Bestimmung des Hydroxyprolingehaltes aus Teewurst

Durchführung

Geräte und Hilfsmittel:

- thermostatisierbares Wasserbad

- Spektralphotometer

- Glasküvetten: d = 1 cm

- Rückflusskühler mit Schliff

- Vollpipetten: 2ml, 4ml, 5ml, 10ml, 15ml, 20ml

- Messkolben: 250ml, 500ml, 1000ml,

- Messzylinder: 250ml

- Erlenmeyerkolben mit Schliff: 100ml

- Erlenmeyerkolben enghalsig: 500ml

- Glastrichter: ∅ ca. 10cm

- Reagenzgläser

- Faltenfilter

- Siedesteinchen

- Pasteurpipette

Chemikalien:

- Salzsäure: ca. 6 mol / l

- Petroleumbenzin: Siedebereich 60 bis 80 °C

- Pufferlösung pH etwa 6,8 : 2,6g Citronensäure- Monohydrat, 1,4 g Natriumhydroxid- Plätzchen und 7,8 g Natriumacetat (wasserfrei) werden in etwa 50 ml dest. Wasser gelöst und quantitativ in einen 100 ml Messkolben überführt. Nach Zusatz von 25 ml n- Propanol wird mit dest. Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Für unseren Versuch wurden die Werte der Vorschrift durch 10 dividiert, da wir eine geringere Menge benötigten. Natrium- ethylmercurithiosalicylat wird zur Konservierung zugesetzt, wir haben darauf verzichtet.

- Hydroxyprolin- Vergleichslösungen Stammlösung I (c= 600 mg /l) 120 mg L- Hydroxyprolin werden in dest. Wasser gelöst; die Lösung wird im 200 ml Messkolben bis zur Marke aufgefüllt.

Stammlösung II (c= 6 mg /l)

5 ml der Stammlösung werden in einen 500 ml Messkolben pipettiert und mit dest.

Wasser bis zur Marke aufgefüllt.

Standartlösungen:

Von der verdünnten Hydroxyprolin- Stammlösung II werden 10, 15, 20, 25, 30, 35 ml in 100- ml Messkolben pipettiert und bis zur Marke mit dest. Wasser aufgefüllt. Die Konzentrationen dieser Lösungen betragen 0,60; 0,90; 1,20; 1,50; 1,80; 2,10 µg pro

ml.

- Oxidationsreagenz: 0,28 Chloramin T (Triehydrat) werden in 20 ml Pufferlösung gelöst. Entgegen der Vorschrift haben wir auf 20 ml Pufferlösung umgerechnet. 1,4g * 20 ml / 100 ml = 0,28 g

- Farbreagenz: 2g Dimethylaminobenzaldehyd ( zur Synthese) werden in 7 ml Perchlorsäure (etwa 60 % ) gelöst. Anschließend werden langsam 13 ml n- Propanol Hinzugefügt. Laut Vorschrift benötigt man 100 ml Farbreagenz. Wir haben auf ca. 22 umgerechnet. (siehe Diskussion )

Bestimmung

Säurehydrolyse:

- 4 g Probe (homogenisiert) auf +/- 1mg in einen 100 ml Erlenmeyerkolben einwiegen

- 30 ml Salzsäure und Siedesteinchen hinzufügen

- 8h unter Rückfluss am schwachen sieden halten

- Hydrolysat in einen 500 ml Messkolben überführen

- Mit 5 ml Petroleumbenzin versetzten und bis zur Marke mit dest. Wasser auffüllen

- Petroleumbenzin mit dem gelösten Fett muss über der Marke liegen

- Gründlich durchmischen

- Nach dem Absetzten die Fettphase mit Pasteurpipette absaugen

- Die wässrige Phase durch einen Faltenfilter in einen 500 ml Erlenmeyerkolben filtrieren

- 10 ml des Hydrolysates in einen 250 ml Messkolben überführen und mit dest. Wasser bis zur Marke auffüllen

Farbreaktion:

- 4 ml der Verdünnung in ein Reagenzglas pipettieren

- 2 ml Oxidationsreagenz hinzufügen, mischen

- 20 Min +/- 1 Min bei Raumtemperatur stehen lassen

- 2 ml Farbreagenz zusetzten, gründlich durchmischen

- Reagenzglas in ein Wasserbad 60 °C +/- 0,5 °C, 15 Min stehen lassen

- Reagenzglas unter fließendem Wasser 3 Min lang abkühlen

- 1,5 Stunden bis zur Messung bei Raumtemperatur abstehen lassen

- Messung im Photometer

Beobachtung (Farbveränderung):

Blindprobe: hellgelb Probe: leicht orange Standart:

10 ml : leicht orange

30 ml : dunkel

35 ml : sehr dunkel bis rötlich

Blindlösung:

Statt 4 ml des verdünnten Hydrolysates werden 4 ml dest. Wasser eingesetzt.

Die Extinktion der Lösung wird bei 558 nm in einer Glasküvette (d = 1 cm) gegen die mit denselben Reagenzien angesetzte Blindlösung gemessen.

Standartlösungen:

Mit den Standartlösungen wird ebenfalls eine Farbreaktion (siehe Farbreaktion) durchgeführt. Diese Reaktionen haben wir parallel mit der Reaktion der Hydrolysatverdünnung (Probelösung) durchgeführt.

Eichkurve:

Zur Erstellung der Eichgeraden werden die Standartlösungen ebenfalls gegen die Blindlösung gemessen