Immunmonitoring bei Patienten mit
Multipler Sklerose unter Therapie mit b-Interferonen
(rIFN-b1a, rIFN-b1b)
- Aufdecken von Wirkmechanismen und Suche nach prognostischen Markern -

DISSERTATION

zur
Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)

dem
Fachbereich Biologie
der Philipps-Universität Marburg/Lahn

vorgelegt von

Benedikte Sabina Kühne

April 2003

 

"Ja, wir werden alles, alles noch einmal in Frage stellen. Und wir werden nicht mit Siebenmeilenstiefeln vorwärtsgehen, sondern im Schneckentempo. Und was wir heute finden, werden wir morgen von der Tafel streichen und erst wieder anschreiben, wenn wir es noch einmal gefunden haben. Und was wir zu finden wünschen, das werden wir, gefunden, mit besonderem Misstrauen ansehen." ....
"Sollte uns dann aber jede andere Annahme als diese unter den Händen zerronnen sein, dann keine Gnade mehr mit denen, die nicht geforscht haben und doch reden."

Bertolt Brecht "Leben des Galilei"

INHALTSVERZEICHNIS

Abkürzungen

I. ZUSAMMENFASSUNG

II. EINLEITUNG

Teil A: Multiple Sklerose als Erkrankung

1. Autoimmunität: Reaktionen gegen körpereigene Antigene

2. Morphologische Veränderungen und daraus resultierende Symptome

3. Wesentliche Klinische Verlaufsformen

4. Ätiologische Faktoren

5. Molekulare Pathogenese

6. Therapie mit rekombinantem Beta-Interferon (rIFN-ß) 
6.1. Wirkhypothese des rIFN-ß

7. Heterogenität

8. Prognostische Surrogat-Marker

Teil B: Labor-Methoden für das Screening immunologischer Surrogat-Marker

1. Die Polymerase-Ketten-Reaktion

2. "Real-Time" und "On-Line" PCR

3. Prinzip der "real-time" PCR zur Bestimmung einer Startkopienzahl 
3.1. Unterschied zur konventionellen PCR 
3.2. Der CP-Wert

4. Das LightCycler®-System

5. Fluoreszenz-basierte Detektionsformate 
5.1. Unspezifische Detektion mittels SYBRÒ- Green I 
5.2. Hybridisierungssonden für eine Sequenz-spezifische Detektion

6. Schmelzkurvenanalyse

7. Reverse Transkription - Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)

8. RT-PCR Quantifizierungsprinzipien

Teil C: Ziele der Arbeit

III. MATERIAL UND METHODEN

Teil A: Der klinische Bereich

1. Allgemeines Design der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie

2. Untersuchte Patientenkollektive 
2.1. Untherapiertes Kollektiv (Kontrollgruppe) 
2.2. ß-Interferon Therapierte Kollektive (Therapiegruppen) 
2.2.1. rIFN-ß1a (RebifÒ) Therapiertes Kollektiv 
2.2.2. rIFN-ß1b (BetaferonÒ) Therapierte Kollektive 
2.3. Gesundenkollektiv 
2.4. Verwandtschaftsbeziehungen von Patienten der untersuchten Kollektive

3. Dokumentation von Patientendaten aus dem klinischen und wissenschaftlichen Bereich: Entwicklung eines EDV-gestützten Dokumentationssystems zur Erfassung von Patientendaten (Access-Datenbank)

4. Klinische Methoden 
4.1. Klinische Untersuchungen 
4.2. Schübe 
4.3. EDSS

Teil B: Der labormethodische Bereich

1. Material 
1.1. Chemikalien 
1.2. Materialien 
1.3. Humanes Probenmaterial

2. Molekularbiologische Arbeiten 
2.1. Von der RNA-Isolation zur Reversen Transkription 
2.1.1. Vorbereitung der Proben während der MS-Sprechstunde 
2.1.2. RNA-Isolation mit Durchführung eines DNase-Verdaus 
2.1.3. Konzentrationsbestimmung der RNA im Photometer 
2.1.4. cDNA-Synthese 
2.2. Messung der Genexpression mittels quantitativer "Real-Time" RT-PCR 
2.2.1. Strategie für die RT-PCR Optimierungen 2.2.2. Oligonukleotide 
2.2.3. Plasmid-Standards 
2.2.4. Externe Standardkurven für den Import in verschiedene PCR-Läufe 
2.2.5. "Real-Time" PCR unter Verwendung von SYBR-Green I mit anschließender Schmelz- kurvenanalyse 
2.2.6. PCR Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von SYBR-Green I mit anschließender Schmelzkurvenanalyse 
2.2.7. Quantitative "Real-Time" PCR unter Verwendung von "Hybridization Probes" 
2.2.8. PCR Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von "Hybridization Probes" 
2.2.9. Gel-Elektrophorese

3. Immunologische Arbeiten 
3.1. Prinzip 
3.2. sIL-4R 
3.3. "ModuleSets®" (TNF-beta; sICAM-1; sVCAM-1) und "CytoSets®" (sTNF-R1, sTNF-R2)

4. Statistische Analysen

IV. ERGEBNISSE

Teil A: Quantitative "Real-Time" und "On-Line" RT-PCR

1. Etablierung und Validierung der quantitativen 2-step "Real-Time" RT-PCR 
1.1. RNA-Isolation und Reproduzierbarkeit der cDNA-Synthese 
1.2. Linearitätsbestimmung der cDNA-Synthese 
1.3. Allgemeine Optimierungen der PCR-Reaktionen 
1.4. Reproduzierbarkeit der "Real-Time" PCR: Intra- und Inter-Assay Variationen 
1.5. Konstruktion von externen Plasmid-Standardkurven 
1.6. Reproduzierbarkeit der importierten Plasmid-Standardkurven 
1.7. Dynamischer Bereich der Quantifizierung mittels kinetischer Analyse 
1.8. PCR Amplifikationseffizienzen von Plasmid-Standard im Vergleich zu Patienten-cDNA 
1.9. PBGD als Referenz für die relative Quantifizierung von Zytokin-mRNAs 
1.9.1. Einfluss einer ß-Interferon Therapie auf die Expression von PBGD

Teil B: Ergebnisse aus der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie

1. Ausgangssituation: Einschätzung der von vornherein bestehenden Unterschiede zwischen den Kollektiven bei Studienbeginn (Baseline) 
1.1. Homogenitätsprüfungen der demographischen Daten und der gemessenen immunologischen Parameter 
1.1.1. Strukturvergleich aller MS-Patienten mit den gesunden Probanden 
1.1.2. Strukturvergleich der Kollektive mit unterschiedlicher Verlaufsform: Schubförmig- remittierend (RR-MS) mit sekundär chronisch-progredient (SP-MS) 
1.1.3. Strukturvergleich der drei RR-MS Kollektive: Untherapiert mit Rebif mit Betaferon 
1.1.3.1. Strukturvergleich der untherapierten Patienten mit den Patienten des Rebif- bzw. Betaferon-Kollektivs 
1.1.3.2. Strukturvergleich der Rebif-Gruppe mit der Betaferon-Gruppe 
1.2. Überprüfung auf Einflussfaktoren genereller und MS-spezifischer Art auf die Expression immunologischer Parameter

2. Prospektiver Bereich: Längsschnittanalyse untherapierter und therapierter MS- Patienten 
2.1. Natürlicher MS-Verlauf bei untherapierten RR-MS Patienten 
2.1.1. Aufteilung der untherapierten RR-MS Patienten in die Untergruppe A (Completers) und Untergruppe B (Wechsler) 
2.1.2. Weitere Charakterisierung der Untergruppen A (Completers) und B (Wechsler) 
2.2. MS-Verlauf bei ß-Interferon therapierten MS-Patienten 
2.2.1. Verlauf der immunologischen Parameter bei RR-MS im Vergleich zweier Behandlungsformen (rIFN-ß1a [Rebif]; rIFN-ß1b [Betaferon]) 
2.2.2. Verlauf der immunologischen Parameter unter Behandlung mit Betaferon im Vergleich zweier MS-Verlaufsformen (schubförmig-remittierend [RR-MS]; sekundär chronisch-progredient [SP-MS]) 
2.2.3. Verlauf der immunologischen Parameter bei RR-MS unter Behandlung mit Betaferon im Vergleich des ersten und zweiten Behandlungsjahres 
2.3. Vergleich der klinischen Krankheitsaktivität (EDSS/ Progressionsindex/ Schübe) in den untersuchten MS-Patientenkollektiven 
2.4. Korrelationen der Expression immunologischer Parameter mit der klinischen Krankheits- aktivität (EDSS/ Progressionsindex/ Schübe) 
2.5. Zusammenhang der Expression immunologischer Parameter mit einer Therapieresponse 
2.5.1. Definition von Therapierespondern 
2.5.2. Immunologische Profile nach Einteilung der MS-Patienten in Responder und Nonresponder 
2.6. Expression immunologischer Parameter als prognostische Marker bei der MS 
2.6.1. Prognostischer Marker bezüglich des klinischen Verlaufs im Zusammenhang mit dem Auftreten von Schüben 
2.6.2. Prognostischer Marker bezüglich einer Therapieresponse

V. DISKUSSION

Teil A: Bewertung der quantitativen 2-step "Real-Time" RT-PCR als Methode zur Untersuchung differentieller mRNA-Expression

1. RNA-Isolation und cDNA-Synthese

2. "Real-Time" PCR 
2.1. Allgemeine Optimierungen der PCR 
2.2. Konstruktion von externen Plasmid-Standardkurven 
2.3. Reproduzierbarkeit beim Import von externen Standardkurven in verschiedene PCR-Läufe 
2.4. Reproduzierbarkeit der "Real-Time" PCR 
2.5. Vergleich der PCR Amplifikationseffizienzen von Plasmidstandards und Patienten-cDNA 
2.6. PBGD als Referenz für die relative Quantifizierung der Zytokin mRNA-Expression

Teil B: Wissenschaftliche MS-Patientenstudie

1. Design der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie

2. Bewertung der Ausgangssituation: Homogenitätsprüfungen zur Einschätzung der von vornherein bestehenden Unterschiede zwischen den Kollektiven bei Studienbeginn (Baseline)

3. Prospektive Längsschnittanalyse untherapierter und therapierter MS-Patienten 
3.1. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation im natürlichen MS-Verlauf bei untherapierten RR-MS Patienten und bei deren Aufteilung in die Untergruppen der Completers und Wechsler 
3.1.1. Unterschiede zwischen Completers und Wechslern 
3.1.2. Zusammenhänge mit der klinischen Situation 
3.2. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation bei ß-Interferon therapierten MS- Patienten 
3.2.1. Situation bei RR-MS Patienten im Vergleich zweier Behandlungsformen (rIFN-ß1a [RebifÒ]; rIFN-ß1b [BetaferonÒ]) unter Einbeziehung der Langzeitwirkungen von rIFN-ß1b über 24 Monate 
3.2.2. Situation bei Betaferon-therapierten Patienten im Vergleich zweier MS-Verlaufsformen (schubförmig-remittierend [RR-MS]; sekundär-chronisch progredient [SP-MS]) 
3.3. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation im Vergleich untherapierter und therapierter MS-Patienten 
3.3.1. Potentielle allgemeine Erkrankungsmechanismen 
3.3.2. Potentielle Wirkmechanismen einer MS-Therapie mit ß-Interferonen

4. Immunologische Parameter als Aktivitätsmarker der MS 
4.1. Korrelationen der immunologischen Situation mit dem EDSS 
4.2. Korrelationen der immunologischen Situation mit der Schubrate und dem Progressionsindex

5. Zusammenhang der Expression immunologischer Parameter mit einer Therapieresponse 
5.1. Immunologische Profile im Vergleich der Responder und Nonresponder

6. Besonderheiten beim IL-4 Rezeptor (IL-4R) / löslichen IL-4R (sIL-4R) 
6.1. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation bei MS-Patienten im Zusammenhang mit dem IL-4R / sIL-4R 
6.2. sIL-4R als prognostischer Marker bei der MS 
6.2.1. Prognose bezüglich des weiteren klinischen Verlaufs (Auftreten von Schüben) 
6.2.2. Prognose bezüglich einer Therapieresponse

7. Kritische Betrachtungen der erhobenen Daten

VI. AUSBLICK

LITERATURVERZEICHNIS

ANHANG

I. ZUSAMMENFASSUNG
Für das durchgeführte anwendungsbezogene "Screening" (Immunmonitoring) wesentlicher, an der Pathogenese der Multiplen Sklerose beteiligter immunologischer Parameter (Zytokine, -rezeptoren, Adhäsionsmoleküle) wurde ein geeignetes System der quantitativen "real-time" RT-PCR entwickelt und mit ELISA-Testsystemen kombiniert. Damit wurde die immunologische Situation im Vergleich verschiedener Patientenkollektive auf Gen- und Proteinebene unter Einfluss einer rekombinanten ß-Interferontherapie (rIFN-ß) mit den Zielen verfolgt, Wirkmechanismen der rIFN-ß aufzudecken und prognostische Marker bezüglich der Aktivität der Erkrankung und eines Therapieeffektes zu finden.
Die entwickelte RT-PCR Methodik ist gekennzeichnet durch eine hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit, zeichnet sich sowohl in der cDNA-Synthese als auch in der PCR-Amplifikation durch eine über weite Konzentrationsbereiche bestehende Linearität aus, und ist durch die Verwendung von importierten Standardkurven für die Quantifizierung von mRNA-Targets aus verschiedenen PCR-Läufen besonders für das "Screening" eines Parameters in einer Vielzahl von Proben geeignet.
Der Vergleich der Expressionsprofile der immunologischen Parameter über den Zeitverlauf von 12/24 Monaten in allen MS-Patientenkollektiven zeigte im Hinblick auf potentielle Wirkmechanismen der rIFN-ß Therapie immunologisch betrachtet eine Zunahme von sICAM-1, sVCAM-1 und sTNF-R2, klinisch betrachtet eine ca. 30%ige Reduktion der Schubrate in den therapierten Kollektiven. Des weiteren wurden potentielle für die MS-Erkrankung typische immunologische Parameter-konstellationen in der Form einer Abnahme von IL-4, sIL-4R, IFN-ß und sTNF-R1 in allen Kollektiven unabhängig von der Therapie erkennbar. Bezüglich der Aktivität der Erkrankung ergaben sich für die RR-MS Patienten deutliche positive Korrelationen zwischen sICAM-1, sVCAM-1 sowie sTNF-R2 und dem Grad der Behinderung (EDSS) bei Untersuchungsbeginn, so dass diese als prognostische Marker des weiteren MS-Verlaufs herangezogen werden könnten. Des weiteren hat sich ein deutlicher Zusammenhang der Konzentration von sIL-4R, dessen Rolle in der MS hier zum ersten Mal überhaupt betrachtet wurde, mit dem Risiko eines Patienten einen Schub zu erleiden gefunden, womit sich, ebenfalls für den sIL-4R eine deutliche konzentrationsabhängige Reduktion der Responderwahrscheinlichkeit auf die rIFN-ß Therapie nachweisen ließ.

II. EINLEITUNG
TEIL A: MULTIPLE SKLEROSE ALS ERKRANKUNG
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische entzündliche demyelinisierende (entmarkende) Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS: Gehirn und Rückenmark). Sie ist mit die häufigste Ursache neurologischer Behinderungen junger Erwachsener, denn sie bricht in den meisten Fällen zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr (Mitrovic et al., 1999; Offenhäusser et al., 1997) aus, wobei wiederum 50% dieser Patienten mit Symptomen noch vor dem 30. Lebensjahr konfrontiert werden. Weltweit sind ca. 1,2 Millionen Menschen von der MS betroffen. Die Gesamtzahl der Erkrankten in Deutschland wird auf ca. 80.000-120.000, die Inzidenzrate auf jährlich ca. 3000-5000 neuerkrankte MS-Patienten geschätzt (Bitsch, 2001). Aus bis heute unbekannten Gründen erkranken Frauen häufiger als Männer, wobei die Zahlen zwischen einem Verhältnis von 1,4:1 bis 3:1 (Mitrovic et al., 1999) schwanken. Beginnt die MS im Lebensabschnitt jenseits des 40. Lebensjahr, tritt sie bei Frauen und Männern gleich häufig auf, was die Vermutung nahe legt, dass hormonelle Einflüsse dafür verantwortlich sein könnten. Die Ursache der Erkrankung ist bis heute nicht gänzlich aufgeklärt. Es wird von einer Autoimmunerkrankung ausgegangen, bei deren Entwicklung aber auch erbliche Komponenten (Prädisposition) und Umweltfaktoren eine Rolle spielen (s. Ätiologische Faktoren für nähere Diskussion).

1. AUTOIMMUNITÄT: REAKTIONEN GEGEN KÖRPEREIGENE ANTIGENE
Der menschliche Körper verfügt mit dem Immunsystem über Abwehrmechanismen, die ihn vor Krankheitserregern und Toxinen schützen (Janeway et al., 1997). Während die angeborene Immunität auf Abwehrzellen (Phagozyten) und humoralen Faktoren (z.B. Komplementsystem) beruht, die den Organismus in den ersten Tagen unspezifisch vor eingedrungenen Erregern schützt, funktioniert die sog. adaptive Immunität mittels spezifischer zellulärer und humoraler Abwehrmechanismen, die sich ständig dem Bedarf spezifischer Bedrohungen von außen anpassen. Die Basis der spezifischen Immunabwehr stellen zwei Hauptklassen von Lymphozyten dar:
die B-Lymphozyten, welche im Zentrum der humoralen Immunantwort stehen und für die Produktion von Antikörpern verantwortlich sind, und die T-Lymphozyten, die vor allem bei der zellvermittelten Immunantwort eine Rolle spielen. Viele unreife Lymphozyten reagieren auf körpereigene Produkte und stellen damit eine Gefahr für den Organismus dar. Während der Reifung der B-Lymphozyten im Knochenmark bzw. der T-Lymphozyten im Thymus werden autoreaktive Immunzellen gewöhnlich vernichtet (Apoptose) oder dauerhaft inaktiviert (Anergie), sodass gegenüber körpereigenem Gewebe eine natürliche Selbst-Toleranz entsteht. Obwohl diese Selbst-Toleranz die Regel ist, kommt es doch in einigen Fällen zu anhaltenden Immunantworten gegen körpereigenes Gewebe. Die daraus resultierenden Autoimmunerkrankungen sind also gewissermaßen "Irrtümer des Immunsystems". Statt Bakterien oder Viren zu bekämpfen, richtet sich eine spezifische adaptive Immunreaktion gegen körpereigene Substanzen, sog. Autoantigene, was zu schweren Gewebeschädigungen führt. Autoimmunerkrankungen können prinzipiell jedes Organsystem treffen und sowohl von autoreaktiven T-Lymphozyten als auch von Autoantikörpern hervorgerufen werden. Beispiele für eine T-Zell vermittelte Autoimmunität sind neben der Multiplen Sklerose das "Guillain-Barré Syndrom", welches man als Spiegelbild der MS bezeichnen könnte, da bei dieser Erkrankung das Myelin der Markscheiden um die peripheren Nerven vom Immunsystem attackiert wird. In beiden Fällen sind Strukturproteine des Myelins als potentielle Autoantigene identifiziert worden. Bei der "Insulin-abhängigen Diabetes mellitus" werden die Insulin-produzierenden ß-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse selektiv durch autoreaktive T-Zellen zerstört. Die "Myasthenia Gravis" ist ein Beispiel der durch Autoantikörper vermittelten Autoimmunität. Das Autoantigen ist hierbei der Acetylcholinrezeptor der postsynaptischen Muskelmembran. Die Bindung der Antikörper führt zu einer Verminderung der Anzahl funktionierender Rezeptoren, was zur Blockierung der Signalübertragung an der neuromuskulären Endplatte führt.

2. MORPHOLOGISCHE VERÄNDERUNGEN UND DARAUS RESULTIERENDE SYMPTOME
Die Pathologie der MS ist morphologisch gekennzeichnet durch das Auftreten von zahlreichen (multiplen) entzündlichen und öfters narbig abheilenden, verhärteten (sklerosierten) Herden. Diese Entzündungsherde, auch Läsionen oder Plaques genannt, treten in der weißen Substanz (Axone) von Gehirn und Rückenmark auf. Aus histologischer Sicht finden sich an diesen Stellen vorwiegend T-Lymphozyten und Makrophagen, in geringerem Ausmaß auch B-Lymphozyten. Schreitet die Erkrankung fort, kommt es zum Untergang der Myelin-produzierenden Oligodendrozyten und zur Proliferation von Astrozyten, was zur Ausbildung einer gliösen Narbe (Sklerose) führt. Die vielen klinischen Erscheinungsformen der MS beruhen auf einer Zerstörung der Myelinscheiden, aber auch auf einer irreversiblen Schädigung der Axone selbst, was zum Verlust von Nervengewebe führt. Dadurch kommt es zu einer Beeinträchtigung oder zu einer völligen Unterbindung der Erregungsleitung. Da die Entmarkungsherde in jedem Teil des ZNS auftreten können, können die Patienten eine Vielzahl von neurologischen Symptomen aufweisen. Häufig auftretende Symptome rühren von einem Befall des Sehnervs (Nervus opticus) sowie der motorischen und der sensorischen Nervenbahnen her. So gehören u.a. die Entzündung des Nervus opticus, die sog. Opticus-Neuritis sowie auch Lähmungen (Paresen) und Steifigkeit (Spastik) vor allem in den Beinen, aber auch sensorische Merkmale wie Missempfindungen (Parästhesien), ausgeprägt in Form von Kribbeln und Taubheitsgefühle zu den typischen Symptomen einer MS.

3. WESENTLICHE KLINISCHE VERLAUFSFORMEN
Der natürliche klinische Krankheitsverlauf der MS (Abb. 1) bei jedem einzelnen Patienten ist äußerst heterogen und daher nur schwer vorhersagbar.

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