenem Protein befreite Pellet in 500μl des Puffers resuspendiert und der Proteingehalt bestimmt. Um den Erfolg der Rekonstitution zu überprüfen, wurde die ATPase- Aktivität unter DCCD-Inhibierung (2.4.2.2) sowie die ATP getriebene Protonentranslokation (2.4.2.3) ermittelt.

2.4.2 Analytische Methoden

2.4.2.1 BCA-Proteinbestimmung

Für die Bestimmung des Proteingehalts erfolgte die BCA-Proteinbestimmung mit halbem Ansatz nach Angaben des Herstellers (Pierce/KMF). Die Bestimmung wurde zweifach durchgeführt. Als Referenzprotein für die Kalibrierung wurde Rinderserumalbumin (2 mg/ml) benutzt, welches für die Eichgrade in den Mengen von 0 bis 25 μg eingesetzt wurde. Von den Proben wurde jeweils ein passendes Volumen gewählt. Die Messung der Extinktion erfolgte nach 30minütiger Inkubation bei 562nm.

ATPase-Aktivitätsmessung (Arnold et al., 1975) 2.4.2.2

Die quantitative Überprüfung der katalytischen Aktivität der ATP-Synthase in Hydrolyserichtung

erfolgte in invertierten Membranvesikeln mittels ATPase-Aktivitätsmessung nach Arnold et al. (1975). Durch die „insideout“ Orientierung der Vesikel und die damit verbundene Anordnung des eigentlich cytoplasmatischen F 1 -Komplexes an der Außenseite, ist es möglich ATP hinzuzufügen, welches dann hydrolysiert wird. Das dabei entstehende anorganische Phosphat (P i ) reagiert bei diesem Messverfahren mit dem Molybdatreagenz zu einem optisch aktiven Komplex, welcher nach Reduktion durch Ascorbat bei 578nm im Photometer detektierbar ist. Nach vorheriger Eichung mit Hilfe eines Standards (Tab. 12) wurde der

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Messansatz nach folgendem Pipettierschema hergestellt, wobei ein

jeweils geeignetes Volumen an Membranvesikel verwendet wurde. Die photometrische Detektion wurde mit einem Linearschreiber aufgezeichnet, sodass die spezifische ATPase-Aktivität der ATP-Synthase in μmol P i · min ^-1 · mg ^-1 Protein anhand der resultierenden Steigung bestimmt werden konnte. Für die Überprüfung der DCCDinhibierbaren ATPase-Aktivität wurde die gleiche Menge an Membranvesikeln wie in der vorherigen Messung verwendet. Für den DCCD-Messansatz wurde nebenstehendes Pipettierschema verwendet und nach Zugabe des DCCD zuerst für 20min bei 37°C inkubiert.

Tab. 11: Lösungen der ATPase-Aktivitätsmessung

ATP-getriebene Protonentranslokation (Deckers-Hebestreit et al., 1992) 2.4.2.3

Für die Bestimmung der ATP-getriebenen Protonentranslokation von ATP-Synthasen an Membranvesikeln (2.4.1.6) wurde die Translokation von Protonen mit

Hilfe von ACMA, einem Fluoreszenzfarbstoff, sichtbar gemacht. Dabei wurde die Fluoreszenz durch Licht mit einer Wellenlänge von 410nm angeregt und das emittierende Signal bei 490nm gemessen. Das ACMA ist diffusibel und lokalisiert sich sowohl innerhalb der „inside-out“ orientierten Membranvesikeln als auch außerhalb der Vesikel an. Durch Zugabe von ATP oder NADH, die einen Gradientenaufbau und somit eine Protonentranslokation in das Innere der Vesikel bewirken,

findet eine Fluoreszenzlöschung statt. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Protonen mit dem Stickstoff des Acridingrundgerüstes reagieren und somit eine Resonanzverschiebung verursacht wird. Für die Messungen der Protonentranslokation durch ATP wurden 400μg Membranvesikel mit TMG-Puffer auf 100μl aufgefüllt und mit 900μl ACMA-Puffer versetzt. Nachdem

die Grundlinie (entspricht dem Nullwert) des Ansatzes mit Hilfe des Fluorometers von Aminco aufgezeichnet wurde, wurden 20μl 200μM ACMA dazugegeben, wodurch das Fluoreszenzsignal aufgenommen werden konnte. Anschließend erfolgte die Zugabe von 40μl 0,1M ATP. Nach dem Erreichen der größtmöglichen Fluoreszenzlöschung wurden 20μl gesättigte

Ammoniumsulfat-Lösung hinzugefügt, um zu definieren, welcher prozentuale Anteil auch wirklich auf die ATP-getriebene Protonentranslokation zurückzuführen ist. (NH 4 ) 2 SO 4 wirkt hierbei als Entkoppler und verursacht eine Aufhebung des Protonengradienten, wodurch die protonenabhängige

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Fluoreszenzlöschung des ACMA aufgehoben wird. Zur Überprüfung einer intakten Kopplung des F o -Teils mit dem F 1 -Bereich wurden außerdem Messungen mit DCCD inhibierten ATP-Synthasen durchgeführt. Dazu wurde 400μg Membranvesikel auf 50μl mit TMG-Puffer aufgefüllt und mit 450μl ACMA-Puffer versehen. Zudem wurden 4μl 10mM DCCD (in Ethanol gelöst) hinzugefügt und der Ansatz wurde für 20min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Danach wurden weitere 50μl TMG-Puffer und nochmals 450μl ACMA-Puffer hinzugegeben, um auf das 1ml Messvolumen, wie bei der vorangegangenen Messung zu kommen und ebenfalls im Fluorometer in gleicher Weise detektiert. Für Messungen der ATPase unabhängigen Protonentranslokation und um damit verbunden die Durchlässigkeit der Membranvesikel zu testen, wurden die Proben außerdem unter Zugabe von NADH überprüft. NADH wird über die NADH-Dehydrogenase oxidiert. Auf diese Weise kann der Protonengradient durch die Atmungskette aufgebaut werden. Dabei wurden die Proben gleichermaßen angesetzt wie zuvor beschrieben, mit der Abweichung, dass nur 200μg Protein, gegebenenfalls 2μl DCCD und anstelle des ATP 10μl 0,01M NADH verwendet wurde.

2.4.2.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Schägger & von Jagow, 1987)

Bei der SDS-PAGE erfolgt die Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht in 10%igen Gelen (Tab. 13). Als Standard dienten hierbei 2μl des PageRuler ^TM (Prestained Protein Ladder) der Firma Fermentas. Die eingesetzten Puffer sind in Tabelle 14 aufgelistet. Durch die Verwendung des Lämmli-Probenaufgabepuffers lagert sich das darin enthaltene SDS an die Proteine an und durch die daraus resultierende Aufhebung ihrer nichtkovalenten Bindungen werden sie denaturiert. Die Anlagerung folgt einer gleichmäßigen Verteilung von 1,4g SDS pro g Protein, wodurch die Proteine in der Probe anschließend ein gleiches Masse/Ladungs-Verhältnis besitzen. Dadurch nimmt in der Regel nur noch die Größe Einfluss auf die Auftrennung in der SDS-Gelelektrophorese. Die aufgetrennten Proteine wurden entweder direkt mit Coomassie-Blau gefärbt oder mittels Immunoblotanalysen ausgewertet. Für Gele, die anschließend mit Coomassie-Blau gefärbt wurden, wurde der PageRuler ^TM Unstained Protein Ladder verwendet.

Tab. 12: 10%ige SDS-Polyacrylamidgele (6 Stück). Die Zugabe von APS erfolgte erst kurz bevor das

Gelgegossen wurde, da dieses die Polymerisierung verursacht.

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Tab. 13: Verwendete Puffer bei der SDS-PAGE

Zur Bestimmung von Proteinen wurde die Coomassie-Blau Färbung verwendet. Sie ermöglicht einen Vergleich zwischen einzelnen Proteinbanden im SDS-Gel. Die

Intensität der Färbung ist proportional zur Anzahl der positiven Ladungen im Protein (Tal et al., 1985). Die SDS-Gele wurden mit Hilfe der Färbelösung angefärbt und anschließend mehrmals mit H 2 O unter Erhitzen in der Mikrowelle entfärbt, bis der Gelhintergrund komplett

ungefärbt ist. Anschließend wurden die Proteinbanden mit dem Standard verglichen, die Gele zur Dokumentation gescannt und gegebenenfalls für die Massenspektrometrie weiterverwendet.

Immunoblotanalyse (Birkenhäger et al., 1999) 2.4.2.5

Bei der Immunoblotanalyse wurden die auf dem SDS-Gel vorhandenen Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Porengröße von 0,45μm; Schleicher & Schuell) übertragen. Dabei war die Membran vollständig von Blotpuffer umgeben (Tab. 15). Die Übertragung erfolgte bei einer Stromstärke von 1,8 A und einer Temperatur von 4°C für 45 min. Die Membran wurde im Anschluss daran mit Ponceau-Rot-Lösung gefärbt, um den Transfer der Proteine zu kontrollieren und danach mit Wasser entfärbt. Im nächsten Schritt wurde die Transfermembran mit Quenchpuffer für 30 min bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert, um unspezifische Antikörperbindungen einzuschränken. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem primären Antikörper (Tab. 16), der in Quenchpuffer gelöst ist, für 1h bei Raumtemperatur. Wahlweise kann der Vorgang der Antikörperbehandlung auch unter leichtem Schwenken bei 4°C über Nacht erfolgen. Nach der Inkubation wurde die Membran mit Waschpuffer dreimal für 15 Minuten gewaschen und es folgte anschließend die Inkubation unter Schwenken mit dem sekundären Antikörper (Verdünnung 1:10.000 in Quenchpuffer), welcher mit einem Fluorophor markiert ist. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit Waschpuffer für 15 min erfolgte der Nachweis der Antikörperbindung mit Hilfe des Odyssey-Fluoreszenzscanners der Firma LI-COR.

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

Tab. 14: Puffer und Lösungen für die Immunoblotanalyse

Tab. 15: Primäre und sekundäre Antikörper

2 Material und Methoden Daniela Prätorius

2.4.2.6 Analyse von Proteinen durch Massenspektrometrie

Die Proteine, die mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt sowie mit Coomassie-Blue sichtbar gemacht wurden, wurden zur Massenspektrometrie aus dem Gel und in kleinere Stückchen von etwa 1mm ² geschnitten. Die Gelstückchen wurden dann in Reaktionsgefäße ohne Weichmacher transferiert und zweimal mit 250μl H 2 O dest. für 10min bei 25°C und 750rpm gewaschen. Anschließend erfolgte die Entfärbung mit Hilfe der Entfärbelösung, von der 250μl verwendet wurden und der Ansatz wurde ebenfalls für 10min bei 750rpm im Thermomixer inkubiert. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt bis die Gelstückchen komplett entfärbt sind. Die Gelstücke wurden dann wie oben beschrieben erneut zweimal gewaschen und es erfolgte die Zugabe von 250μl Acetonitril, einem Lösungsmittel, wobei diesmal mindestens für 15min inkubiert wurde, bis die Gelstückchen vollständig weiß wurden. Das Acetonitril wurde komplett entfernt und es wurden 100μl der Reduktionslösung hinzugefügt. Das darin enthaltene DTT hat die Aufgabe die Cystine in den Proteinen zu Sulfhydryl-Gruppen zu reduzieren und die Reoxidation dieser durch Sauerstoff zu verhindern. Dadurch entfaltet sich das Protein. Nach einer Inkubationszeit des Ansatzes von 5min (25°C, 750rpm) wurde die Temperatur auf 50°C erhöht, um die Reaktion zu beschleunigen und noch für weitere 30min inkubiert. Die Reduktionslösung wurde entfernt, erneut 250μl Acetonitril auf die Gelstückchen gegeben und so lange inkubiert, bis diese sich weiß färben. Danach wurde das Acetonitril entfernt, 100μl der Alkylierungslösung dazugegeben und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15min einwirken gelassen. Das Iodacetamid bewirkt dabei eine bewusste Modifizierung der SH-Gruppen im Protein. Diese Alkylierung ist deshalb notwendig, um die Reoxidation zu Cystinen zu verhindern. Bei der massenspektrometrischen Analyse wird die Iodacetamidmodifizierung dann berücksichtigt. Die Akylierungslösung wurde entfernt und es erfolgten zwei weitere Waschschritte für 15min mit der Entfärbelösung. Anschließend wurde die Flüssigkeit komplett entfernt, die Gelstückchen wurden mit ≥100μl frischer Trypsin-Lösung bedeckt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Trypsin spaltet dabei selektiv nach den Aminosäuren Lysin und Arginin. Am folgenden Tag wurde der Überstand entnommen und aufbewahrt. Die Gelstückchen wurden erneut mit Acetonitril für 30 min (25°C, 750rpm) bis zur Weißfärbung behandelt. Nach einer dreiminütigen Beschallung im Ultraschallbad wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit Hilfe des SpeedVac-Konzentrator eingedampft. Dieses Lyophilisat wurde dann mit dem aufbewahrten Überstand gelöst und für 1min in der Eppendorf-Tischzentrifuge bei 13.000rpm zentrifugiert. Vom Überstand wurden 70μl abgenommen und in HPLC-Fläschchen (0,1ml, Sigma-Aldrich, Deisendorf, Germany) überführt. Die Proben wurden zur Analyse extern an Dr. S. Walter (Angewandte Genetik der Mikroorganismen, Universität Osnabrück) ausgehändigt und die erhaltenen Daten wurden mit Hilfe des Programms Biotools 3.1 von Bruker Daltonics (Bremen, Germany) ausgewertet.

Tab. 16: Puffer für die Massenspektrometrie. Die Puffer wurden jeweils frisch hergestellt.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

3 Ergebnisse

3.1 Charakterisierung von ∆c-„knock-out“-Mutanten

Die Untersuchung der Assemblierung wurde an Mutanten von E. coli durchgeführt, deren Synthese der Untereinheit c verhindert wurde. Dabei wurde untersucht, welchen Einfluss die Defizienz der Untereinheit im ATP-Synthase-Komplex auf die Anwesenheit der F 1 -Untereinheiten besitzt und ob diese möglicherweise assoziiert im Cytoplasma vorliegen. Bei den c-defizienten Mutanten wird davon ausgegangen, dass sich so die F 1 -Untereinheiten vermehrt im Cytoplasma ansammeln. Die ∆c-„knockout“-Mutanten wurden in Relation zu entsprechenden Mutanten mit intakter ATP-Synthase gesetzt, bei denen α, β, γ, ε und δ weniger im Cytoplasma erwartet wird, da sie sich direkt an c assemblieren können. Deren Charakteristik ist aber dennoch signifikant und besitzt eine höhere Aussagekraft, weil es sich dabei um eine native Assemblierung handelt. Diese Untersuchungen wurden sowohl plasmidcodiert als auch chromosomalcodiert durchgeführt. Die plasmidcodierten Studien erfolgten im E. coli Stamm DK8, der eine Deletion der Gene atpB-C besitzt. Die Grundlage für die Plasmidkonstrukte war das Plasmid pBWU13, welches die Gene atpB-C des atp Operons aufweist und somit die Deletion in DK8 komplementieren kann. Dabei stellt DK8/pBH7.1 den Wildtyp dar und DK8/pBWU13.∆c-β-His die Mutante mit c-Defizienz. Die Untersuchungen an chromosomal codierten Mutanten erfolgten in Stämmen, die den Stamm EB12 als Basis haben und welche durch das Lambda-Red-Rekombinase-System von Datsenko & Wanner (2000) konstruiert wurden. Dabei handelt es sich im Folgenden um KB5 als Wildtyp und DP1 als ∆c-Mutante. Grundsätzlich sind bei allen Mutanten an die β-Untereinheit ein His-tag angehängt, damit die teilassemblierten Komplexe aus dem Cytoplasma gereinigt werden können. Um die Synthese der Untereinheit c zu verhindern wurden in beide c-defiziente Mutanten frühe Stoppcodons eingeführt, was einen „knock-out“ des jeweiligen Cistrons zur Folge hat. Die Zellen der Mutanten wurden unter Zugabe von Protease-Inhibitor-Mix (Sigma) aufgeschlossen, um dem enzymatischen Abbau der Proteine durch zelleigene Proteasen entgegenzuwirken, wodurch Serin-, Cystein-, Aspartat-, Glutamat- und thermolysinartige Proteasen sowie Aminopeptidasen gehemmt wurden. Des Weiteren wurden zusätzlich Methoden entwickelt, um dem möglichen Abbau von δ entgegenwirken zu können und um die Ursache des Fehlens von δ zu finden, welches auch schon bei Garrels (2008) zu beobachten war.

3.1.1 Funktionelle Charakterisierung von DK8/pBH7.1 und DK8/pBWU13.∆c-β-

His

Für die Analyse, welche F 1 -Untereinheiten im Cytoplasma vorliegen und zur Assemblierung fähig sind, wurden die Mutanten DK8/pBH7.1 (WT) und DK8/pBWU13.∆c-β-His (c-Deletionsmutante) deren atp Operon auf einem Plasmid codiert ist, auf ihre Eigenschaften untersucht. Das verwendete Konstrukt pBWU13.∆c-β-His codiert dabei Stoppcodons an den Positionen cA13stop, cA14stop und cV15stop, wodurch die Translation der mRNA von AtpE verhindert wird. Die Untersuchung der Mutanten wurde nach Transformation und Selektion auf Antibiotikum zunächst auf Zellebene mittels Komplementationstest durchgeführt. DK8 wurde hierbei als Negativkotrolle und DK8/pBWU13 als Positivkontrolle verwendet. Bei der Betrachtung in Syntheserichtung zeigte sich wie erwartet, dass

38

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

DK8/pBH7.1 wie die Positivkontrolle zum Wachstum auf Minimalmedium mit Succinat fähig ist und die c-Deletionsmutante DK8/pBWU13.∆c-β-His nicht. Der Wachstumstest mit Succinat dient zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit der ATP-Synthase (Butlin et al., 1971; Downie et al., 1979) wobei die Grundlage das Succinat als einzige nicht vergärbare Kohlenstoffquelle ist. Dabei wirkt sich das ADP/ATP-Verhältnis auf die Struktur der DNA der Zelle aus (van Workum et al., 1996). Es wird anscheinend bei Mutanten ohne native ATP-Synthase, die Expression eines Repressors verstärkt, welcher die Expression eines C 4 -Dicarbonsäure-Transporters unterdrückt (Boogerd et al., 1998). Daher beruht die Unfähigkeit zum Wachstum auf Succinat wahrscheinlich darauf, dass diese C 4 -Dicarbonsäuren nicht in die Zelle aufgenommen werden können. Wenn die ATP-Synthase intakt ist, erfolgt der Succinat-Abbau über den Citratzyklus. Die hierbei entstehenden Reduktionsäquivalente gehen in die Atmungskette ein, wodurch der elektrochemische Protonengradient aufgebaut wird, welcher dann zur Generierung von ATP genutzt wird. Da die Mutanten den erwarteten Phänotyp aufwiesen erfolgte die Expression der ATP-Synthase in LB-Vollmedium.

Tab. 17: Komplementationstest

(+ Wachstum nach 1-3 Tagen; - kein Wachstum)

Die Messung der optischen Dichte bei 600nm wurde bis zum Eintreten der stationären Phase verfolgt. Durch halblogarithmische Auftragung wurde die Steigung der Ausgleichsgeraden und daraus die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit k bestimmt. Die Verdopplungszeit t d wurde nach Einsetzen von k in die nachfolgende Gleichung berechnet.

Bei der Zellanzucht zeigte sich, dass DK8/pBWU13.∆c-β-His im Vergleich mitDK8/pBH7.1 eine nicht so hohe Dichte erreicht (Abb.21). Die Dopplungszeit wurde für DK8/pBWU13.∆c-β-His mit 109min und für DK8/pBH7.1 mit 92min berechnet und veranschaulicht, dass die c-defiziente Mutante etwa in einem annährend gleichem Maß wächst wie der WT. Dies entspricht nicht den Erwartungen, da die Mutante mit „knock-out“ in c keine intakte ATP-Synthase aufweist und dementsprechend langsamer wachsen sollte. Im Folgenden wurde das Cytoplasma präpariert und die Untereinheiten, die mit β assoziiert im Cytoplasma vorliegen wurden durch die Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Anzucht der transformierten DK8-Zellen in LB-Medium mit Ampicillin als Selektionsmarker

Zur Konzentration und Imidazolausverdünnung der gereinigten teilassemblierten Komplexe wurde zuerst ausschließlich ein Zentricon (Amicon Ultra-4, Millipore, 100kDa) wie bei Garrelfs (2008) verwendet. Es zeigte sich aber insgesamt ein größerer Proteinverlust um die 65-70%, sodass die Ausverdünnung anschließend mit einer Nap-5-Säule durchgeführt wurde. Dadurch konnte der Verlust bei der Endaktivität reduziert werden. Der Verlust zur Anfangsaktivität betrug nur noch ca. 30-35%.

Tab. 18: Gesamtaktivität in [U] einzelner Proben von 10l Zellanzucht

Dabei ist die Anfangsaktivität, die Gesamtaktivität, die direkt nach der Reinigung gemessen wurde

und die Endaktivität diejenige die nach konzentrieren und ausverdünnen bestimmt wurde. Zugleich

werden die Methoden angegeben, mit welcher konzentriert als auch das Imidazol entfernt wurde.

Signifikant dabei ist, dass der WT und die c-defiziente Mutante wider Erwarten eine ähnliche Anfangsaktivität besaßen. Normalerweise wäre zu vermuten, dass DK8/pBH7.1 weniger Units im Cytoplasma aufweisen sollte als DK8/pBWU13.∆c-β-His. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich beim Wildtyp nicht so viele teilassemblierte Intermediate im Cytoplasma ansammeln können sollten, da diese sofort an die Untereinheit c assemblieren. Da bei ∆c die c Untereinheit defizient ist, sammeln sich eben diese Komplexe im Cytoplasma an, da sie sich nicht an die membranintegrale Untereinheit assoziieren können. Das unerwartete Ergebnis ist möglicherweise auf einen polaren Effekt innerhalb der ∆c-Mutante zurückzuführen, bei dem die nachfolgenden Untereinheiten weniger

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

synthetisiert werden, da die Stoppcodons von atpE Auswirkungen auf die Translationsrate der nachfolgenden Cistrone besitzt. Die Messungen der spezifischen ATPase-Aktivität der gereinigten teilassemblierten Komplexe war bei DK8/pBWU13.∆c-β-His mit 53U/mg deutlich höher als beim WT DK8/pBH7.1 mit 28U/mg. Dennoch zeigten beide eine hohe Aktivität. Dies trat auch in den Untersuchungen von Garrelfs (2008) auf, bei der die Aktivität der c-defizienten Mutante (40,8 U/mg) zum WT mit 9,2 U/mg viermal so hoch war. Im Vergleich mit diesen Werten weist nun der WT eine höhere Aktivität um 20U/mg und ∆c um 12U/mg. Dadurch ist die Aktivität von ∆c zum WT nur knapp zweimal so hoch.

Abb. 22: spezifische ATPase-Aktivität der gereinigten F 1 -Komplexe

Teilassembliertes F 1 wurde aus E. coli DK8 mit dem jeweiligen Plasmid mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend wurde die spezifische ATPase-Aktivität

bestimmt. WT: DK8/pBH7.1, ∆c: DK8/pBWU13.∆c-β-His

Die unterschiedlichen Ergebnisse der spezifischen ATPase-Aktivität könnten dadurch bedingt sein, dass der Gehalt der ε Untereinheit beim WT höher ist als in der ∆c-Mutante, beziehungsweise DK8/pBH7.1 und DK8/pBWU13.∆c-β-His besitzen eventuell insgesamt weniger ε als die Mutanten bei Garrelfs (2008), da bei Abwesenheit von ε die spezifische Aktivität höher ist (Koebmann et al., 2002). Da es, wie schon erwähnt, nur zur Hydrolyse von ATP kommen kann, wenn das αβ-Hexamer und γ assembliert vorliegen, lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass diese im Cytoplasma der beiden Mutanten nativ assoziiert vorliegen. Für die Auskunft über die Mengenverhältnisse zwischen den Untereinheiten der teilassemblierten Intermediate, wurde eine Coomassie-Blau-Färbung durchgeführt. Dadurch wird ein quantitativer Vergleich zwischen den Untereinheiten ermöglicht, da der Farbstoff Coomassie Brilliant Blau unspezifisch an alle Proteine bindet, wobei die Färbeintensität in der Regel proportional zur Anzahl der positiven Ladungen eines Proteins ist. Dabei zeigten sich in dem Gel keine signifikanten Unterschiede innerhalb der Proben. α und β bei 50kDa nehmen die größte Proteinmenge ein, da sie am stärksten gefärbt, bzw. die Banden am größten sind. Das ist darauf zurückzuführen, dass α und β mit jeweils drei Untereinheiten assoziiert in den Intermediaten vorliegen. Auch γ ist bei 30kDa vorhanden, bei beiden Proben auch in einem vergleichbaren Maß. Bei 15kDa zeigt sich ε marginal geringer bei DK8/pBH7.1 als bei DK8/pBWU13.∆c-β-His, wobei ε auch

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

insgesamt weniger vorhanden ist, was möglicherweise auf einen stärkeren Abbau zurückgeführt werden kann.

Abb. 23: Coomassie-Blau-Färbung der F 1 -ATP-Synthase-Untereinheiten des Cytoplasmas

Teilassembliertes F 1 wurde aus E. coli DK8 mit dem jeweiligen Plasmid mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Pro Lane wurden 10μg Protein aufgetragen.

A: normale Behandlung der Proben, B: Proben die zudem noch aufgekocht wurden.

Da bei der Reinigung auffiel, dass die Elution der Komplexe bei DK8/pBH7.1 zwei Fraktionen á 1ml, bei einer Flussrate von 1mg/min und einem Bettvolumen von 1ml, früher stattfand als bei DK8/pBWU13.∆c-β-His und da Abb. 20A keine Varianzen zeigte, wurden die Proben vor dem Auftrag auf ein SDS-Gel zudem noch auf 99°C erhitzt, um gegebenenfalls die Denaturierung zu verstärken. Allerdings konnte auch so in Abb. 20B kein Unterschied festgestellt werden. Daher muss gegebenenfalls dieses Phänomen noch weiter untersucht werden.

Um zudem die Präsenz der einzelnen Untereinheiten des F 1 -Komplexes nachzuweisen, wurden Immunoblotanalysen durchgeführt. Als Kontrolle diente dabei Membranvesikel von DK8/pBWU13, eine Mutante mit einer intakten ATP-Synthase. Es konnten alle ATP-Synthase-Untereinheiten, wie erwartet, bei der Kontrolle detektiert werden. Die Banden der Untereinheiten α und β von DK8/pBH7.1 und DK8/pBWU13.∆c-β-His konnten verstärkt ermittelt werden, da von ihnen jeweils drei in jedem Komplex vorhanden sind. Auch die Bande von γ zeigt sich relativ stark, im Gegensatz zur Bande von ε, die vergleichsweise schwach detektiert wird. Das ist wahrscheinlich auf einen

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

verstärkten proteolytischen Abbau von ε zurückzuführen oder aber dass der Antikörper gegen ε nicht optimal ist. Es stellte sich zudem heraus, dass δ nicht in den cytoplasmatischen Intermediaten vorhanden ist und konnte auch schon von Garrelfs (2008) nicht nachgewiesen werden. Dies ist möglicherweise auf Abbau zurückzuführen, da δ sehr instabil ist und liegt eventuell auch daran, dass δ erst assembliert nachdem α 3 β 3 γε an c assoziiert vorliegt. Eine weitere Möglichkeit wäre, dass eventuell der His-tag von β in der Kronenregion bei der Assemblierung von δ stört und δ dann, da es nicht assoziiert vorliegt, abgebaut wird. Wie zu erwarten war, konnten die F o -Untereinheiten a, b und c in den teilassemblierten F 1 -Komplexen nicht detektiert werden.

Abb. 24: Detektion der F o F 1 -ATP-Synthase-Untereinheiten

Teilassembliertes F 1 wurde aus E. coli DK8 mit dem jeweiligen Plasmid mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt, elektrophoretisch aufgetrennt und geblottet. Die Detektion der

Untereinheiten beim Immunoblot erfolgte mit den Antikörpern aus Tabelle 15. Pro Lane wurden 4μg

Protein aufgetragen und als Kontrolle 20μg MV von DK8/pBWU13.

Signifikant ist außerdem, dass in der Probe von DK8/pBWU13.∆c-β-His generell weniger F 1 -Untereinheiten detektiert werden, als in der Probe von DK8/pBH7.1, obwohl gleiche Mengen aufgetragen wurden. Daher ist wahrscheinlich der Proteingehalt innerhalb der einzelnen Untereinheiten variierend oder aber das Ergebnis der BCA-Proteinbestimmung war ungenau.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

3.1.2 „Knock-out“ der F o -Untereinheit c

Für den „knock-out“ der Untereinheit c, welche durch atpE codiert wird, wurde die von Datsenko & Wanner (2000) beschriebene Methode verwendet. Als Basis diente hier das Lambda-Red-Rekombinase-System, welches auf dem Helferplasmid pKD46 codiert ist. Durch diese Methode ist es möglich DNA in einen Stamm einzubringen und über homologe Rekombination ein gewünschtes Gen zu modifizieren. Die Voraussetzung für eine erfolgreiche homologe Rekombination sind homologe Bereiche an den flankierenden Enden des DNA-Fragments. Das Lambda-Red-Rekombinase-System auf pKD46 beinhaltet die Gene für die Proteine Gam, Bet und Exo und stehen unter Kontrolle des Arabinose-Promotors P araBAD . Durch Gam wird die Exonuklease V des RecBCD-Rekombinationskomplexes von E. coli inhibiert, sodass die fremde lineare DNA nicht abgebaut wird und Bet und Exo Zugang zu den Enden der DNA bekommen. So wird eine effizientere homologe Rekombination gewährleistet, als durch RecBCD möglich wäre. Brandt (2009) konstruierte mit Hilfe des Systems den Stamm KB3, welcher eine rpsL-Kan-Kassette innerhalb des atp-Operons im Bereich atpI-atpD besitzt. Die Kan-rpsL-Kassette fungiert zum einen als Kanamycin-Selektionsmarker und zum anderen, um das stammeigene mutierte Streptomyzin-Gen (rpsL ^R ) nicht zur Geltung kommt zu lassen, da das rpsL ^s -Wildtyp-Gen in der Kassette dominant gegenüber rpsL ^R ist (Abb.25). Dies liegt darin begründet, dass bei der Resistenz der Sm-Wirkort an den 30S-Untereinheit der Ribosomen verändert ist. Bei rpsL ^S werden Ribosomen synthetisiert, die von Sm inhibiert werden können. Wird die Resistenzkassette durch homologe Rekombination wieder entfernt, kann anschließend durch die Sm-Resistenz gegenselektiert werden.

Da bei KB3 aber die Sensitivität für Streptomycin erst bei einer Konzentration von 1500μg/ml auftrat, wurde zunächst der Stamm DP2 aus EB12 konstruiert, dessen Resistenz-Kassette revers inseriert wurde, im Vergleich zur Codierung der Gene für die ATP-Synthase (Abb. 19). Durch die Umkehrung der rpsL-Kan-Kassette besitzt der dazugehörige Promotor womöglich eine stärkere Affinität für die RNA-Polymerase, sodass die Transkription des Wildtyp-rpsL-Gens verstärkt wird, welches für die Sensitivität verantwortlich ist. Dadurch könnte eventuell die Konzentration von Sm für die Sensitivität gesenkt werden.

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3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Die Resistenzkassette wurde durch Elektroporation in elektrokompetente E. coli EB12/pKD46 eingebracht, deren Zellanzucht bei 30°C erfolgte, da das Plasmid pKD46 einen temperatursensitiven Replikationsursprung besitzt. Mit einer Konzentration von 10mM Arabinose wurde die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor P araBAD ermöglicht und damit die Gene γ, β und exo exprimiert. Nach der erfolgreichen Elektroporation und Selektion wurde mit Hilfe eines Komplementationstests überprüft, welche Kolonie sowohl die Resistenzkassette besitzt, als auch das Helferplasmid pDK46 verloren hat. Der Test wurde bei 42°C durchgeführt, um so effektiv die Replikation des temperatursensitiven Helferplasmids zu verhindern. Eine Kolonie, deren Phänotyp dem gewünschten entsprach, wurde ausgewählt und anschließend zur Kontrolle eine Kolonie-PCR durchgeführt, um herauszufinden, ob es sich auch um den entsprechenden Genotyp handelt. Da die Kolonie positiv getestet wurde (Abb. 27, DP2), wurde der Stamm anschließend auf seine Streptomycin-Sensitivität hin getestet. Da allerdings DP2 auch nur eine Sensitivität bei 1500μg/mg Streptomycin aufwies, wurde mit KB3 als Grundlage für den Stamm DP1 weiter gearbeitet. KB3 besitzt dabei schon die rpsL- Kan-Resistenzkassette,mit der der Bereich atpI-atpD durch homologe Rekombination deletiert wurde. Es wurden zunächst kompetente KB3/pKD46 mit dem Fragment atpI-atpD aus dem Plasmid pBWU13.∆c-β-His durch Elektroporation transformiert. Innerhalb des Fragments sind die Codons an den Positionen 13, 14 und 15 von atpE jeweils zu einem Stoppcodon verändert (Tab 19).

Diese drei Stopp-Tripletts sind deshalb notwendig, da bei Brandt die ∆c-„knock-out“ Mutante KB4, mit nur einem Stoppcodon an Position 15 unmittelbar revertierte. Innerhalb des Codons an der 15. Position waren auch nur zwei Nukleotide ausgetauscht, sodass für DP1 ein Konstrukt mit drei Nukleotid-Austauschen innerhalb der Tripletts 13 und 14, zuzüglich zu dem cV15stop, verwendet wurde um schließlich die Wahrscheinlichkeit einer Reversion zu minimieren. Kolonien, die dann auf dem Selektionsmedium wuchsen, wurden dann auf erfolgreiche homologe Rekombination mittels Komplementationstest getestet, mit dem auch ebenfalls gleichzeitig bei 42°C das temperatursensitive Helferplasmid pKD46 entfernt wurde. Zellen mit dem gewünschten Phänotyp wurden ausgewählt und es wurde mittels Kolonie-PCR mit spezifischen Primern kontrolliert ob der Genotyp auch der erwartete ist (Abb.27, DP1; Tab. 20). Um letzten Endes ganz sicher zu gehen, dass das Fragment, die Resistenz-Kassette ersetzt hat und auch vollständig inseriert ist, wurde noch eine Sequenzierung bei Seqlab durchgeführt. Die Kolonie-PCR als auch die Sequenzierung bestätigten, dass es sich dabei um den gewünschten Stamm DP1 handelt mit ∆c-„knock-out“ durch drei Stoppcodons in atpE und His 6 -tag am N-Terminus von β. Der Komplementationstest von DP1 und DP2 ist in Tabelle 21 dargestellt, wobei EB12 und KB3 als Kontrollen dienten.

Abb. 27: Agarose-Gel der Kolonie-PCR von DP2 und DP1

A: Primer Nr.5, Nr.6; B: Primer Nr.5, Nr.3; C: Primer Nr.1, Nr.5; D: Primer Nr.2, Nr.4;

E: Primer Nr.3 Nr.6

Tab. 20: Verwendete Primerpaare und zu erwartende Fragmente für Kolonie-PCR von DP1 und den

Kontrollen KB3 und EB12

Tab. 21: Komplementationstest von DP1 und DP2

(+ Wachstum nach 1-3Tagen; - kein Wachstum)

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

3.1.3 Funktionelle Charakterisierung von KB5 und DP1

Für Untersuchung der Assemblierung, wenn die Gene der ATP-Synthase auf dem Chromosom vorliegen, wurde die zuvor konstruierte Mutante DP1 mit „knock-out“ in atpE verwendet. Als Wildtyp diente KB5, welcher von Brandt (unveröffentlicht) konstruiert wurde. Als Basis fungierte dabei das Plasmid pBH7.1. Verglichen wurden die Eigenschaften von DP1 und KB5 mit den Mutanten aus 3.1.1, um herauszufinden ob deren Charakteristika auf einem Effekt der Überexpression beruhen oder ob sich auch hier die F 1 -Untereinheiten α, β, γ und ε vermehrt im Cytosol anreichern. Für den direkten Vergleich wurden ebenfalls die ATP-Synthase-Untereinheiten über Ni-NTA gereinigt und analysiert.

Die Untersuchungen der Mutanten in Syntheserichtung auf Zellebene zeigten für KB5 ein Wachstum auf Succinat und für DP1 dementsprechend keines. DK8 wurde hierbei als Negativkotrolle und EB12 als Positivkontrolle verwendet. Da es sich dabei um das erwartete Ergebnis handelt wurden die Zellen anschließend in LB-Medium angezogen.

Tab. 22: Komplementationstest

(+ Wachstum nach 1-3 Tagen; - kein Wachstum)

Abb. 28: Wachstumsvergleich zwischen c-Deletionsmutante und WT

Anzucht der Stämme KB5 und DP1 in LB-Medium.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Bei der Zellanzucht zeigte sich, dass der Wildtyp KB5 ein schnelleres Wachstum als die Mutante DP1 aufweist, bei der keine funktionsfähige ATP-Synthase vorliegt. Dabei wurde für KB5 eine Dopplungszeit von 69min berechnet. Ein Vergleich der Dopplungszeiten von DP1 mit 310min und der Mutante DK8/pBWU13.∆c-β-His mit 109min zeigte, dass DP1 ein sehr langsames Wachstum aufweist. Das ist womöglich darauf zurückzuführen, dass es sich dabei nicht um ein Plasmidsystem handelt und so eine mögliche Überexpression ausbleibt. Anschließend wurde das Cytoplasma präpariert und die Untereinheiten, die mit β assoziiert im Cytoplasma vorliegen wurden durch die Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt.

Während der Reinigung fiel gleichermaßen auf, dass die Elution der teilassemblierten Komplexen beim Wildtyp KB5, wie bei DK8/pBH7.1 in 3.1.2 zwei Fraktionen, bei einem Bettvolumen der Matrix von 1ml, früher stattfand als bei c-defizienten Mutante DP1, was gegebenenfalls weiter untersucht werden sollte.

Tab. 23: Gesamtaktivität in [U] einzelner Proben von 10l Zellanzucht

Dabei ist die Anfangsaktivität, die Gesamtaktivität, die direkt nach der Reinigung gemessen wurde

und die Endaktivität diejenige die nach konzentrieren und ausverdünnen bestimmt wurde. Zugleich

wird die Methode angegeben, mit welcher konzentriert als auch das Imidazol entfernt wurde.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen aus 3.1.1 besitzt DP1 mit „knock-out“ in atpE eine deutlich höhere Gesamtaktivität von 33U als der Stamm KB5, welcher nur 7U aufweist (Tab. 23). Da die Anfangsaktivität bei DK8/pBH7.1 (Tab. 18) und KB5 so unterschiedlich ausfällt, muss noch des Weiteren untersucht werden, ob die Mutante DK8/pBH7.1 eine ungewöhnlich hohe Gesamtaktivität besitzt, die in weiteren Studien nicht weiter verifiziert werden kann, oder ob normalerweise die Anfangsaktivität von DK8/pBWU13.∆c-β-His höher ausfallen sollte und dies auf den möglichen polaren Effekt zurückzuführen ist, der von den Stoppcodons in atpE ausgeht. DP1 zeigte zudem mit 42U/mg eine fünfmal so hohe spezifische Aktivität wie KB5 mit 8U/mg. Dies spiegelt nun auch die Ergebnisse von Garrelfs (2008) wider, die beim Wildtyp mit Plasmid 9,2U/mg sowie bei der ∆c-Mutante mit Plasmid 40,8U/mg berechnet hat und ist auch vergleichbar mit der spezifischen Aktivität von DK8/pBWU13.∆c-β-His (s. Abb. 19). Nur DK8/pBH7.1 fällt etwas aus dem Muster heraus, da die Mutante eine Enzymaktivität von 28U/mg besitzt, welche im Endeffekt deutlich höher ist als bei dem untersuchten Wildtyp von Garrelfs (2008).

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Abb. 29: spezifische ATPase-Aktivität der gereinigten F 1 -Komplexe

Teilassembliertes F 1 wurde aus KB5 und DP1 mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt

und anschließend wurde die spezifische ATPase-Aktivität bestimmt.

KB5: WT; DP1: ∆c-Mutante

Abb. 30: Coomassie-Blau-Färbung der F 1 -ATP-Synthase-Untereinheiten des Cytoplasmas

Teilassembliertes F 1 wurde aus transformierten DK8 sowie KB5 und DP1 mittels Ni-NTA-

Affinitätschromatographie gereinigt. Pro Lane wurden 10μg Protein aufgetragen.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Die Coomassie-Blau-Färbung der gereinigten teilassemblierten Komplexe, welche elektrophoretisch aufgetrennt wurden, konnte abermals erwartungsgemäß für α und β die stärkste Intensität nachweisen und damit verbunden die höchste Proteindichte im Vergleich mit den anderen detektierten Untereinheiten, bedingt durch die Stöchiometrie. Auch bei γ sowie ε besitzen die Banden eine vergleichbare Intensität. Bei KB5 ist die meiste Verunreinigung in der Probe vorhanden, da sehr viele zusätzliche Banden vorhanden sind, aber auch in den anderen Proben ist ein gewisses Maß an Verunreinigung zu finden. Für die Bestimmung der einzelnen vorhandenen Untereinheiten der ATP-Synthase im Cytoplasma wurde abermals ein Antikörpernachweis innerhalb der gereinigten F 1- Komplexe durchgeführt (Abb. 26). Es konnten so die Untereinheiten α, β, γ sowie ε detektiert werden, wobei die Bandenstärke wieder bei α und β am größten ist. Auch γ zeigte sich bei KB5 und DP1 ebenso wie bei den entsprechenden Mutanten aus 3.1.1. ε ist ebenfalls schwächer vorhanden sowie δ ist nicht detektierbar. Die Untereinheiten a, b und c sind nicht existent.

Abb. 31: Detektion der F o F 1 -ATP-Synthase-Untereinheiten

Teilassembliertes F 1 wurde aus transformierten DK8 sowie KB5 und DP1 mittels Ni-NTA-

Affinitätschromatographie gereinigt, elektrophoretisch aufgetrennt und geblottet. Die Detektion der

Untereinheiten beim Immunoblot erfolgte mit den Antikörpern aus Tabelle 15. Pro Lane wurden 4μg

Protein und als Kontrolle 20μg MV von DK8/pBWU13 aufgetragen.

Grundsätzlich lässt sich sagen, dass bei allen untersuchten Mutanten, sei es Wildtyp oder c-defiziente Mutante, die gleichen Untereinheiten, bei den aus dem Cytoplasma gereinigten teilassemblierten Komplexe, detektiert werden können. Die Mutanten DK8/pBH7.1 und DK8/pBWU13.∆c-β-His haben

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

auch eine annähernd gleiche Proteinmenge innerhalb der Proben. Im Gegensatz dazu weisen die chromosomal codierten Mutanten KB5 und DP1 eine geringere Menge der einzelnen teilassemblierten Untereinheiten α, β, γ und ε in der Probe auf. KB5 besitzt dabei die größte Bedeutung, da damit gezeigt werden konnte, dass sich ohne Manipulation die Untereinheiten α, β, γ und ε im Cytoplasma teilassemblieren und es sich dementsprechend um ein echtes Assemblierungsintermediat handelt.

3.1.4 Rückbindung an F 1 -freie Membranen

Für die Beurteilung, ob die gereinigten teilassemblierten Komplexe, die aus den Untereinheiten α, β, γ und ε bestehen, in einer nativen Konformation im Cytoplasma vorliegen und an die c-Untereinheit rückgebunden werden können, beziehungsweise um weiterhin Aufschluss über den Ablauf der Assemblierung der ATP-Synthase zu erhalten, wurden zunächst F 1 -freie Membranvesikel präpariert. Dafür wurde der Stamm ML308-225 verwendet, da von diesem Stamm F 1 komplett abgelöst werden kann. Bei anderen Stämmen verbleibt δ häufig in der Membran. Die Ursache dafür, warum gerade von ML308-225 F 1 vollständig abgelöst werden kann, ist nicht genügend untersucht, aber auf Grund von Erfahrungswerten geht man davon aus, dass die Membran der Zellen eine andere Zusammensetzung besitzt (G. Deckers-Hebestreit, persönliche Mitteilung). Anschließend erfolgte eine Rekonstitution der ATP-Synthase durch WT-F 1 um eine geeignete Positivkontrolle zu gewinnen und ein Protokoll für die Messungen der ATP-getriebenen Protonentranslokation zu etablieren.

Abb. 32: ATP-getriebene Protonentranslokation

Der WT-F 1 -Komplex wurde zur Verfügung gestellt. Die Protonentranslokation wurde unter Zugabe von

ATP gemessen.

Da bei den Studien von Garrelfs (2008) gezeigt werden konnte, dass für eine Rückbindung 12,5U F 1 /mg Membranvesikel ausreichend sind, um eine funktionierende Rückbindung zu bekommen, wurden für jede Rückbindung 12,5U pro mg F 1 -freie Membranvesikel verwendet. Zur Erfassung, ob die Rückbindung erfolgreich durchgeführt werden konnte, wurde zum einen die DCCD-sensitive ATP-

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Hydrolyse-Aktivität bestimmt und zum anderen die ATP-getriebene Protonentranslokation gemessen. Als Grundlage für die ATP-getriebene Protonentranslokation dient der Umstand, dass durch die Hydrolyse von ATP durch die intakte ATP-Synthase ein H ⁺ -Gradient aufgebaut wird und bei den invertierten Membranvesikel die H ⁺ nach innen transportiert werden. Da der Fluoreszenzfarbstoff ACMA verwendet wird, kann der Transport der Protonen durch eine Fluoreszenzlöschung sichtbar gemacht werden. Dabei lagert sich das H ⁺ an das ACMA an und der Farbstoff verliert so seine Fluoreszenz. Da es sich um eine reversible Reaktion handelt, kann durch einen Entkoppler (NH 2 SO 4 ) die Fluoreszenzlöschung aufgehoben werden, da die Entkopplung dazu führt, dass die Membran durchlässig für Protonen werden und die H ⁺ wieder nach außen strömen. Als Negativkontrolle diente bei den Untersuchungen F 1 -freie Membranvesikel und als Positivkontrolle Vesikel die mit Wildtyp-F1 rekonstituiert wurden, welches aus ML308-225 gewonnen wurde.

Erwartungsgemäß zeigten die Membranvesikel ohne F 1 keine Quenchrate (Abb.32), da durch das Fehlen des F 1 -Teils keine ATP Hydrolyse möglich und somit auch keine Fluoreszenzlöschung vorhanden ist. Nach der Rekonstitution der F 1 -freien Vesikel mit Wildtyp F 1 konnte eine Quenchrate von 64% verzeichnet werden, da nun das Enzym den dazu erforderlichen F 1 -Teil besitzt. Des Weiteren muss noch aufgeklärt werden, ob die Protonentranslokation durch Hemmung mit DCCD unterbunden werden kann und so die Eigenschaften des wiederhergestellten Enzyms, seiner nativen Natur entspricht. Dazu wurden die MV-F 1 und die rekonstituierten MV noch mit DCCD inkubiert und im Anschluss daran erneut die Fluoreszenzlöschung gemessen. Das DCCD bindet dabei an das Asp61 der c-Untereinheit und verhindert so die Rotation des Rings, wenn eine intakte Enzymfunktion vorliegt. Bei Garrelfs (2008) wurde unabhängig von der Menge der Membranvesikel grundsätzlich 2μl DCCD verwendet, in diesen Studien war aber eine Abhängigkeit des DCCD-Volumens von der Menge der MV erkennbar. Infolgedessen waren bei 400μg Membranvesikel 2μl 10mM DCCD nicht ausreichend, da so keine vernünftige Hemmung vorhanden war, sodass auf 4μl 10mM DCCD erhöht wurde. Letztlich lässt sich sagen, dass bei diesem Versuchsaufbau pro 100μg MV 1μl 10mMDCCD verwendet werden muss. Auch durch die Inkubation der F 1 -freien Vesikel mit DCCD, konnte, wie erwartet, auch weiterhin keine Löschung verzeichnet werden. Die Membranvesikel, die mit Wildtyp-F 1 regenriert wurden zeigen eine gute Fluoreszenzlöschung von 64%. Im Gegensatz dazu fiel die Quenchrate unter DCCD-Hemmung wider Erwarten etwas hoch aus und sollte eher gegen 0 tendieren. Dies ist ein Indiz für eine schlechte Hemmung von F o durch DCCD. Darüber hinaus wurde auch die NADH-abhängige Protonentranslokation bestimmt und erfolgte sowohl ohne als auch unter DCCD-Hemmung. Dies dient dazu, um herauszufinden ob die Membran protonendicht ist. NADH wird über die NADH-Dehydrogenase oxidiert, wodurch das Ubichinon der Atmungskette reduziert wird und somit Protonen über die Membran transloziert werden. Daher wird ein Protonengradient aufgebaut, der unabhängig von der ATPase ist. Bei einer protonenundurchlässigen Membran findet durch den Protonengradient, der bei der NADH-Oxidation entsteht, ebenfalls eine Löschung der ACMA-Fluoreszenz statt. Wenn anschließend die NADH-abhängige Quenchrate der Membranvesikel mit F 1 der mit DCCD behandelten Proben entspricht, kann davon ausgegangen werden, dass die Membran protonendicht ist und F 1 denselben Effekt hat wie DCCD. Die Membranvesikel ohne F 1 sind im Gegensatz dazu durchlässig für Protonen, sodass die H ⁺ des durch die Atmungskette aufgebauten Protonengradienten, direkt wieder durch den offenen F o -Komplex passiv nach außen diffundieren können. Dennoch bleibt eine gewisse Restlöschung, in diesem Fall von 21%. Bei den MV-F 1 zeigt sich eine Fluoreszenzlöschung von 85% und spricht sowohl für eine intakte Membran, als auch für eine erfolgreiche DCCD-Hemmung. Nach Rückbindung von F 1 an die F 1 -freien Membranvesikel wurde eine ähnlich hohe Quenchrate von 81% verzeichnet. Bei der MV+F 1 -Probe unter DCCD-Inkubation wurde

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

eine Löschung von 92% detektiert. Daher kann davon ausgegangen werde, dass die Membran und auch die rekonstituierte ATP-Synthase protonendicht ist. Wenn die Membranvesikel protonen-undicht wären, wären die Quenchraten der Proben MV+F 1 und MV-F 1 +DCCD nicht so hoch.

Abb. 33: NADH-getriebene Protonentranslokation

Der WT-F 1 -Komplex wurde zur Verfügung gestellt. Die Protonentranslokation wurde unter Zugabe von

NADH gemessen.

Anschließend wurde die hemmbare ATP-Hydrolyse der MV-F 1 und der MV+F 1 gemessen, um zu kontrollieren ob die Rückbindung erfolgreich war.

Abb. 34: spezifische ATPase-Aktivität der F 1 -freien MV mit und ohne Rückbindung von WT-F 1

Bei den MV-F 1 wurden 20μl Probe verwendet und anschließend auf 2μl umgerechnet und bei den

MV+F 1 wurden direkt 2μl Probe verwendet.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Die Membranvesikel ohne F 1 zeigten als Negativkontrolle, wie erwartet, keine ATPase-Aktivität, unabhängig davon ob DCCD verwendet wurde oder nicht. Die Membranvesikel mit dem zurückgebundenen F 1 -Komplex wiesen eine ATPase-Aktivität von 6,01U/mg auf und waren zu 76% mit DCCD bis auf eine Restaktivität von 1,47U/mg hemmbar. Dabei entspricht die Hemmung von 76% einer sehr guten Inhibierung. Eine Inhibierung von 100% ist nicht möglich, da sich noch andere ATPasen innerhalb der Membran befinden. Aus den Ergebnissen lässt sich schließen, dass die Rekonstitution erfolgreich war. Da nicht mehr genügend Probe mit Wildtyp-F 1 vorhanden war, musste zunächst F 1 für die Positivkontrolle präpariert werden. Aus Zeitgründen konnten Rückbindungen der gereinigten teilassemblierten F 1 -Komplexe und deren Untersuchung nicht mehr durchgeführt werden.

3.1.5 Präparation von WT-F 1

Infolgedessen, dass das WT-F 1 für die Positivkontrolle bei der F 1 -Rückbindung benötigt wurde, wurde SK1/pBWU13 fermentiert, um schließlich daraus F 1 präparieren zu können. Der Stamm SK1 wurde deshalb verwendet, weil er als Basis den Stamm ML308-225 hat. Daher ist es bei SK1 ebenfalls möglich, F 1 vollständig, inklusive δ, abzulösen. Transformiert wurde SK1 mit pBWU13, einem Plasmid, welches ein atp-Operon besitzt, da bei SK1 das atp-Operon deletiert wurde (Konrad, unveröffentlicht). Es wurde eine System mit Plasmid gewählt, da Vorversuche zeigten, dass wenn ML308-225 im Vergleich mit SK1+Plasmid angezogen wurde, der Stamm eine geringere spezifische Aktivität von 1,48U/mg (Tab. 24) besitzt. Es wäre zwar möglich ML308-225 zusätzlich mit einem Plasmid anzuziehen, auf dem sich auch ein atp-Operon befindet, aber dann müsste zur Anzucht zudem noch Antibiotikum verwendet werden. Die Entscheidung, welches Plasmid genutzt wurde, liegt auch den Vorversuchen zugrunde (Tab. 24), da beim Vergleich von pBH7.1 mit pBWU13, das zweite Plasmid eine höhere spezifische Aktivität von 4,8U/mg aufwies. Die Mutante SK1/pBH7.1 zeigte nur eine Enzymaktivität von 3,80U/mg. Auch die Inhibierung durch DCCD bei SK1/pBWU13 lag bei einem guten Prozentsatz von 92%.

Tab. 24: Vergleich verschiedener Mutanten für die Präparation von WT-F 1 Angezogen wurden die Stämme

in Minimalmedium und 0,5% (v/v) Glycerin und anschließend Membranvesikel präpariert, von denen

jeweils die ATPase Aktivität bestimmt wurde.

Angezogen wurde SK1/pBWU13 schließlich in 30l Minimalmedium mit Glycerin. Das Glycerin diente hier als einzige Kohlenstoffquelle und wird über Glycerin-3-Phosphat zu Dihydroxyacetonphophat umgewandelt, welches dann in der Glycolyse zu Pyruvat umgesetzt wird. Das Pyruvat wird nicht fermentiert, sondern geht in den Citratzyklus sowie Atmungskette ein, sodass der Hauptteil des ATP in der Zelle durch oxidative Phosphorylierung generiert wird. Diese Gegebenheit verursacht eine vermehrte ATP-Synthase-Bildung, damit der Zelle ausreichend Energie zur Verfügung gestellt werden

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

kann. Darüber hinaus bewirkt das Gylcerin eine erhöhte ATPase Menge in den Zellen in Abhängigkeit zur Länge der Generationszeit beim Wachstum (Kasimoglu et al., 1996).

Abb. 35: Wachstumskurve von SK1/pBWU13

Anzucht des Stammes SK1/pBWU13 in Minimalmedium mit 0,5% (v/v) Glycerin.

Geerntet wurden die Zellen, sobald sich eine Verringerung der maximalen Teilungsrate und der Übergang zur stationären Phase einstellten. Bei SK1/pBWU13 fand dies nach ungefähr 250min bei einer OD 578 von 1,95 statt. Anschließend sollte mit aus gewonnen Zellen das Wildtyp-F 1 präpariert werden. Dies konnte aber aus zeitlichen Gründen nicht mehr durchgeführt werden.

3.2 Untersuchungen zur Defizienz von δ

Die Defizienz von δ konnte bisher in verschiedenen durchgeführten Studien beobachtet werden. Gleichwohl ob die cytoplasmatischen teilassemblierten Komplexe bei der ∆c-Mutante aufgereinigt wurden (Garrelfs, 2008; diese Arbeit) oder ob die Cytoplasmafraktionen verschiedener Mutanten untersucht wurden. Bei ihnen konnte δ ebenso nicht durch Antikörperbindung nachgewiesen werden (Eggers, 2007; Garrelfs, 2008; Brandt, 2009; Bunge, 2009). Zumindest konnte durch Garrelfs (2008) gezeigt werden, dass der proteolytische Abbau von δ innerhalb von ganzen Zellen und präparierten Membranvesikeln durch thermolysinartige sowie Aspartat-Proteasen verringert werden kann. Daher wurde grundsätzlich bei den Präparationen PI-Mix der Firma Sigma verwendet, der diese Proteasen beinhaltet. Brandt (2009) untersuchte des Weiteren, ob OmpT ebenfalls für den Abbau von δ verantwortlich ist, konnte aber zeigen, dass dies nicht der Fall war. Trotz der Verwendung des PI-Mix konnte δ generell nicht im Cytoplasma, als auch bei den gereinigten F 1 -Komplexen nachgewiesen werden, unabhängig davon, ob es sich um den Wildtyp mit intaktem atp-Operon oder ob es sich um eine F o F 1 -Deletionsmutante handelt. Um nun zu untersuchen, was eine mögliche Ursache für das Fehlen der δ-Untereinheit ist, wurde zunächst F 1 von Membranvesikeln abgelöst. Das abgelöste F ¹ wurde dann durch Immunoblotanalysen auf seine Untereinheiten getestet, um herauszufinden ob

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

sich δ detektieren lässt oder ob die Untereinheit auf den Membranvesikeln verbleibt. Darüber hinaus wurde analysiert, ob das Fehlen doch auf einen Abbau zurückzuführen ist. Mit Hilfe einer Überexpression der Untereinheit δ wurde dem möglichen Abbau entgegen gewirkt. Daher wurde das Plasmid pCDFDuet-atpH konstruiert und ein System entwickelt, bei dem durch IPTG-Induktion die Expression von δ gesteuert wird.

3.2.1 Ablösung des F 1 -Komplexes von DK8/pBH7.1

Da das Phänomen, dass δ fehlt bisher bei jeder Reinigung von cytoplasmatischen teilassemblierten F 1 -Komplexen auftrat (Garrelfs, 2008), wurde dies unter dem Aspekt untersucht, ob δ im F 1 -Teil dann zu finden ist, wenn F 1 von den ATP-Synthasen eines Wildtyps abgelöst wird. Die dahinterstehenden Gründe sind zum einen, dass die Möglichkeit besteht, dass der His 6 -tag an β stört, welcher sich in der Kronenregion des αβ-Hexamers befindet, an den δ durch Bindung an den N-terminalen Bereich von α normalerweise assoziiert vorliegt und so die native Affinität zwischen δ und α verringert ist. Zum anderen wäre auch denkbar, dass die Affinität von δ grundsätzlich zur b-Untereinheit höher ist und δ erst an b assembliert, bevor es mit der α-Untereinheit der Kronregion interagiert. Dazu wurde DK8/pBH7.1 in LB-Medium+Amp angezogen, die Membranvesikel präpariert und anschließend eine Ablösung des F 1 -Komplexes durchgeführt. Die Untereinheiten wurden dann elektrophoretisch aufgetrennt und mittels Coomassie-Blau-Färbung und Detektion der Fluoreszenz spezifischer Antikörperbindungen sichtbar gemacht. Die Coomassie-Färbung zeigte, dass bei 50kDa eine breite Bande vorhanden ist, die α und β entspricht, da α zwar ein Molekulargewicht von 55,3kDa besitzt aber sein apparentes Molekulargewicht im Gel bei ungefähr 50kDa läuft.

Abb. 36: Coomassie-Blau-Färbung der Untereinheiten des abgelösten F 1 von DK8/pBH7.1

Es wurden 10μg Protein aufgetragen.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Auch bei 30kDa ist eine Bande zu finden, die der Untereinheit γ entspricht sowie bei 15kDa die Bande von ε. Ob es sich auch wirklich um diese Untereinheiten handelt muss noch mittels Immunoblot geklärt werden und dementsprechend ob es sich bei der Bande bei 20kDa eventuell um δ handelt.

Abb. 37: Detektion der F o F 1 -ATP-Synthase-Untereinheiten

Abgelöstes F 1 wurde mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt, elektrophoretisch

aufgetrennt und geblottet. Die Detektion der Untereinheiten beim Immunoblot erfolgte mit den

Antikörpern aus Tabelle 15. Pro Lane wurde 4μg Protein aufgetragen.

Die Antikörperfluoreszenz bestätigte, dass sich das abgelöste F 1 aus den Untereinheiten α, β, γ und ε zusammensetzt. δ konnte auch hier abermals nicht detektiert werden. Da aber die Ablösung nicht effizient war und letztlich nur noch 5U an Gesamtaktivität übrig blieben, sollten diese Untersuchung unbedingt wiederholt werden, um ein aussagekräftiges Ergebnis darzustellen und zudem noch in Relation mit den abgelösten MV von DK8/pBH7.1 gesetzt werden, um herauszufinden ob δ noch an den Membranvesikeln detektiert werden kann. Dies konnte aus Zeitgründen nicht mehr durchgeführt werden.

3.2.2 Expressionssteigerung von δ

Um der Defizienz eventuell durch eine erhöhte Expression von δ entgegenzuwirken, wurde ein System entwickelt, bei dem die Expression von δ auf einem zusätzlichen Plasmid separat angeschaltet werden konnte. Dazu wurde das Plasmid pCDFDuet-atpH konstruiert, das einen T7-Promotor besitzt und nachfolgend nur das Gen atpH der ATP-Synthase. Das Plasmid wurde zusammen mit pT7Pol26 und pBWU13.∆c-β-His in DK8 transformiert. pT7Pol26 besitzt das Gen für die T7-RNA-Polymerase, welches unter der Kontrolle des Promotors T5H25 mit nachgeschalteter lac

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Operator Region steht und mittels IPTG induziert werden kann. Daher kann die Expression von δ auf dem Plasmid pCDFDuet-atpH unabhängig von pBWU13.∆c-β-His angeschaltet werden. Da auf pBWU13.∆c-β-His auch die Untereinheit δ codiert ist, wird diese Untereinheit exprimiert und durch die Expression des Plasmid pCDFDuet-atpH ergänzt. Mit diesem System ist es möglich zu untersuchen, inwieweit bei den teilassemblierten F 1 -Komplexen des Cytoplasmas der ∆c-Mutante δ komplementiert werden kann. Zunächst wurden die Mutanten DK8/pBWU13.∆c-β-His/pCDFDuet-atpH/pT7Pol26 in LB-Vollmedium unter unterschiedlichen IPTG-Konzentrationen angezogen. Da aber das Wachstum der Mutante durch die drei verwendeten Antibiotika und den drei verschiedenen Plasmiden sehr langsam war und innerhalb von knapp acht Stunden allerhöchsten bis zu einer OD ⁵⁷⁸ von 0,802 (Abb. 38) wuchsen sowie sich die maximale Teilungsrate schon nach knapp vier Stunden verringerte, musste eine Möglichkeit gefunden werden, um die Wachstumsrate der Mutanten zu verbessern.

Abb. 38: Wachstumskurve von DK8/pBWU13.∆c-β-His/pCDFDuet-atpH/pT7Pol26 unter verschiedenen

IPTG-Konzentrationen. Anzucht des Stammes erfolgte in LB-Vollmedium ohne IPTG sowie unter

0,001mM, 0,01mM, 0,1mM und 1mM IPTG.

Daher wurden nachfolgend die Zellen in TYPGN angezogen. Bei dem Medium handelt es sich ursprünglich um ein Medium, welches verwendet wurde um die Zellen höher als eine optische Dichte von 5 wachsen lassen zu können. Da sich das Medium als geeigneter als LB-Medium erwies, wurde die Zellanzucht unter unterschiedlichen Konzentrationen von IPTG in TYPGN durchgeführt. Es wurde drei Proben mit 0,01mM, 0,1mM und 1mM IPTG induziert und es wurde zudem eine Kontrolle ohne IPTG angezogen. Es zeigte sich, dass alle Zellen in gleichem Maß wuchsen, die Probe mit 0,01mM und 1mM sogar etwas schneller als die anderen. Dennoch findet eine Abnahme der maximalen Teilungsrate schon nach 135min ab und nach ungefähr 305min erreichten sie dann eine OD 600 von 0,8.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Abb. 39: Wachstumskurve von DK8/pBWU13.∆c-β-His/pCDFDuet-atpH/pT7Pol26 unter verschiedenen

IPTG-Konzentrationen. Anzucht des Stammes erfolgte in TYPGN-Medium ohne IPTG sowie

unter 0,01mM, 0,1mM und 1mM IPTG.

Abb. 40: Immunoblot der Anzucht von DK8/pBWU13.∆c-β-His/pCDFDuet-atpH/pT7Pol26 in TYPGN

unter verschiedenen IPTG-Konzentrationen im Vergleich mit dem Wildtyp DK8/pBWU13.

Es wurden pro Lane 20μg der ganzen Zellen aufgetragen. Die Detektion der Untereinheiten beim

Immunoblot erfolgte mit den Antikörpern aus Tabelle 15.

Anschließend wurde mittels Immunoblot die Untereinheit α im Vergleich mit γ und α detektiert, da die anderen Untereinheiten der ATP-Synthase in gleichem Maß exprimiert sein müssen und nur δ vermehrt vorhanden sein soll. Für die Immunoblotanalysen wurde als Positivkontrolle ganze Zellen vom Wildtyp DK8/pBWU13 verwendet, als Vergleich der exprimierten Untereinheiten diente die Anzucht ohne IPTG. Es zeigte sich, dass unter Induktion durch 1mM IPTG die Untereinheit δ am stärksten exprimiert wird. Gleichzeitig gab es für die anderen Untereinheiten, für welche die Detektion von α und γ steht, keinerlei Änderungen in der Intensität der Bandendetektion zum Wildtyp bzw. zur Anzucht ohne IPTG, sodass die Konzentration von 1mM IPTG durchaus verwendet

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

werden kann und die Zellanzucht von DK8/pBWU13.∆c-β-His/pCDFDuet-atpH/pT7Pol26 unter 1mM IPTG erfolgen sollte. Dies konnte aber aus Zeitgründen nicht mehr durchgeführt werden.

3.4 Reinigung der Untereinheiten δ und ε

Auf der Grundlage der Studien von Bunge (2009), die zeigen konnte, dass das Plasmid pET22-atpH-C-His für die Reinigung von δ am idealsten ist, wurde der Stamm HB1(DE3) mit diesem Plasmid transformiert und für die Reinigung von ε wurde HB1(DE3)/pET22-atpC-His verwendet. Der Stamm HB1(DE3) wird benutzt, da er zum einen eine Deletion von atpB-C besitzt und somit nicht in der Lage ist, eine funktionierende ATP-Synthase zu synthetisieren. Zum anderen codiert der Stamm das Gen für die T7-RNA-Polymerase und ist im Genom von E. coli deshalb notwendig, da die Plasmide pET22atpH-C-His und pET22-atpC-His einen T7-Promotor besitzen, der durch IPTG induziert werden kann, sodass die Expression von δ oder ε kontrolliert abläuft und zu einem bestimmten Zeitpunkt angeschaltet werden kann. Bunge (2009) konnte die erforderliche IPTG-Konzentration zur Expression von δ als auch ε mit 1mM festlegen.

3.4.1 Reinigung von δ

In den in vivo Studien von teilassemblierten F 1 konnte δ nicht innerhalb der Komplexe nachgewiesen werden, daher wird nun in vitro untersucht, ob durch Zugabe von separat gereinigtem δ dem Fehlen der Untereinheit in den F 1 -Komplexen entgegengewirkt werden kann und es zur Rückbindung von F ¹ zusammen mit δ an F 1 -freie Membranvesikel kommen kann. Zunächst wurde δ aus dem Cytoplasma von HB1(DE3)/pET22-atpH-C-His aufgereinigt. Dies erfolgte mit Hilfe eines His 6 -tags der molekulargenetisch an den C-Terminus angehängt wurde, wodurch die Reinigung über eine Ni-NTA-Affinitätschromatographie möglich wurde. Von den einzelnen Fraktionen mit Protein wurde zur quantitativen Proteinbestimmung eine elektrophoretische Auftrennung durchgeführt und anschließend eine Coomassie-Färbung. Dadurch ist es möglich zu bestimmen, welche Fraktionen für die Probe mit gereinigtem δ geeignet sind. Zum Vergleich wurde das Cytoplasma, als auch der Überstand, welcher das ungebundene Protein darstellt, aufgetragen. Werden diese beiden Spuren miteinander verglichen, sieht man ganz deutlich, dass der größte Teil der Proteine nicht an die Matrix gebunden haben, da diese keinen His-tag besitzen. Bei 20kDa ist die Bande, die δ darstellt, in der Probe des Überstandes verringert gegenüber dem Cytoplasma. Die Fraktionen 2-4 die Protein enthielten, wurden gegeneinander aufgetragen, um die Menge an δ quantitativ vergleichen zu können (Abb. 41). Daher wurden die Fraktionen 3 und 4 mit mehr Protein für die Probe mit gereinigtem δ verwendet und per Amicon Ultra 10K konzentriert/ausverdünnt, um das Imidazol zu entfernen. Um anschließend mit Hilfe von spezifischen Antikörpern verifizieren zu können, dass es sich auch auf jeden Fall um die Untereinheit δ handelt, wurde zudem noch ein Immunoblot mit den einzelnen Proben hergestellt (Abb. 42).

Der Westernblot mit dem Antikörper gegen δ zeigte deutlich, dass es sich bei dem gereinigten Protein, welches schon in Abbildung 41 nachgewiesen werden konnte, um die Untereinheit δ bei 20kDa handelt. Bei der Detektion bei 40kDa und 70kDa handelt es sich um Fremddetektion, da der vorhandene Antikörper nicht optimal ist.

Abb. 41: Coomassie-Blau-Gel der δ-Reinigung

Es wurden 10μl des Cytoplasmas und des Überstandes aufgetragen und von den einzelnen

Fraktionen 2-4 jeweils 5μl. Die letzte Lane stellt die vereinigte und konzentrierte Probe aus

Fraktion 3 und 4 dar, von der auch 5μl aufgetragen wurden.

Abb. 42: Immunoblot der δ-Reinigung

Es wurden 10μl des Cytoplasmas und des Überstandes aufgetragen und von den einzelnen

Fraktionen 2-4 jeweils 5μl. Die letzte Lane stellt die vereinigte/konzentrierte Probe aus Fraktion 3 und

4 dar, von der auch 5μl aufgetragen wurden. Die Detektion der Untereinheiten beim Immunoblot

erfolgte mit den Antikörpern aus Tabelle 15.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Im Folgenden wurden noch weitere Immunoblotanalysen durchgeführt, um ausschließen zu können, dass noch andere F 1 -Untereinheiten in der Probe vorhanden sind. Für die Detektion wurde als Positivkontrolle Membranvesikel von DK8/pBWU13 verwendet. Darüber hinaus wurden auch der Proteingehalt mit 1,9mg/ml und eine Gesamtproteinausbeute von 0,95mg bestimmt.

Abb. 43: Immunoblot der δ-Reinigung im Vergleich mit DK8/pBWU13

Es wurden 20μg von Membranvesikeln des Wildtyps DK8/pBWU13 in der ersten Lane aufgetragen und

in der zweiten Lane 1μg des gereinigten δ. Die Detektion der Untereinheiten beim Immunoblot erfolgte

mit den Antikörpern aus Tabelle 15. A: anti-γ B: anti-α/β C: anti-δ, anti-ε

Anhand der durchgeführten Antikörperbehandlungen ist erkennbar, dass keinerlei Verunreinigungen durch weitere F 1 -Untereinheiten der ATP-Synthase vorhanden sind. Es wurde mit Antikörpern gegen γ, als auch α und β und gegen ε inkubiert, die zwar jedes Mal beim Wildtyp DK8/pBWU13 detektiert werden konnten, aber nicht in der Probe mit gereinigtem δ. Bei der Inkubation mit δ sticht die zweite Lane deutlich heraus. Anschließend wurde noch eine Massenspektrometrie der Probe durchgeführt und das Protein konnte als δ identifiziert werden. Das gereinigte δ sollte schließlich zu den teilassemblierten F 1 -Komplexen hinzugefügt werden, damit eventuell so das fehlende δ in der Probe komplementiert werden kann und der Komplex seine native Konformation erhält. Durch Rückbindungen an F 1 -freie Membranvesikel und Testung der Aktivität und Funktionalität der rekonstituierten ATP-Synthasen mittels ACMA-Quench und ATPase-Messungen, kann dann nachgewiesen werden, ob nun die ATP-Synthase so ihre nativen Eigenschaften erhält und das Fehlen von δ durch dessen hinzufügen ausgeglichen wurde. Aus zeitlichen Gründen konnte dies aber nicht mehr im Rahmen der Arbeit durchgeführt werden.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

3.4.2 Reinigung von ε

Da zwar die Untereinheit ε in den teilassemblierten Komplexen nicht vollständig fehlt, aber im Vergleich mit der Untereinheit γ dennoch weniger vorhanden ist und vermutlich schon teilweise abgebaut wurde, wurde auch hier das ε separat aufgereinigt. Damit sollten dann die teilassemblierten F 1 ergänzt werden und so eventuell dem Abbau von ε entgegenwirken zu können. Als Mutante wurde HB1(DE3)/pET22-atpC-His verwendet, bei der ebenfalls ein His-tag an die zu reinigende Untereinheit molekulargenetisch angehängt wurde. Die bei der Ni-NTA-Affinitätschromatographie erhaltenen Fraktionen mit eluierten Protein wurden in Relation zueinander mittels Coomassie-Blau-Färbung gesetzt sowie kontrolliert ob die Reinigung erfolgreich war. Wird die erste Spur, welche das Cytoplasma darstellt mit der zweiten verglichen, die den Überstand der zentrifugierten Matrix entspricht, zeigt sich, dass der größte Teil des ε, welches sich im Cytoplasma befand, an die Ni ²⁺ -Ionen gebunden hat, da die Bande bei 15kDa in der ersten Spur um einiges intensiver ist als bei der zweiten. Die restlichen Banden der ersten zwei Spuren sind weitere Proteine des Cytoplasmas, die nicht an die Matrix binden, da sie gegenüber ε keinen His-tag besitzen. Von den eluierten Fraktionen enthielten insgesamt sieben Fraktionen Protein, die auch allesamt für die Probe mit gereinigtem ε verwendet wurden. Von jeder Fraktion wurde jeweils 50μl aufgetragen und wurden im Anschluss daran per Amicon Ultra 10K konzentriert und ausverdünnt, um das Imidazol zu entfernen. Im Coomassie-Blau-Gel ist in den Fraktionen kaum weiteres Protein vorhanden, da sich in den einzelnen Lanes kaum andere Banden zeigen, als die bei 15kDa, bei der es sich mit höchster Wahrscheinlichkeit um ε handelt. Die letzte Spur ist die konzentrierte und ausverdünnte Probe, von der nur 5μl aufgetragen wurden, bei der ebenfalls die Bande bei 15kDa deutlich zur Geltung kommt.

Abb. 44: Coomassie-Blau-Gel der ε-Reinigung

Es wurden 50μl des Cytoplasmas und des Überstandes aufgetragen und von den einzelnen

Fraktionen 1-7 auch jeweils 50μl. Die letzte Lane stellt die vereinigte und konzentrierte Probe aus

Fraktionen 1-7 dar, von der 5μl aufgetragen wurden.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Um letztlich mit Hilfe von spezifischen Antikörpern verifizieren zu können, dass es sich auch auf jeden Fall um die Untereinheit ε handelt, wurde außerdem noch ein Immunoblot mit den einzelnen Proben aus Abbildung 38 erstellt. Zudem wurde noch Membranvesikeln von DK8/pBWU13 als Positivkontrolle verwendet, die in der ersten Lane zu sehen ist. Bei allen Proben und bei der Positivkontrolle kann die Bande bei 15kDa als ε bestimmt werden. Bei der Detektion bei 70kDa handelt es sich ebenso um Fremddetektion, da auch der Antikörper gegen ε nicht optimal ist.

Abb. 45: Immunoblot der ε-Reinigung

Darüber hinaus wurde eine BCA-Proteinbestimmung durchgeführt. Der Proteingehalt der Probe mit ε beträgt 5,0mg/ml und besitzt ein Gesamtproteingehalt von 2,5mg. Daher ist der Gesamtproteingehalt deutlich höher der der Probe mit gereinigtem δ. Dies ist möglicherweise einen Abbau von δ im Cytoplasma zurückzuführen. Da noch bedeutend ist, ob das gereinigte ε auch nicht durch andere Untereinheiten des F 1 -Teils verunreinigt ist, wurde des Weiteren eine Immunoblotanalyse durchgeführt. Für die Detektion der Untereinheiten des F 1 -Teils der ATP-Synthase in der ε-Probe wurden 1μg davon aufgetragen und in Relation mit dem Wildtyp DK8/pBWU13 gesetzt, von dem 20μg Protein aufgetragen wurde. Bei der Positivkontrolle waren alle getesteten Untereinheiten detektierbar, im Gegensatz zur zweiten Lane, bei dem es sich um die Probe mit ε handelt. Daher konnte gezeigt werden, dass keinerlei Verunreinigungen durch weitere F 1 -Untereinheiten der ATP-Synthase vorhanden sind. Das ε bei 15kDa sticht in der zweiten Probe deutlich heraus. Bei den Banden, welche sich bei 70kDa befinden, handelt es sich wieder um Fremddetektion des Antikörpers gegen ε. Auch eine anschließende Massenspektrometrie bestätigte, dass es sich bei dem gereinigten Protein um ε handelt.

3 Ergebnisse Daniela Prätorius

Abb. 46: Immunoblot der ε-Reinigung im Vergleich mit DK8/pBWU13

Es wurden 20μg von Membranvesikeln des Wildtyps DK8/pBWU13 in der ersten Lane aufgetragen und

in der zweiten Lane 1μg des gereinigten ε. Die Detektion der Untereinheiten beim Immunoblot erfolgte

mit den Antikörpern aus Tabelle 15. A: anti-α/β B: anti-γ, anti-ε

Auch hier war es zeitlich gesehen nicht mehr möglich die teilassemblierte F 1 -Komplexe mit dem separat gereinigtem ε zu ergänzen und auf seine Eigenschaften mittels ACMA-Quench und ATPase-Aktivität nach einer Rückbindung an F 1 -freie ML308-225-Membranen zu untersuchen. Daher sollte in weiteren Studien getestet werden, ob so dem Abbau von ε entgegengewirkt werden kann. Abschließend wäre wichtig, ob die rekonstitiuierte ATP-Synthase ihre native Funktion erhält, wenn zudem noch separat gereinigtes δ hinzugefügt wird.

4 Diskussion Daniela Prätorius

4 Diskussion

Da weitere Rückschlüsse über die Assemblierung der ATP-Synthase erforderlich sind, wurde während dieser Arbeit insbesondere untersucht, ob die teilassemblierten F 1 -Komplexe des Cytoplasmas aus den Untereinheiten α 3 β 3 γε ein Assemblierungsintermediat darstellen und der Einfluss des c 10 -Rings auf den Vorgang der Assemblierung betrachtet. Dabei wurden c-defiziente Mutanten verwendet, da sich bei ihnen F 1 im Cytoplasma anreichert, aber auch der Wildtyp betrachtet, da er eine native Assemblierung aufweist und so gezeigt werden kann, ob es sich um ein echtes Assemblierungsintermediat handelt. Garrelfs (2008) konnte plasmidcodiert nachweisen, dass sich F 1 -Komplexe im Cytoplasma teilassemblieren. Daher wurde nun untersucht, ob dies reproduzierbar ist und ob es sich dabei um ein Artefakt der Überproduktion handelt. Dafür wurden die Mutanten in LB-Vollmedium angezogen, aufgeschlossen sowie die teilassemblierten Komplexe aus dem Cytoplasma aufgereinigt und mittels Immunoblotdetektionen analysiert. Des Weiteren wurde dem Phänomen nachgegangen, dass bei den teilassemblierten F 1 -Komplexen δ grundsätzlich nicht zu detektieren ist. Dies erfolgte anhand eines Systems, durch das die Expression von δ erhöht wird, als auch durch separat gereinigtes δ, welches das Fehlen innerhalb der Komplexe durch Ergänzung ausgleichen sollte. Erweitert wurden die Untersuchungen durch die Ablösung von Wildtyp-F 1 von Membranvesikeln des Stammes DK8/pBH7.1, um zu analysieren, ob in diesem Fall δ in dem F 1 -Komplex vorhanden ist.

4.1 Charakterisierung der c-defizienten Mutante und des Wiltyps

Die membranintegrale Untereinheit c des F o -Teils der ATP-Synthase von E. coli liegt im nativen Enzym in oligomerer Ringstruktur vor. Es wird davon ausgegangen, dass sich der Ring als erstes aus zehn Monomeren (Ballhausen et al., 2009) assembliert und in die Membran inseriert. Dies erfolgt unabhängig von den anderen Untereinheiten, wobei aber bei P. modestum UncI als ein beteiligtes Chaperon identifiziert wurde (Suzuki et al., 2007). Die Fähigkeit der Untereinheit c eine Ringstruktur auszubilden ist in der primären Struktur des Proteins determiniert und dementsprechend in der Aminosäure-Sequenz lokalisiert (Arechaga et al., 2002). An die Untereinheit c 10 assemblieren dann die Untereinheiten α, β, γ und ε, aber in welcher Reihenfolge das an den c-Ring geschieht ist in der Literatur nicht eindeutig belegt. Zunächst wurde davon ausgegangen, dass sich γ als erstes an c anlagert und anschließend daran dann das αβ-Hexamer. Mittlerweile wurde dies in Frage gestellt, da Garrelfs (2008) nachweisen konnte, dass als Intermediat im Cytoplasma α 3 β 3 γε assoziiert vorliegt und mittels His-tag an β auch gesamt aufgereinigt werden kann. Das konnte aber noch nicht vollständig verifiziert werden, da bisher nur plasmidcodiert gearbeitet wurde und dabei nicht auszuschließen ist, dass es durch die Expression der Gene auf einem „multi-copy“-Plasmid zu Überexpressionsartefakten kommen kann. Des Weiteren konnte Brandt (2009) bei in vivo Crosslinkexperimenten ein αβ-Hexamer nachweisen und so möglicherweise zeigen in welcher Konformation die α- und β-Untereinheiten im Cytoplasma vorliegen. Dazu wurden Quervernetzungsstudien bei einer ∆γ-Mutante mittels inserierten Cysteinpaaren in α und β durchgeführt, die ein Crosslink zum α 3 β 3 -Hexamer ermöglichen. Diese Cysteinpaare sind von Twachtmann (2009) auf Membranvesikelebene für das native Enzym ermittelt worden. Hierzu sind zwei Cysteinpaare notwendig, wobei eines davon sich in der katalytischen Spalte befinden muss und das andere in der nicht-katalytischen Spalte im

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4 Diskussion Daniela Prätorius

Bereich der Kronenregion. Es zeigte sich, dass sich das α 3 β 3 -Hexamer eventuell zuerst assembliert und anschließend vermutlich erst an γ assoziiert (Abb. 47) und wäre dementsprechend synchron zu der Assemblierung der mitochondriellen ATP-Synthase (Abb. 48). Da dies aber nicht für das Cytoplasma nachgewiesen werden konnte, werden drei verschieden Modelle zur Assemblierung von α und β diskutiert (Abb. 47). Das Modell A geht davon aus, dass α und β jeweils separat an γ assemblieren und beim Modell B bildet sich erst das α 3 β 3 -Hexamer, wie bei Brandt möglicherweise gezeigt. C zeigt eine Assemblierung an γ von assoziierten αβ-Dimeren.

Um nun die Assemblierung bei c-defizienten Mutanten zu charakterisieren und gegebenenfalls zu bestätigen, dass sich die teilassemblierten F 1 -Komplexe zuerst als Intermediat im Cytoplasma assoziieren und anschließend erst an c assemblieren, wurden während dieser Arbeit eine Mutante mit einem „knock-out“ in atpE auf dem Chromosom konstruiert. Diese wurde dann mit einer Mutante verglichen, die diesen „knock-out“ auf dem Plasmid besitzt. Grundsätzlich wurden dazu drei Stopptripletts in c eingefügt, da die Mutante mit nur einem Stoppcodon revertierte und die Wahrscheinlichkeit bei drei Stoppcodons wesentlich geringer ist. Die Immunoblotanalysen zeigten, dass wie bei Garrelfs (2008) die Untereinheiten α, β, γ und ε durch einen His 6 -tag an β aus dem

4 Diskussion Daniela Prätorius

Cytoplasma von DK8/pBWU13.∆c-β-His gereinigt werden konnten und dass δ auch hier nicht detektiert werden kann. Im Vergleich zu DK8/pBH7.1, welcher den Wildtyp darstellt, stellte sich heraus, dass die Gesamtaktivität der aus dem Cytoplasma gereinigten teilassemblierten Komplexe annährend gleich zur c-defizienten Mutante ist. Dies entspricht nicht den Erwartungen, da normalerweise zu vermuten wäre, dass der Wildtyp weniger Gesamtaktivität im Cytoplasma aufweist, da die teilassemblierten Komplexe direkt mit c assoziieren sollten. Im Gegensatz dazu sollten sich die Komplexe bei der ∆c-Mutante vermehrt im Cytosol ansammeln, da sie durch Defizienz von c nicht an diese Untereinheit assemblieren können. Daher muss für weitere Studien untersucht werden, ob es sich bei DK8/pBH7.1 auch wirklich noch um den Wildtyp handelt, da das Verhältnis der Gesamtaktivität zwischen Wildtyp und DK8/pBWU13.∆c-β-His ungewöhnlich ist. Wenn man nun davon ausgeht, dass möglicherweise die Höhe der Gesamtaktivität des hier verwendeten Wildtyps doch einen reellen Wert darstellt, könnte die im Verhältnis dazu geringe Gesamtaktivität von DK8/pBWU13.∆c-β-His auf einen polaren Effekt zurückgeführt werden. Dabei werden die nachfolgenden Untereinheiten nach dem „knock-out“ in atpH weniger synthetisiert, da die Stoppcodons Auswirkungen auf die Translationsrate der nachgeschalteten Cistrone haben. Um dies im Speziellen nachweisen zu können, müssen Immunoblotanalysen von ganzen Zellen, Membranvesikeln als auch der Cytoplasmafraktion durchgeführt werden, welche in Relation mit der c-defizienten Mutante Dk8/pBH42 von Garrelfs (2009) gesetzt werden, die nur Stoppcodon in atpH besitzt. Die Messungen der spezifischen ATPase-Aktivität der gereinigten teilassemblierten Komplexe ergab für DK8/pBH7.1 28U/mg und für DK8/pBWU13.∆c-β-His 53U/mg. Die Varianz der spezifischen Aktivität ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass der Wildtyp mehr ε aufweist als die c- defizienteMutante und dadurch die Aktivität höher ist. Beim quantitativen Vergleich mit Hilfe des Farbstoffes Coomassie-Blau, dessen Färbeintensität proportional zur Anzahl positiven Ladungen im Protein ist, zeigte sich, dass ε bei beiden Proben in gleichem Maß vorhanden ist und die zuvor getätigte Annahme nicht bestätigt werden kann. Bei der Untersuchung der Mutante DP1, die ein „knock-out“ in atpH des Chromosoms besitzt zeigte sich, dass sich hier die teilassemblierten F 1 -Komplexe als Intermediate im Cytoplasma anreichern und dass dies nicht auf eine Überexpression zurückzuführen ist. Es konnten abermals die Untereinheiten α, β, γ und ε per Antiköperbindung nachgewiesen werden, während δ gleichermaßen nicht zu detektieren ist. Des Weiteren konnte eine Gesamtaktivität von 33U bestimmt werden und ist damit deutlich niedriger als die Gesamtaktivität von DK8/pBWU13.∆c-β-His. Daher kann man davon ausgehen, dass die hohe Aktivität von DK8/pBWU13.∆c-β-His der Überexpression des Plasmids zu Grunde liegt. Beim Wildtyp KB5, mit einer intakten ATP-Synthase, welche chromosomalcodiert ist, können ebenfalls teilassemblierte Intermediate mit den Untereinheiten α, β, γ und ε gereinigt werden und zeigt, dass es sich um ein reelles Assemblierungsintermediat handelt. Dennoch ist nur eine geringe Gesamtaktivität von 7U zu verzeichnen. Das Verhältnis der Gesamtaktivität von DP1 und KB5 entspricht dem erwarteten Ergebnis und ist vergleichbar mit dem Ergebnis der Gesamtaktivitäten der Mutanten mit Plasmid von Garrelfs (2008). Auch die bestimmte spezifische Aktivität der teilassemblierten Komplexe entsprechen einander. DP1 besitzt eine spezifische Aktivität von 42U/mg und die ∆c-Mutante DK8/pBH42 von Garrelfs eine Aktivität von ca. 41U/mg. Dasselbe gilt auch für den Wildtyp KB5 mit 8U/mg und DK8/pBH7 mit 9U/mg. Die Mutanten, als auch Wildtyp sind in der Lage im hohen Maß ATP zu hydrolysieren, daher liegen die Untereinheiten α, β, γ und ε vermutlich in nativer Konformation im Cytoplasma vor. Da c-defiziente Mutante als auch Wildtyp, unabhängig von Plasmid und Chromosom, die Intermediate aufweisen, lässt sich daraus schließen, dass die F 1 -Untereinheiten auch ohne die Anwesenheit der Untereinheit c wie beim Wildtyp assemblieren und miteinander

4 Diskussion Daniela Prätorius

interagieren. Wird dieser Aspekt weiter reflektiert erfolgt die Assemblierung des F 1 -Teils unabhängig vom F o -Komplex. Dies ist auch bei der Assemblierung der F 1 F o -Synthase in Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae zu finden. Es konnte nachgewiesen werden, dass hier die Assemblierung in Modulen erfolgt (Rak et al., 2009) und F 1 unabhängig vom F o -Komplex stattfindet (Velours & Arselin, 2000). Daher ist es möglich, dass die Assemblierung bei E. coli in ähnlicher Weise erfolgt wie bei S. cerevisiae (siehe Abb. 48).

Da isoliertes α 3 β 3 -Hexamer auch ohne γ oder ε zur ATP-Hydrolyse fähig ist (Uchihashi et al., 2011) muss insbesondere noch Auskunft über die native Funktionalität der jeweiligen teilassemblierten Komplexe erlangt werden. Infolgedessen werden Rekonstitutionen der ATP-Synthase durch Rückbindung der Komplexe an F 1 -freie Membranen von ML308-225 durchgeführt. Durch die Rückbindung ist es möglich die ATP-getriebenen Protonentranslokationsfähigkeit mit Hilfe von ACMA-Fluoreszenz zu bestimmen und damit kann eine Aussage über die Instandsetzung der ATP-Synthase getroffen werden und ob ihre Funktion die des nativen Enzyms entspricht. Dies konnte aus Zeitgründen in der Arbeit nicht mehr durchgeführt werden. Bei Garrelfs (2008) zeigten die mit den gereinigten teilassemblierten Komplexen rückgebundenen ATP-Synthasen keine native Enzymfunktion, da unabhängig ob das teilassemblierte F 1 vom Wildtyp stammt oder von einer ∆c-Mutante, keine ATP-getriebene Protonentranslokation gemessen werden konnte. Eine ATPase Aktivität konnte im Gegensatz dazu verzeichnet werden, welche jedoch nicht durch DCCD inhibierbar war. Diese Ergebnisse sprechen daher dafür, dass zwar die Rückbindung von F 1 erfolgreich war, aber jedoch keine Kopplung zwischen F 1 und F o vorliegt. Da bei Garrelfs (2008) auch die δ Untereinheit nicht detektierbar war, weder im Cytoplasma als noch bei den teilassemblierten F 1 -Komplexen und auch in anderen Arbeiten δ im Cytoplasma nicht nachgewiesen werden konnte (Brandt, 2009; Eggers, 2007; Brookman, unveröffentlicht) sowie zudem in dieser Arbeit nicht bei den Komplexen detektiert wurde, stellt sich die Frage ob eine Regeneration der ATP-getriebenen Protonentranslokation in diesem Fall überhaupt möglich ist. Die F 1 -Komplexe können zwar an F 1 -freie Membranen zurückgebunden werden, aber im Gegensatz zur Positivkontrolle bei der mit nativen F 1 rekonstituiert wurde, besitzt die ATP-Synthase keine nativen Enzymeigenschaften. Da dabei die Defizienz von δ der einzige Unterschied ist lässt sich daraus schließen, dass vermutlich δ alleine für die Kopplung im Enzymkomplex essentiell ist. Ohne δ ist das αβ-Hexamer zu lose assembliert und rotiert eventuell mit dem Rotor mit. Daher muss zunächst der Fragestellung nachgegangen werden, aus welchem Grund die Untereinheit δ bei den F 1 -Komplexen des Cytoplasmas defizient ist und auch nicht im Cytoplasma bisher detektiert werden konnte. Es können mehrere Ursachen dafür in Frage kommen. Zum einen ist es möglich, dass die Abfolge der Assemblierung eine andere ist und δ als erstes an b assoziiert und nicht an das α des α 3 β 3 -Hexamers, weil die Bindeaffinität von δ an b höher ist. Dafür sprechen würden die Untersuchungen von Weber et al. (2003), die zeigen konnten, dass sobald der cytoplasmatische Teil von b in Interaktionsstudien einbezogen wird, die Bindeaffinität von δ an δfreies F 1 erhöht. Ein weiterer Punkt der dafür sprechen würde, ist die Assemblierung der ATP-Synthase in Mitochondrien in S. cerevisiae, da diese in Modulen erfolgt (Rak et al., 2009) und der „peripheral stalk“ separat assembliert (Kucharczyk et al., 2009). Dabei assembliert erst die Untereinheit b, daran die Untereinheit d, die Untereinheit OSCP, welche δ bei E. coli entspricht und anschließend die Untereinheit F 6 . Daher ist es möglich, dass die Assemblierung in ähnlicher Weise in E. coli erfolgt, dort δ erst an das b-Dimer assembliert, bedingt durch eine höhere Affinität zu b und deshalb δ auch häufig in der Membran verbleibt, wenn F 1 präpariert wird. Dies wäre auch gegebenenfalls eine mögliche Erklärung dafür, an welches α-Monomer δ nun bindet, da die Anordnung von α 3 β 3 γε im Enzym durch die Bindung an c gegeben ist und δ, welches an b assoziiert

4 Diskussion Daniela Prätorius

ist, dann das αβ-Hexamer, mit Hilfe der N-terminalen Region von α, mit dem Rest des Stators verbindet - abgesehen von a, welches vermutlich als letztes assembliert. Weiterhin konnte Hilbers (2009) in seinen Untersuchungen zeigen, dass das b-Dimer erst dann an c bindet, wenn δ präsent ist.

Im Detail spricht auch für eine ähnlich Assemblierung von E. coli und S. cerevisiae, dass die Nterminale Region von δ und OSCP gleichartig ist und nur eine Varianz in der Oberflächenladung vorhanden ist (Carbajo et al., 2005). Unabhängig davon konnten Stack & Cain (1994) zeigen, dass δ notwendig für die Assemblierung ist. Wenn das Asp161 der Untereinheit mit Prolin substituiert wird, wird ein Verlust der Enzymaktivität verursacht, der durch eine Änderung in der Assemblierung des Enzymkomplexes bedingt ist. Garrelfs (2008) konnte zeigen, dass die Untereinheit b ebenfalls essentiell für die Assemblierung von δ ist, da bei einer verkürzten b-Untereinheit um zwei Aminosäuren δ noch assemblieren konnte, aber in den Membranvesikeln nur schwach detektiert werden konnte. Das deutet darauf hin, dass diese sich zwar lose assoziieren kann, aber jedoch schnell wieder abgebaut wird. Gleichzeitig untersuchte Garrelfs auch das Assemblierungsverhalten, wenn sich ein „knock-out“ in dem Gen atpF befindet und b 2 deshalb nicht mehr synthetisiert wird. Dabei konnte dann gezeigt werden, dass δ nicht mehr an den Enzymkomplex assembliert und die restlichen Untereinheiten (außer a) assoziiert vorliegen. Wood & Dunn (2007) ist es gelungen durch „offset“-Crosslinks in b nachzuweisen, dass nur ein b-Monomer signifikant für die Interaktion mit δ ist. Bei den versetzten Crosslinks wurde ein b-Monomer als b ^N definiert werden, da dieses näher am N-Terminus positioniert ist und als b ^C das Monomer, welches näher zum C-Terminus verschoben ist. Nur eine Deletion der letzten vier Aminosäuren des b ^N -Monomers hatte eine negative Auswirkung auf die Affinität zu δ.

Eine weitere Charakteristik von c-defizienten Mutanten ist, dass die Untereinheiten b und β miteinander interagieren können, während die anderen Untereinheiten a sowie α, γ und ε nur

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marginal in der Membran nachgewiesen werden können. δ fehlt im Gegensatz dazu vollständig (Brookman, unveröffentlicht). Dergleichen konnte auch von Hermolin & Fillingame (1995) beobachtet werden, die zeigen konnten, dass die Untereinheit a bei einer Defizienz der c- Untereinheitnicht assemblieren kann. Da Garrelfs (2008) aber nach Zellanzucht mit TEG-Puffer a in geringer Bandenintensität mittels Immunoblot nachweisen konnte, kann davon ausgegangen werden, dass a unter bestimmten Bedingungen zwar in den Enzymkomplex eingebaut werden kann, aber durch das Fehlen der Untereinheit c jedoch für einen proteolytischen Abbau durch die FtsH-Protease leichter zugänglich ist. Ein solcher Effekt könnte sich auch in der Assemblierung von δ widerspiegeln.

4.2 Untersuchungen zur Defizienz von δ

Abgesehen davon, dass die Assemblierung der ATP-Synthase von E. coli eventuell die der von Mitochondrien entspricht, δ deshalb eher an b bindet und dementsprechend nicht mit dem teilassemblierten F 1 des Cytoplasmas assoziiert ist, bevor dieses an c bindet, ist zum anderen eine mögliche Ursache für die Defizienz von δ der His 6 -tag an β. Dieser kann sich gegebenenfalls als ein störender Faktor erweisen, wenn man nun die teilassemblierten F 1 -Komplexe im Speziellen betrachtet. Der His 6 -tag ist an der Kronenregion des α 3 β 3 -Hexamers lokalisiert, wo auch die Untereinheit δ bindet. Da für die Assemblierung von δ an α das N-terminale Ende mit den Aminosäureresten 1-22 einer α-Untereinheit essentiell ist, könnte etwaig der His-tag von β diese Region verdecken, beziehungsweise ist eventuell die Bindung zwischen α und β nicht ganz nativ, sodass die terminalen Enden von α weiterhin verdeckt sind. Das ist darauf zurückzuführen, dass an monomere α-Untereinheiten die δ-Untereinheit nicht binden kann, da die dafür notwendige Sequenz durch die Konformation von monomeren α nicht frei zugängig ist. Erst durch die Bindung an β wird diese Region durch eine Konformationsänderung frei und δ kann daran binden (Senior et al., 2006). Der Grund für die Anordnung eines Monomers gegenüber dem im Hexamer wird darin vermutet, dass die sterische Hinderung eine Bindung von mehr als einem δ an das α 3 β 3 -Hexamer unterbindet. Daher ist es denkbar, dass der His 6 -tag an β eine ähnliche Auswirkung besitzt, δ nicht binden kann

4 Diskussion Daniela Prätorius

und deshalb sensitiv für den proteolytischen Abbau wird. Um herauszufinden, ob der His 6 -tag an β dafür verantwortlich ist, kann in zukünftigen Untersuchungen der His 6 -tag an den C-Terminus von α molekulargenetisch angefügt und anschließend die Untersuchungen erneut durchgeführt werden. Bei der Reinigung von monomeren α verwenden Senior et al. (2006) grundsätzlich den C-terminalen His-tag an α und konnten mit diesen in F 1 -Reassoziierungsexperimenten eine vollständig rekonstituierte ATP-Synthase erreichen, deren ATP-getriebenen Protonentranslokation auch wieder hergestellt ist. Um herauszufinden, ob durch Zugabe von separat gereinigtem δ die Defizienz der Untereinheit in den teilassemblierten Komplexen ausgeglichen werden kann, wurde der zweite Teil der Arbeit durchgeführt. Damit kann herausgefunden werden, ob der β-His 6 -tag stört und selbst das Hinzufügen von gereinigtem δ keine Bindung an den teilassemblierten Komplex verursacht, da die δ-Binderegion an α nicht frei vorliegt. Leider konnte aus Zeitgründen die Ergänzung der teilassemblierten F 1 -Komplexe mit dem gereinigtem δ nicht mehr durchgeführt werden, sodass dies in nachfolgenden Studien noch erfolgen sollte. Möglicherweise kann dann wie bei Studien von Senior et al. (2006) eine intakte ATP-Synthase gewonnen werden, die dann auch zur ATP-getriebenen Protonentranslokation fähig ist. Darüber hinaus konnte ε zwar in allen Untersuchungen mittels Immunoblotanalysen detektiert werden, aber dennoch ist die Detektion schwächer und ist möglicherweise auf einen Abbau zurückzuführen. Daher wurde ε ebenfalls für spätere in vitro Ergänzungsstudien gereinigt. Da trotz der Verwendung des Protease-Inhibitor-Mixes (Sigma) ε möglicherweise abgebaut wird, ist für nachfolgende Studien eventuell notwendig mit einem anderen Puffer zu arbeiten, beispielsweise TEG, da dieser anstelle EDTA enthält, welches Metallo-Proteasen inhibiert, für die sonst kein spezifischer Hemmstoff bekannt ist und deshalb auch nicht im PI-Mix (Sigma) vorhanden ist (Ito & Akiyama, 2005). Dementsprechend ist es möglich, dass die Protonentranslokation nach der Rekonstitution der ATP-Synthase erst vollständig intakt ist, wenn zusätzlich zu δ noch ε in den teilassemblierten F 1 -Komplexen ergänzt wird oder grundsätzlich mit EDTA gearbeitet wird, sodass es nicht zum Abbau von ε kommt. Durch die Verwendung von EDTA ist allerdings keine Reinigung mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie möglich, sodass ein anderer tag verwendet werde muss. Geeignet wäre z.B. ein Strep-tag, der eine Affinität zu Streptavidin aufweist. Mittels Matrix mit Streptavidin kann dann das Protein, an das molekulargenetisch ein Strep-tag angehängt ist, gereinigt und mit Hilfe von Biotin eluiert werden.

4 Diskussion Daniela Prätorius

Ferner wurde noch untersucht, ob δ überhaupt vorhanden ist, wenn F 1 von DK8/pBH7.1 Membranvesikeln abgelöst wird. Bei der Mutante handelt es sich, in Bezug auf die ATP-Synthase, um einen Wildtyp, an dessen β-Untereinheit ein His 6 -tag angehängt ist. Es konnte durch Immunoblotanalysen nach der Präparation gezeigt werden, dass sich das abgelöste F 1 aus den Untereinheiten α, β, γ und ε zusammensetzt und δ abermals nicht detektiert werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass entweder der His 6 -tag an β stört oder aber durch den Ablauf der Assemblierung womöglich die Affinität zu b grundsätzlich höher ist als zu α. Da aber die F 1 -Ablösung von DK8/pBH7.1 Membranvesikeln nicht effizient war und letztlich nur noch 5U an Gesamtaktivität übrig blieben, sollten diese Untersuchungen unbedingt wiederholt werden, um ein aussagekräftiges Ergebnis darzustellen. Zudem sollte das F 1 noch in Relation zu den abgelösten Membranvesikeln gesetzt werden, um eine Aussage treffen zu können, ob das δ in der Membran verbleibt, wenn F ¹ abgelöst wird.

Eine weitere Möglichkeit der Defizienz von δ kann eventuell im Zusammenhang mit einem vermehrten Abbau der Untereinheit stehen. Um gegebenenfalls dem Abbau der Untereinheit δ entgegenwirken zu können wurde innerhalb dieser Arbeit ein System entwickelt, in welchem mittels pCDF-Vektor separat zu den normal exprimierten Untereinheiten δ verstärkt exprimiert wird. Der Hintergrund dafür ist, dass δ in solchen Massen exprimiert wird, sodass wenn Abbau stattfindet, dieser nicht in diesem Maß erfolgen kann und so bestimmt werden kann, ob vielleicht doch die Untereinheit δ in den teilassemblierten F 1 -Komplexen mit assoziiert ist. Dazu wurde pCDFDuet-atpH konstruiert, welches dann mit pT7Pol26 und pBWU13.∆c-β-His zusammen in DK8 transformiert wurde. Es wurde innerhalb dieser Studien eine Konzentration von IPTG mit 1mM als ideal für eine Induktion bestimmt, da dabei zwar die anderen Untereinheiten der ATP-Synthase in noch vergleichbarer Intensität zum Wildtyp synthetisiert werden, aber δ in einem höheren Maß vorhanden ist, als das nur bei DK8/pBWU13.∆c-β-His der Fall wäre. Essentiell ist dabei auch, dass die Mutante DK8/pCDFDuet-atpH/pT7Pol26/pBWU13.∆c-β-His in TYPGN-Medium angezogen wird, da so das Wachstum günstiger ist und bei LB-Vollmedium zu langsam wäre. Aus Zeitgründen konnten die Untersuchungen in einem größeren Anzuchtsrahmen nicht mehr durchgeführt und so getestet werden, ob nun δ bei den teilassemblierten F 1 -Komplexen vorhanden ist und wie die weitere Charakteristika der Mutante ist. Notwendigerweise sollte darüber hinaus noch der Wildtyp DK8/pBH7.1 mit pCDFDuet-atpH als auch pT7Pol26 ergänzt werden, um so eine geeignete Kontrolle zum Assemblierungsverhalten der c-defizienten Mutante zu haben und ob so dem möglichen Abbau von δ entgegengewirkt werden konnte. Um unabhängig vom entwickelten System, in weiteren Untersuchungen dem möglichen Abbau entgegenwirken zu können, könnten eventuell die Präparationsbedingungen etwas verändert werden. In Untersuchungen von Garrelfs (2008) konnte zumindest für δ innerhalb der Membranvesikeln des Wildtyps und für Zellen die in Minimalmedium angezogen wurden, nachgewiesen werden, dass die Untereinheit dann vernünftig detektiert werden kann, wenn der verwendete Puffer EDTA enthält. Daher erwies sich der Puffer TEG geeigneter als der TMG-Puffer. Dennoch sollte weiterhin der PI-Mix (Sigma) verwendet werden, da von Garrelfs (2008) insbesondere nachgewiesen werden konnte, dass er sich günstig auf die Verhinderung von Abbau auswirkte. Sie konnte zeigen, dass durch Inhibition von termolysinartigen Proteasen und Aspartat-Proteasen der Abbau verhindert werden konnte. Dessen ungeachtet kann auch die Protease OmpT für den Abbau von δ verantwortlich sein. OmpT liegt in der äußeren Membran vor und hat das aktive Zentrum zum extrazellulären Raum hin gerichtet, wo es unter anderem für den Abbau von

4 Diskussion Daniela Prätorius

antimikrobiellen Peptiden verantwortlich ist (Haiko et al., 2009). Durch den Zellaufschluss wäre es nun möglich, dass OmpT auch Proteine des Cytoplasmas hydrolysieren kann. Brandt (2009) untersuchte das Vorhandensein von δ, wenn das Gen ompT deletiert ist und konnte dies aber nicht verifizieren.

Abschließend lässt sich sagen, dass noch nicht geklärt werden konnte, warum δ nicht bei den teilassemblierten Komplexen im Cytoplasma vorhanden ist und muss noch in weiteren Studien untersucht werden. Es konnte aber im ersten Teil der Arbeit bestätigt werden, dass unabhängig von der verwendeten Mutante (plasmidcodiert oder chromosomalcodiert) α 3 β 3 γε im Cytoplasma als Intermediat vorhanden ist und dass dies auch im geringeren Maß beim Wildtyp zu finden ist. Dementsprechend kann davon ausgegangen werden, dass es sich de facto um einen Zwischenschritt in der Assemblierung handelt, der im Cytoplasma erfolgt. Es sollte aber dennoch in nachfolgenden Untersuchungen verifiziert werden, ob es sich dabei auch wirklich um ein reproduzierbares Ergebnis handelt.

5 Zusammenfassung Daniela Prätorius

5 Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es zum einen die Assemblierung der ATP-Synthase-Untereinheiten α, β, γ und ε im Cytoplasma von Escherichia coli zu untersuchen und zum anderen Systeme zu entwickeln, um der auftretende Defizienz von δ entgegenwirken zu können und damit möglicherweise die Ursache zu definieren zu können.

Um zu eruieren, inwieweit die Untereinheiten α, β, γ und ε assoziiert im Cytoplasma vorliegen und ob es sich um ein echtes Assemblierungsintermediat handelt, wurde eine Mutante verwendet, welche ein intaktes atp-Operon auf dem Chromosom sowie einen His 6 -tag an β besitzt. Mit dem His 6 -tag ist es möglich β und die daran assemblierten Untereinheiten zu reinigen. Diese Mutante wurde in Relation zu einer c-defizienten Mutante gesetzt, bei der sich die Untereinheiten im Cytoplasma anreichern, da sie nicht an die Untereinheit c binden können. Die Konstruktion der Mutante erfolgte mit Hilfe des Red-Rekombinase-Systems, wodurch ein „knock-out“ von atpE durch Stoppcodons an den Positionen 13, 14, 15 und ein His-tag an atpD in das Chromosom inseriert wurde. Ferner wurden auch ein Wildtyp und eine c-defiziente Mutante untersucht, bei denen schon nachgewiesen werden konnte, dass sich teilassemblierte F 1 -Komplexe im Cytoplasma ansammeln. Da aber bei ihnen das atp-Operon auf einem Plasmid lokalisiert ist, musste durch die Mutanten mit atp-Operon auf dem Chromosom analysiert werden, ob es sich dabei um ein Artefakt handelt, bedingt durch die Überexpression des „muli-copy“-Plasmids. Es konnte durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie bei allen verwendeten Mutanten teilassembliertes F 1 , bestehend aus den Untereinheiten α, β, γ und ε, gereinigt werden und mittels Immunoblotanalysen bestimmt werden. Da dies auch bei den chromosomalen Studien des Wildtyps auftrat, konnte bestätigt werden, dass es sich um ein reelles Intermediat bei der Assemblierung handelt und die Untereinheiten sich zuerst im Cytoplasma teilassemblieren und dann erst an den F o -Teil der Synthase binden.

Da stets die Untereinheit δ innerhalb der teilassemblierten F 1 -Komplexe, nicht mittels Immunoblotanalysen detektiert werden konnte, wurde im zweiten Teil der Arbeit der Defizienz von δ nachgegangen. Dazu wurde ein System entwickelt, bei dem δ, durch ein zusätzliches Plasmid, vermehrt synthetisiert wird. Dadurch kann möglicherweise einem Abbau von δ in der Zelle entgegengewirkt werden. Eine weitere Variante zur Überprüfung der Defizienz war die Ablösung von F 1 mit β-His 6 -tag von Membranvesikeln eines Wildtyps und erfolgte um herauszufinden, ob der His 6 tag die Assemblierung von δ stört. Dabei konnte δ ebenfalls nicht detektiert werden und befindet sich daher nicht im abgelösten F 1 . Schließlich wurden die Untereinheiten δ und ε durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie separat gereinigt, um in nachfolgenden in vitro Studien, möglicherweise das Fehlen von δ in den teilassemblierten F 1 -Komplexen ausgleichen zu können und durch eine Rückbindung an F 1 -freie Membranen eine ATP-abhängige Protonentranslokation wieder herstellen zu können, die nur bei einer intakt rekonstituierten ATP-Synthase möglich ist.

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