III

Gliederung

1  Gegenstand der Bio- und Gentechnik  1

1.1  Biotechnik.  1

1.2  Gentechnik  2

1.3  Anwendungsgebiete biotechnologischer Verfahren (mit und ohne Gentechnik)  3

1.3.1  Biotechnik mit Mikroorganismen  3

1.3.2  Biotechnik mit Tieren und Tierzellen  4

1.3.3  Biotechnik mit Pflanzen und Pflanzenzellen.  5

2  Die genetische Information.  6

2.1  Speicherung der genetischen Information  6

2.1.1  Struktur  6

2.1.2  Prinzip der Informationsspeicherung  6

2.2  Realisierung der genetischen Information  7

2.2.1  Transkription  7

2.2.2  Translation  8

2.2.2.1  Der genetische Code  8

2.2.2.2  Vorgang der Translation.  9

2.2.3  Steuerung der Genaktivität.  10

3  Gentechnische Verfahren  11

3.1  Identifikation einer bestimmten DNS-Sequenz  11

3.2  Sequenzierung eines DNS-Abschnitts.  12

3.2.1  Herstellen definierter Bruchstücke mit Restriktionsendonucleasen.  12

3.2.2  Separierung der Bruchstücke und Sequenzierung.  12

3.3  DNS-Rekombinationstechnik mit Vektoren.  13

3.3.1  Vektoren für die Übertragung der Fremd-DNS.  13

3.3.1.1  Plasmide  14

3.3.1.1.1  Plasmide als Klonierungsvektoren in Bakterien.  14

3.3.1.1.2  Plasmide als Klonierungsvektor in Pflanzenzellen  15

3.3.1.2  Viren  16

3.3.1.2.1  Viren als Klonierungsvektoren in Bakterien  16

3.3.1.2.2  Viren als Klonierungsvektoren für tierische Zellen  17

IV

3.4  Erzeugung transgener Organismen mit Mikroinjektion.  17

3.4.1  DNA-Mikroinjektion  18

3.4.2  Mikroinjektion gentechnisch veränderter embryonaler Stammzellen  18

3.5  Zellhybridisierung (Zellfusion)  19

3.6  Gentechnik am Menschen.  19

3.6.1  Keimbahntherapie  20

3.6.2  Somatische Gentherapie.  21

3.6.2.1  Ex-vivo-Gentherapie  21

3.6.2.2  In-vivo-Gentherapie  21

3.6.2.3  Antisense-Therapie  21

A  Anhang.  A-1

A.1  Struktur der DNS/RNS  A-1

A.2  DNS-Doppelstrang  A-2

A.3  Transkription (schematisch)  A-3

A.4  tRNS (schematisch)  A-3

A.5  Translation  A-4

A.6  Identifikation eines DNS-Abschnitts  A-5

A.7  Restriktionsendonucleasen  A-6

A.8  Sequenzanalyse  A-7

A.9  DNS-Rekombinationstechnik (Überblick)  A-8

A.10  Plasmid pBR 322  A-9

A  11 Klonierung einer Phagen-DNS  A-10

Gegenstand der Bio- und Gentechnik 1

Biotechnologie wird heute als Schlüsseltechnologie ¹ oder auch Leitwissenschaft des 21. Jahrhunderts ² angesehen, obwohl sie ihren Ursprung in Verfahren hat, die sich der Mensch schon seit langem zunutze macht. So wurde bereits 3000 v. Chr. Essig und Alkohol mit Hilfe von Mikroorganismen hergestellt. Durch die Erkenntnis, daß an diesen Prozessen Mikroorganismen mitwirken, durch die Hinzuziehung anderer Wissenschaftsbereiche und der Entwicklung der Gentechnik konnte das Anwendungsfeld der Biotechnologie beträchtlich erweitert werden. Biotechnik (Biotechnologie) und Gentechnik (Gentechnologie) werden oftmals als Synonyme gebraucht, was jedoch nicht zutreffend ist ³ . Daher sollen im folgenden zunächst beide Begriffe definiert und eine Abgrenzung vorgenommen werden.

1.1 Biotechnik

Der Begriff Biotechnologie wurde erstmals von EREKY 1917 definiert als die Gesamtheit der Tätigkeitsbereiche, bei denen mit Hilfe von Lebewesen Produkte aus Rohmaterialien hergestellt werden ⁴ . Eine gewisse Erweiterung erfährt diese Definition durch die Möglichkeit des Aufbaus neuer Stoffe und die Spezifizierung der „Tätigkeitsbereiche“ als technische Verfahren; danach versteht man unter Biotechnik bzw. Biotechnologie technische Verfahren, in denen Mikrobenzellen, Pflanzenzellen oder Tierzellen Substanzen aufbauen, abbauen oder umbauen ⁵ . Ähnlich lautende Formulierungen beschreiben Biotechnik als den Einsatz biologischer Systeme im Rahmen technischer Prozesse und industrieller Produktion bzw. als den gezielten und bewußten Einsatz von biologischen Systemen (Mikroben, Pflanzenzellen, Tierzellen) und deren Bestandteilen im technologischen Prozeß ⁶ mit dem Ziel der Produktsynthese und Stoffumwandlung ⁷ . Der biotechnologische Prozeß besteht also zum einen aus den Stoffwechselvorgängen im Bioreaktor Zelle, zum anderen aus der Nutzung dieser Vorgänge im technischen Maßstab unter interdiszipinärem Zusammenwirken verschiedener Fachrichtungen ⁸ . Klassische biotechnologische Prozesse waren dem Menschen bereits vor 8000 Jahren bekannt. Zu diesen gehören (1) die alkoholische Gärung mit Hilfe von Hefezellen, (2) die Milchsäuregärung durch Bakterien so-

¹ SMITH S. V

² DÄB 1998, B-531

³ http://www.bll.de/gentechl/kap12str.htm

⁴ GLICK/PASTERNACK S. 7

⁵ SMITH S. 6

⁶ ZIMMERMANN http://132.187.96.115/projekte/biotech/grundlag/bio1.htm

⁷ WEIDE u.a. S. 15

⁸ SMITH S. 2, 7 f.

Gegenstand der Bio- und Gentechnik 2

wie (3) der Vorgang des Sauerwerdens unter dem Einfluß von Essigsäurebakterien ⁹ : (1) C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 (anaerob) 2 CH 3 ⋅CHOH⋅COOH (2) C 6 H 12 O 6 (anaerob) (3) C 2 H 5 OH + H 2 O + O 2 CH 3 COOH + 2 H 2 O

In der modernen Biotechnologie werden die Leistungen der biologischen Systeme durch deren Einsatz in technischen Systemen nutzbar gemacht. Dabei werden die Stoffwechselleistungen optimiert bzw. modifiziert und Mikroorganismen in Großkultur gehalten ¹⁰ . Die Modifizierung erfolgt durch Veränderungen der Regulationsmechanismen der Zelle mit dem Ziel, daß die gewünschte Substanz in einer über das Normalmaß hinausgehenden Menge produziert wird. Dies geschieht klassisch durch Mutation und chemische Veränderung der Zellumgebung oder der Zellmembran. Darüber hinaus stellt die Gentechnik der Biotechnik neue Werkzeuge und Verfahren zur Verfügung.

1.2 Gentechnik

Wie bereits ausgeführt, bedient sich die Biotechnologie der Erkenntnisse verschiedener Fachrichtungen, um den biotechnologischen Prozeß zu optimieren. Im Bereich der Produktion von Stoffen geht es dabei um die Züchtung solcher Kulturen, die den Stoff in möglichst großer Menge produzieren. Klassisch wird dies mit den Methoden der Stammselektion, Mutation und Kreuzung erreicht ¹¹ , die Gegens-tand der traditionellen Genetik sind. Diese Methoden sind dadurch gekennzeichnet, daß man nur durch Beobachtung des Phänotyps auf den Genotyp schließen kann (MENDELsche Gesetze). Aus der Erkenntnis, daß alle Leistungsmerkmale eines biologischen Systems strukturell, funktionell und im zeitlichen Ablauf Ausdruck der Erbinformation sind, ergab sich das Interesse, diese Erbinformationen zu analysieren und zu modifizieren, um in dem betreffenden Organismus gezielt eine gewünschte Eigenschaft zu verstärken (was sonst nur aufwendig durch die klassischen Verfahren möglich war) und ihm darüber hinaus auch neue Synthesefähigkeiten zu verleihen. So ist die Produktion von Insulin in Bakterien wie E. coli das Ergebnis der Aufklärung der genetischen Codierung der Insulinproduktion im Menschen einerseits und des Eingriffs in den genetischen Bestand des Bakteriums andererseits. Die dabei angewandten Methoden werden als gentechnische Verfahren bezeichnet, welche an späterer Stelle erläutert werden.

Allgemein ist Gentechnik zu definieren als die Gesamtheit der Methoden zur Charakterisierung und Isolierung des genetischen Materials, zur Bildung neuer Kombinationen sowie die Wiedereinführung

⁹ LIBBERT S. 159

¹⁰ PRIMROSE S. 14 f.; KORFF S. 390 Kap. 1.1

¹¹ SMITH S. 87

Gegenstand der Bio- und Gentechnik 3

des neu kombinierten Materials in einer anderen biologischen Umgebung ¹² . Im Ergebnis entsteht ein gentechnisch veränderter Organismus (GVO).

Somit ist festzustellen, daß Gentechnologie ein Instrument der Biotechnologie ist, mit dessen Hilfe die Erbinformation determiniert verändert wird. Alle Prozesse, durch welche eine Veränderung der genetischen Information nicht durch direkten Zugriff auf die Erbsubstanz erfolgt, gehören nicht zur Gentechnik. Dieser Unterscheidung folgt auch der Anwendungsbereich des GenTG in § 3 Nr. 3 GenTG auf dreierlei Weise:

♦ § 3 Nr. 3 S. 1: GVO ist gegeben, wenn genetisches Material in einer Weise verändert wird, wie es unter natürlichen Bedingungen nicht möglich ist (abstrakte Definition des GVO) ♦ § 3 Nr. 3 S. 2: beispielhafte ¹³ Aufzählung von Verfahren, die zu einem GVO führen ♦ § 3 Nr. 3 S. 3, 4: Aufzählung von Verfahren, die nicht zu einem GVO führen Die Beschränkung des Regelungsbereiches im GenTG auf GVO und die Strafbarkeit bei Veränderung des menschlichen Erbguts entsprechend der Bestimmungen des EschG zeigen, daß biotechnologische Arbeiten, die sich gentechnischer Methoden bedienen, eine besondere Problematik aufweisen. Daher soll nach einer kurzen Übersicht über biotechnologische Verfahren untersucht werden, was Gentechnik aus naturwissenschaftlicher Sicht ausmacht. Dazu werden zunächst die biologischen Grundlagen für die Speicherung und Realisierung der Erbinformation skizziert, sodann erfolgt eine Darstellung der gentechnischen Verfahren. Abschließend soll die Anwendung der Gentechnik auf den Menschen betrachtet werden.

1.3 Anwendungsgebiete biotechnologischer Verfahren (mit und ohne

Gentechnik)

1.3.1 Biotechnik mit Mikroorganismen

Zu den Verfahren, bei denen durch Mikroorganismen Stoffe auf- bzw. umgebaut werden, gehören:

¹² GenTG Einl. Rn 1

¹³ GenTG § 3 Rn 18

¹⁴ PRIMROSE S. 13

Gegenstand der Bio- und Gentechnik 4

Daneben ist auch der Mikroorganismus als Gesamtheit von Interesse:

1.3.2 Biotechnik mit Tieren und Tierzellen

Bei tierischen Organismen geht es zum einen um die biotechnologische Nutzung der einzelne Zelle in einer Zellkultur, zum anderen um die Modifikation des Gesamtorganismus, damit dieser eine bestimmte Eigenschaft mehr oder weníger ausprägt bzw. neu hinzugewinnt. Diese Veränderungen werden durch Modifikation der Erbanlagen erreicht, man spricht dann von transgenen Tieren.

¹⁵ PRIMROSE S. 86 f.

¹⁶ PRIMROSE S. 14, 89 f.

¹⁷ SMITH S. 129 ff.

¹⁸ PRIMROSE S. 100 f.; SMITH S. 136 f.

¹⁹ PRIMROSE S. 82

²⁰ PRIMROSE S. 83

²¹ PRIMROSE S. 79

²² PRIMROSE S. 80

Gegenstand der Bio- und Gentechnik 5

1.3.3 Biotechnik mit Pflanzen und Pflanzenzellen

Die Anwendung bio- und gentechnologischer Verfahren bei Pflanzen hat stets das Ziel, die Eigenschaft der gesamten Pflanze zu verändern. Dazu gehören die Ertragssteigerung bei Nutzpflanzen, Geschmacksverbesserung, Erhöhung des Proteingehaltes und Ausbildung von bestimmten Resistenzen.

²³ PRIMROSE S. 125

²⁴ PRIMROSE S. 125

²⁵ GLICK/PASTERNACK S. 398 ff.

²⁶ PRIMROSE S. 175 f.

²⁷ PRIMROSE S. 177 f.

²⁸ http://www.uni-giessen.de/nutriinfo/gen2.htm

Die genetische Information 6

2.1 Speicherung der genetischen Information

Seit 1944 ist durch die Arbeiten von AVERY, McLEOD und McCARTY ²⁹ bekannt, daß die genetische Information in jeder Zelle in der chemischen Struktur der Desoxyribonucleinsäure (DNS bzw. DNA) gespeichert ist. Diese befindet sich bei Prokaryoten (stets einzellig: Bakterien) im Kernäquivalent, bei Eukaryoten (einzellig: z.B. Pilze oder mehrzellig: Pflanzen, Tiere) im Zellkern. Bei Bakterien gibt es zusätzlich außerhalb des Kernäquivalents ringförmige DNS-Strukturen, die sogenannten Plasmide.

2.1.1 Struktur 30

DNS ist ein Makromolekül aus einzelnen Nucleotiden, die aus einem Zuckerbaustein (Pentose (Desoxyribose)), einer am 1‘-C-Atom befestigten Base und einem am 5‘-C-Atom befindlichen Phosphatrest bestehen. Die einzelnen Nucleotide sind über den Phosphatrest mit dem 3‘-C-Atom des nächsten Nucleotids verknüpft. In der DNS kommen 4 verschiedene Basen vor: Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und Cytosin (C). Die Sequenz dieser Basen ist der eigentliche Träger der genetischen Information. Ein Ausschnitt eines solchen Stranges ist in A.1 dargestellt. Wie WATSON und CRICK 1953 zeigten ³¹ , liegt die DNS in der Zelle als gewundener Doppelstrang (siehe dazu A.2) vor. Dabei bilden sich zwischen gegenüberliegenden Basen der einzelnen Stränge Wasserstoff-Brückenbindungen aus. Solche Paarungen können sich nur zwischen Adenin und Thymin (2 Wasserstoffbrücken) sowie zwischen Guanin und Cytosin (3 Wasserstoffbrücken) ausbilden (komplementäre Basenpaare). Somit sind die beiden Einzelstränge komplementär zueinander; kennt man die Basensequenz des einen Stranges, kann man nach dem Gesetz der komplementären Basenpaarung die Sequenz des anderen Stranges bestimmen.

2.1.2 Prinzip der Informationsspeicherung

Die Speicherung eines Merkmals auf der DNS wird als Gen bezeichnet. Ein Gen ist ein bestimmter Abschnitt auf der DNS, also eine bestimmte Sequenz der 4 Basen. Die Ausprägung eines Merkmals

²⁹ GLICK/PASTERNACK S. 9

³⁰ LÖFFLER/PETRIDES S. 150 ff.; LIBBERT S. 66 ff.

³¹ GLICK/PASTERNACK S. 9

Die genetische Information 7

heißt Allel. Der genspezifische DNS-Abschnitt trägt die Information für die Bildung eines bestimmten Proteins (Eiweißes) ³² . Proteine sind die für den Organismus struktur- und funktionsbestimmenden Stoffe. So gibt es sie als Strukturproteine, die für die Stabilität der Gewebe sorgen, als Transportproteine in Gestalt des Hämoglobins, als zentraler Bestandteil des Immunsystems (Immunglobuline), als Signalstoffe (z.B. das Hormon Insulin), als Biokatalysatoren in Gestalt der Enzyme und als bewegungsauslösende Strukturelemente der Muskelzellen. Zwischen den einzelnen Genen befinden sich sog. Spacer, dies sind DNS-Abschnitte, die keine Information tragen. Lediglich bei Eukaryoten und Viren treten innerhalb des Gens Abschnitte auf, die keine Information tragen (sog. Introns) ³³ . Die DNS des Menschen enthält etwa 3⋅10 ⁹ Basenpaare (Bp), auf der etwa 100000 Gene lokalisiert sind. Dabei weisen nur etwa 1% der Basenpaare Variabilitäten zwischen einzelnen Individuen auf ³⁴ . Große Anstrengungen werden unternommen, um die vollständige Basensequenz der DNS zu ermitteln. Bisher (Frühjahr 1998) sind etwa 170 Millionen Basenpaare bekannt, eine vollständige Sequenzierung des menschlichen Genoms soll bis 2005 abgeschlossen sein ³⁵ . Die Genome von Mikroorganismen, wie das von dem in der Gentechnik oft eingesetzten Bakterium E.coli, sind bereits vollständig bekannt ³⁶ .

2.2 Realisierung der genetischen Information

Wie bereits angedeutet, speichert die DNS die Information zur Proteinsynthese. Es muß also eine Umsetzung der Basensequenz der DNS, die das zu exprimierende Gen trägt, in eine Sequenz aus Aminosäuren, aus derer sich das Protein zusammensetzt, erfolgen.

2.2.1 Transkription 37

Zunächst wird von der DNS eine Kopie des entsprechenden Gens in Gestalt eines mRNS ³⁸ -Moleküls hergestellt. RNS ist ein einzelsträngiges Makromolekül, welches wie ein DNS-Strang aufgebaut ist, wobei zwei strukturelle Modifikationen erfolgen: Zum einen wird die Base Thymin durch die (in ihrer Funktion gleichwertige) Base Urazil (U) ersetzt, zum anderen wird der Zucker Desoxyribose durch Ribose ersetzt (siehe dazu die Darstellung in A.1) Die Transkription, d.h. die Umschreibung des DNS-Abschnitts in einen (neu zu bildenen) RNS-Strang, läuft folgendermaßen ab (vergleiche dazu die Darstellung in A.3)

³² LIBBERT S. 100; LÖFFLER/PETRIDES S. 161

³³ LIBBERT S. 100 f.

³⁴ BÄK DÄB 1998, C-1020

³⁵ ROPERS DÄB 1998, B-548

³⁶ ROPERS DÄB 1998, B-549

³⁷ LÖFFLER/PETRIDES S. 150 ff., 240 ff.; LIBBERT S. 195 ff.

³⁸ mRNS=messengerRibonucleinsäure