Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut f ur Biophysikalische Chemie der

Johann Wolfgang Goethe-Universit at Frankfurt am Main unter der Leitung

von Herrn Prof. Dr. H. R uterjans im Zeitraum von Oktober 1995 bis M arz

1996 angefertigt.

Herrn Prof. Dr. H. R uterjans gilt mein besonderer Dank f ur die interessante

Themenstellung und f ur die Bereitstellung der hervorragenden experimentel-

len Bedingungen zur Durchf uhrung dieser Arbeit, sowie f ur Diskussion und

Anregung.

Herrn Dr. J urgen Schmidt gilt mein besonderer Dank, da er stets bem uht

war, konkrete Hilfestellung zu leisten und die Arbeit voranzubringen. Die

vielen anregenden Diskussionen und seine Hilfsbereitschaft wirkten in fach-

uber diese Diplomarbeit hinaus, licher, sachlicher und motivierender Weise

Anregung und Freude zu diesen Problemkreisen der Biophysikalischen Che-

mie zu erhalten.

Herrn Dipl.-Phys. Michael Marek danke ich f ur stete Hilfsbereitschaft, kon-struktive Vorschl age und anregende Diskussion bei der Durchf uhrung der

Molekulardynamiksimulationen, sowie seinem steten Bem uhen, das Compu-ternetzwerk optimal instandzuhalten.

ur ihre Herrn Dr. H. Hanssum und Herrn Dipl.-Chem. Frank L ohr danke i c h f

Unterst utzung beidenNMR-spektroskopischen Messungen.

Allen nicht namentlich genannten Mitgliedern des Arbeitskreises danke ich

f ur die hervorragende Zusammenarbeit und das ausgezeichnete Arbeitsklima.

Ein pers onlicher Dank gilt meinen Eltern: Ohne ihre st andige ideelle und

materielle Unterst utzung h atte ich mein Studium kaum in diesem kurzen

Zeitraum absolvieren k onnen.

INHALTSVERZEICHNIS

   i

Inhaltsverzeichnis   

1  Einleitung und Problemstellung  1

1.1  Das Fetts aurebindungsprotein FABP  1

1.2  Struktur des FABP  5

2  Methoden  9

2.1  3 J-Kopplungen als Strukturparameter  9

2.2  Bestimmung von 3 J-Kopplungskonstanten  11

2.3  Pulssequenz und Spektren  12

2.4  3 J-Kopplungskonstanten in MD-Simulationen  13

3  Experimenteller Teil  17

3.1  NMR-Spektroskopie  17

3.2  Auswertung der Spektren  18

3.3  Molekulardynamiksimulation  19

4  Ergebnisse  22

4.1  J-modulierte 15 N, 1 HH-COSY-Spektren  22

4.2  3 J H N H -Kopplungskonstanten  23

4.3  Diederwinkelanalyse  25

5  Diskussion und Ausblick  37

6  Zusammenfassung  39

7  Literatur  40

A  Chemische Verschiebungen  45

B  Programme  51

B.1  Pulsprogramm und Aquisitionsparameter  51

B.2  prepare.m  53

B.3  volumes.m  54

B.4  table.m  55

B.5  kopplung.m  56

B.6  ellipse.m  57

B.7  fct hnha.m  58

B.8  zoom2d.m  59

B  9 cont2d m  60

Abk urzungen

Die Vorschl age der IUPAC-IUB Kommission f ur biochemische Nomenklatur

f ur die Ein- und Dreibuchstabenabk urzungen der Aminos auren wurden be-

folgt.

CoA Coenzym A

COSY

E.COSY

FID

GARP

J

MD

NMR

NOE

NOESY

RMSD

TPPI

1D-

2D-

1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1

1 Einleitung und Problemstellung

1.1 Das Fetts aurebindungsprotein FABP

Vor ungef ahr zwanzig Jahren wurde das Fetts aurebindungsprotein FABP

als cytosolisches Protein mit einer hohen Bindungsaanit at f ur langkettige

Fetts auren entdeckt 11. Funktional verwandte Spezies wurden mit zahlrei-

chen Verfahren mittlerweile aus dem Herz, der Leber und den Nervenzellen

vieler S augetiere 2, 33, sowie aus Humanmuskeln 4, 5, f otaler Lunge 66 und

Placenta 77, aus dem Rinderhirn 88, aus dem Verdauungstrakt der Ratte

99, aus Human- 10, M ause- 11 und Schweine-Adipozyten 12, aus Rat-

tenmilchdr usen 13 und aus Rattennieren 144 isoliert. Isoformen des FABP

wurden auch in fetts auremetabolisierenden Geweben von H uhnern 15, 166,

Schelllsch 177, im Darm von Schmetterlingslarven 18 und in Flugmuskeln

von Heuschrecken 199 gefunden. In dieser Arbeit werden Untersuchungen

an rekombinantem H-FABP c , dem zellul aren Protein aus dem Muskelgewebe

des Rinderherzens, durchgef uhrt. H-FABP c kommt im Muskelgewebe in zwei

Isoformen vor, die sich nur durch den Austausch einer Aminos aure Asp 98

gegen Asn ⁹⁸ und ihrem pI 4.9 bzw. 5.1 unterscheiden. Die verwendete

rekombinante Form entspricht der pI=5.1 Isoform, besitzt jedoch am ami-

noterminalen Ende noch einen zus atzlichen Methioninrest.

Die physiologische Funktion des Fetts aurebindungsproteins ist trotz des h au-gen Vorkommens erst teilweise bekannt. Alle bisher beschriebenen FABP-

Isoformen binden bevorzugt Fetts auren mit einer Kettenl ange von 16 bis 20

Kohlenstooatomen. Die Komplexbildung ist mit einer Dissoziationskonstante

von K d 10 ^,6 ,10 ^,7 M 200 stark beg unstigt. Die Ligandenspeziizit at h angt

dabei vom FABP-Typ ab. In der Regel besitzt das FABP nur eine Bindung-

1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 2

stelle f ur die Fetts aure 22. Lediglich f ur das LeberrFABP wurde eine Bin-

dungsst ochiometrie von 2 Fetts auremolek ulen pro FABP-Molek ul gefunden

21, 22.

Metabolite wie Fetts auren und ihre CoA- und Carnitinester beeinnussen di-

rekt und indirekt viele zellul are Prozesse und Funktionen durch i h r e W echsel-

wirkungen mit Membranen, Enzymen, Transportern und Rezeptoren. Fett-

s auren und ihre Derivate spielen ebenso bei der Kontrolle der Zellproliferation

und im Metabolismus, wie auch in der Transmembransignal ubertragung und

in der Pathologie | beispielsweise bei myocardialen Verletzungen | eine

Rolle. Die Regulation der Konzentration von Fetts auren und ihren Estern ist

daher wichtig f ur alle Zellen 22.

Es wird angenommen, da speziische Fetts aurebindungsproteine FABP

als intrazellul are Fetts aurespeicher dienen und damit die Zelle vor den de-

tergenten Einn ussen hoher Konzentrationen freier Fetts auren sch utzen 200.

Dar uberhinaus wurde nachgewiesen, da das FABP eine Rolle beider Auf-nahme von Fetts auren in die Zelle spielt 233 und beim intrazellul aren Trans-

port der Fetts auren zu den Mitochondrien, in denen der Fetts auremetabo-

lismus statttndet 4, 5, 244. Zus atzlich hat die Regulation der Fetts aurekon-

zentration innerhalb der Zelle einen Einnu auf die Modulation der Enzym-aktivit aten durch bestimmte Fetts auren oder deren CoA-Ester 25. Auch

wurde dem FABP ein Einnu auf das Zellwachstum und die Zelldiierenzie-

rung zugeschrieben 200.

Das Fetts aurebindungsprotein wird | zusammen mit Acyl-CoA-Bindungs-protein ACBP, unspeziischem Lipidtransferprotein nsL-TP, Phosphati-dylcholintransferprotein PC-TP, Phosphatidylinositoltransferprotein PI-

TP, zellul arem Retinolbindungsprotein CRBP und zellul arem Retinos aure-

1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 3

ubergeordnete Klasse cytosolischer Pro-bindungsprotein CRABP | in die

teine eingeordnet, deren Charakteristikum ihr relativ niedriges Molekularge-

wicht und die hohe Anit at f ur amphiphile Liganden ist. Die Klassenmitglie-

der besitzen jedoch deutlich verschiedene biochemische Eigenschaften z.B.

isoelektrische Punkte und treten in sehr unterschiedlichen Konzentrationen

auf, wobei der FABP-Gehalt dabei wesentlich h oher ist, als der anderer li-

pidbindenden Proteine Tabelle 1.

Protein zellul are Liganden M r kDaa pI

Tabelle 1: Lipidbindende Proteine in der Rattenleber, ACBP: Acyl-CoA-Binding Pro-

tein; nsL-TP: non-speciic Lipid-Transfer Protein; SCP 2 : Sterol Carrier Protein 2; TP:

Transport Protein; PC: Phosphatidylcholine; PI: Phophatidylinosin; PL: Phospholipid;

CRBP: Cellular Retinol Binding Protein; CRABP: Cellular Retinoic Acid Binding Pro-tein.

ubrigen Vertretern der Klasse Weiterhin unterscheidet sich FABP von den

durch eine groe Heterogenit at an Typen und Isoformen. Es wurden bisher

mindestens sechs strukturell unterschiedliche FABPPTypen charakterisiert

Tabelle 2, wobei die Namen der FABPPTypen aus den Geweben aus denen

sie urspr unglich isoliert wurden, abgeleitet sind.

Das Molekulargewicht aller bisher untersuchten Fetts aurebindungsproteine

liegt zwischen zwischen 13 und 16 kDa mit 127 bis 133 Aminos aureresten in

1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 4

Gewebe

Nerven

Tabelle 2: Gewebsspeziisches Vorkommen der verschieden FABP Typen aus 20

der jeweiligen Sequenz. Alle FABP-Typen besitzen eine Acetylgruppe an ih-rer aminoterminalen Aminos aure. Beim Vergleich der Sequenz verschiedener

FABPs aus einem Organismus zeigt sich ein hohes Ma an Ahnlichkeit f ur

die aminoterminale Dom ane Aminos aurereste 1125, sowie f ur eine Dom ane

in der Mitte der Sequenz Aminos aurereste 60090. Die Ahnlichkeit f ur den

carboxyterminalen Teil des Proteins ist jedoch gering. Innerhalb der FABP-Gruppe ndet man eine Ubereinstimmung von 20097. Dabei besteht eine

hohe Sequenzidentit at 80 beim Vergleich der gleichen gewebsspezii-

schen Form, wie Herz-, Myelin- oder Leber-FABP, i n u n terschiedlichen Gast-

organismen. Dagegen ist die Sequenzidentit at beim Vergleich verschiedener

gewebspeziischer Formen innerhalb des gleichen Gastorganismus vergleichs-

weise niedrig. Leber- und Darm-FABP sind nur zu 20035 sequenzidentisch.

Herz-, Adipozyten- und Myelin-FABP haben bereits 60080 identische Ami-

nos auren. Ahnlichkeiten 22247 ndet man auch zwischen den Sequenzen

der zellul aren Retinol- und Retinoes aurebindungsproteine und den Sequen-

zen der Fetts aurebindungsproteine 200.

1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 5

1.2 Struktur des FABP

Um den Mechanismus der Ligandenbindung besser zu verstehen, wurden

Strukturuntersuchungen durchgef uhrt. Neben verschiedenen Fluoreszenzstu-

dien 266, chemischen Modiizierungsexperimenten 277 und NMR-spektrosko-

pischen Untersuchungen 22, 288 f uhrte vor allem die Kristallstrukturanalyse

von einigen Vertretern der Klasse cytoplasmischer Bindungsproteine zu ei-ner Aufkl arung der jeweiligen Terti arstruktur 29, 30, 31, 32, 333. Es konnte

gezeigt werden, da die Konformation der erhaltenen Kristallstrukturen al-

le das gleiche, in Abbildung 1 und 2 | am Beispiel der R ontgenstruktur

des H-FABP c aus Rinderherz | schematisch dargestellte 30 Sekund ar- und

Terti arstrukturmuster aufweisen.

Diese Proteinmolek ule weisen als gemeinsames Strukturmerkmal eine " - Fa-Strukturauf. Dieses " -Fa besteht aus zehn antiparallelen -Falt- blattstrangen A bis J, die aus je f unf Str angen zwei nahezu orthogonale

-Faltbl atter bilden. Die zwei Faltbl atter sind einseitig durch zwei kurze

parallele -Helices I und II und eine kurze Schleife miteinander ver-

bunden. Zwischen den -Faltblattstr angen D und E wurde eine L ucke im

-Faltblattmuster beobachtet, da der Abstand der beiden Str ange das f ur ein

antiparalleles -Faltblatt ubliche Wasserstoobr uckennetzwerk nicht zul at.

Dieses, in cytoplasmischen Bindungsproteinen weitverbreitete Terti arstruk-turelement deutet an, da das Gesamtstrukturmotiv eng mit der Eigenschaft

der Ligandenbindung verkn upft ist. Tats achlich ergab die Kristallstruktur-

analyse der holo-Form des intestinalen I-FABP c , da die Fetts aure leicht

gekr ummt im Inneren der " -Fa-Struktur des I-FABP c eingelagert wird.

Dabei werden auf Grund der r aumlichen Anordnung Wechselwirkungen der

Fetts aurecarboxylgruppe mit der Guanidiniumgruppe einer Argininseiten-

1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 6

Abbildung 1: Sekund arstruktur aus der R ontgenkristallstruktur der pI=5.1 Isoform

des FABP aus Rinderherz.

uber Wasserstoobr uckenbindungen beschrieben 35.

Durch NMR-spektroskopische Untersuchungen 366 sind nahezu alle Pro-

tonen- und R uckgratkohlenstooresonanzen bestimmt worden. Mit Hilfe von

NOE-Experimenten und Distanzgeometrierechnungen wurde die Terti arstruk-

1  EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG  

   7

Abbildung  2: Terti arstruktur der pI 5 1 Isoform des FABP aus Rinderherz  34

1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 8

tur ermittelt. Die NMR-spektroskopischen Untersuchen zeigten Signalhete-rogenit aten. Dies deutet darauf hin, da die Konformation des FABPs |

wie beiden meisten Proteinen | nicht starr, sondern dynamisch ist. In der

R ontgenstrukturanalyse wird in der Regel ein charakteristisches mittleres

Kristallstrukturmodell erhalten. In manchen F allen liegt in L osung sogar ei-ne andere Struktur als im Kristall vor. Auerdem kann unter Umst anden

die Aktivit at eines Proteins erst durch die in L osung m ogliche Dynamik zu-standekommen. So stehen beimFABP in L osung mehrere Konformationen

im Gleichgewicht zueinander 37, 388. Diese Dynamik ist wahrscheinlich f ur

die Ligandenbindung wichtig, da sie das Eindringen des Gastmolek uls zur

Bindungstelle innerhalb des " -Fassess vermutlich erst erm oglicht t 3 3 .

Die Untersuchung der Dynamik eines Proteinmodells gelingt mit Moleku-lardynamiksimulationen. Dabei werden mit Hilfe von komplexen Kraftfel-dern die klassischen Bewegungsgleichungen f ur die Atome angen ahert. Es

uber al-ergibt sich aus der Simulation ein Ensemble von Strukturen. Die

le Substrukturen gemittelte Struktur sollte in ihren Eigenschaften wie ³ J-

Kopplungskonstante,Diederwinkel usw. m oglichst gut mit den Mewerten

ubereinstimmen. Je geringer die Abweichung des berechneten Mittelwertes

von den experimentellen Daten ist, um so signiikanter ist die Simulation. Der

Vergleich der einzelnen Substrukturen untereinander zeigt durch die Gr oe

der Abweichungen dynamische Bereiche innerhalb der gemittelten Struktur.

In der vorliegenden Arbeit sollen ³ J H N ,H -Kopplungskonstanten an einer re-

kombinanten ¹⁵ N-markierten H-FABP c -Probe in L osung gemessen werden.

Heteronukleare 2-dimensionale NMR-Experimente sowie eine qunatitative

Datenanalyse sollen zu hochgenauen ³ J H ^N ,H -Kopplungskonstanten f uhren,

die verwendet werden, um das Strukturmodell zu verfeinern.

2 METHODEN 9

2 Methoden

2.1 ³ J-Kopplungen als Strukturparameter

Eine der derzeit genauesten Methoden, ³ J H ^N ,H -Kopplungskonstant e n z u b e -

stimmen, besteht darin, eine Folge von J-modulierten COSY-Experimenten

durchzuf uhren, deren Wartezeit T sich mit jedem Experiment v erl angert. Da-mit erh alt man eine Abh angigkeit der Signalintensit at von der Kopplungs-konstanten. Die skalare Spin-Spin-Kopplung J zwischen dem Kern A und

dem Kern X wird durch die Bindungselektronen vermittelt und bewirkt eine

Aufspaltung des Signals von A, die aus der unterschiedlichen Orientierung des

Kernspins des Kopplungspartners X im Magnetfeld resultieren. Spin- 1 2 Kerne

sind bez uglich d e s aueren B 0 -Feldes in zwei Zust ande, und , polarisiert,

das heit bei50 der in der Probe vorhandenen Molek ule liegt der X-Kern

im j -Kernspinzustand vor, beiden anderen 50 im j -Spinzustand.

Sie f uhren zu unterschiedlichen lokalen Magnetfeldern am Ort von Kern A

und daher zu zwei Linien im Spektrum, die um den Wert der Kopplungs-

konstanten J A;X separiert sind. Dadurch liefert sie mit der Konnektivit at der

uber die Konstitution der Molek ule. Die Gr oe Kerne wichtige Informationen

einer Kopplungskonstante ist aber auch von der r aumlichen Anordnung der

Kerne abh angig 39, 400.

J-Kopplungskonstanten K onnen mit den Diederwinkeln uber die Karplus- 3

beziehung

J = A cos ² + B cos + C 1

korreliert werden. So korreliert die ³ J H ^N ,H -Kopplung in Aminos auren mit

dem R uckgrattorsionswinkel und wurde schon fr uhzeitig als Konforma-