Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

Diese Dissertation ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB Bonn http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online elektronisch publiziert.

Tag der Promotion: 29.11.2004

„Je weiter sich das Wissen ausbreitet, desto mehr Probleme kommen zum Vorschein.“

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis   

1.  Einleitung  1

1.1.  Die ß-Laktam-Antibiotika  3

1.1.1.  Penicilline (Pename)  3

1.1.2.  Cephalosporine (Cepheme)  3

1.1.3.  Carbapeneme.  4

1.1.4.  Monobaktame.  4

1.1.5.  ß-Laktamase-Inhibitoren  4

1.2.  Wirkungsweise von ß-Laktam-Antibiotika.  5

1.2.1.  Der Aufbau der bakteriellen Zellwand.  5

1.2.2.  Die Angriffspunkte der ß-Laktam-Antibiotika  7

1.3.  ß-Laktamasen  10

1.3.1.  ß-Laktamasen der Gruppe 1  11

1.3.1.1.  Chromosomale, nicht induzierbare AmpC-ß-Laktamasen.  13

1.3.1.2.  Chromosomale, induzierbare AmpC-ß-Laktamasen.  13

1.3.1.3.  Plasmid-kodierte AmpC-ß-Laktamasen  13

1.3.2.  ß-Laktamasen der Gruppe 2  14

1.3.3.  ß-Laktamasen der Gruppen 3 und 4  16

1.4.  Regulation der ß-Laktamase-Expression  17

1.4.1.  Die ß-Laktamase-Expression bei C. freundii und E. cloacae  17

1.4.2.  Das AmpR-Protein  20

1.5.  Zielsetzung der Arbeit  21

2.  Material und Methoden  22

2.1.  Material  22

2.1.1.  Bakterienstämme.  22

2.1.2.  Enzyme.  23

2.1.3.  Plasmide  23

2.1.4.  Oligonukleotide.  25

2.1.5.  DNA- und Protein-Marker  26

2.1.6.  Chemikalien  27

2.1.7.  Nährmedien und Antibiotika.  27

2.1.8.  Häufig verwendete Puffer und Lösungen  28

Inhaltsverzeichnis

2.1.9.  Geräte und Verbrauchsmaterialien.  28

2.1.10.  Computer-Software  29

2.2.  Methoden.  29

2.2.1.  Mikrobiologische Methoden  29

2.2.1.1.  Anzucht von Bakterien.  29

2.2.1.2.  Herstellung CaCl 2 -kompetenter E. coli-Zellen  30

2.2.1.3.  Calciumchlorid-Transformation von E. coli-Zellen.  30

2.2.2.  Molekulargenetische Arbeiten  30

2.2.2.1.  Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli  30

2.2.2.1.1.  Plasmid-Schnellpräparation (GOODE UND FEINSTEIN, 1992)  30

2.2.2.2.  Agarose-Gelelektrophorese.  31

2.2.2.3.  Rückgewinnung von DNA aus Agarosegelen.  31

2.2.2.4.  Restriktion und Modifikation von DNA  32

2.2.2.5.  Sequenzanalyse von DNA.  32

2.2.2.6.  Amplifikation von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)  32

2.2.3.  Proteinchemische Methoden  33

2.2.3.1.  Expression des AmpR-Proteins als Fusionsprotein  33

2.2.3.2.  Expression des AmpR-Proteins ohne Fusionsanteile.  35

2.2.3.3.  Quantitative Proteinbestimmung nach BRADFORD (1976)  35

2.2.3.4.  Quantitative Proteinbestimmung mittels BCA-Assay.  35

2.2.3.5.  Quantitative Proteinbestimmung mittels UV-Photometrie  35

2.2.3.6.  Analyse von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese  

  (SDS-PAGE)  36

2.2.3.7.  Transfer von Proteinen auf Membrane („Western Blotting“)  37

2.2.3.8.  Isolierung von Inclusion Bodies.  38

2.2.3.9.  Aufreinigung des AmpR Proteins  39

2.2.3.9.1.  DNA-Affinitätschromatographie  39

2.2.3.9.2.  Heparin-Affinitätschromatographie  39

2.2.3.9.3.  Größenausschlußchromatographie (Gelfiltration)  40

2.2.3.10.  Aufreinigung des NusA-AmpR Fusionsproteins  40

2.2.3.10.1.  Metallchelat-Affinitätschromatographie  40

2.2.3.10.2.  Größenausschlusschromatographie (Gelfiltration)  41

2.2.3.10.3.  Thrombin-Spaltung von gereinigtem NusA/AmpR-Protein  41

2.2.3.10.4.  Separation von NusA und AmpR-Protein  42

Inhaltsverzeichnis

2.2.3.11.  Aktivitätstest von gereinigtem AmpR-Protein mittels Bandshift-Assay  

  (EMSA)  42

2.2.3.12.  Silberfärbung von Polyacrylamid-Gelen nach NESTERENKO et al.  43

2.2.4.  Isolierung von Muropeptiden  44

2.2.4.1.  Präparation eines „Hot water Extraktes“ (verändert nach JACOBS et al.,  

1994)...........................................................................................................................   44

2.2.4.2.  Auftrennung von löslichen Zellbestandteilen mittels HPLC  44

2.2.4.3.  Entsalzung von Muropeptiden mittels HPLC  45

2.2.4.4.  Massenspektrometrische Analyse der isolierten Muropeptide.  45

Analyse  von 3 H-markierten Muropeptiden im Flüssigkeitsszintillations-  

2.2.4.5.   

spektrometer   45

2.2.5.  Untersuchungen zur ß-Laktamase-Expression.  45

2.2.5.1.  Expressionsstudien mittels RT-PCR  45

2.2.5.1.1.  Synthese von mRNA durch In-vitro Transkription.  45

2.2.5.1.2.  Amplifikation von mRNA mittels RT-PCR.  46

2.2.5.2.  Expressionsstudien mittels Real-Time RT-PCR  47

2.2.5.3.  Durchführung von In-vivo Expressionsstudien  48

2.2.6.  Kristallisation von AmpR.  49

3.  Ergebnisse  50

3.1.  Expression und Reinigung verschiedener Varianten des AmpR-Proteins  50

3.1.1.  Expression und Reinigung des AmpR-Proteins aus C. freundii  51

3.1.2.  Expression und Reinigung eines NusA/AmpR-Fusionsproteins  55

3.2.  Isolation von Muropeptiden mittels HPLC  58

3.2.1.  Isolation des (1,6-anhydro)-MurNac-Tripeptids  60

3.2.2.  Isolation des (1,6-anhydro)-MurNac-Pentapeptids  61

3.3.  Expressionsanalysen der AmpC-ß-Laktamase.  63

3.3.1.  Detektion mittels RT-PCR  64

3.3.2.  Detektion mittels Real-Time RT-PCR  66

3.4.  Aufklärung der dreidimensionalen Struktur des AmpR-Proteins  70

4.  Diskussion  71

4.1.  Expressionsanalysen des ampC-ß-Laktamase-Gens  75

4.2.  Aufklärung der Kristallstruktur des AmpR-Proteins  83

5.  Zusammenfassung.  85

6.  Literaturverzeichnis  87

Inhaltsverzeichnis

7.  Anhang  99

7.1.  Abbildungsverzeichnis  99

7.2.  Tabellenverzeichnis.  101

7.3.  Abkürzungsverzeichnis  102

1. Einleitung

“It is time to close the book on infectious diseases.“ 1

William H. Stewart, US Surgeon General, 1967

“Our window of opportunity to help those impoverished by infectious diseases is closing.” 2

David L. Heymann, WHO Executive Director, 2000

Zwischen diesen Aussagen liegen ungefähr 30 Jahre, in denen die Resistenz von Bakterien gegenüber Antibiotika stark zugenommen hat. Immer noch sind akute Atemwegsinfektionen, insbesondere Pneumonien, die Haupttodesursache weltweit (HEYMANN, 2000). Seit der Entdeckung des Penicillins durch Sir Alexander Fleming 1928 war vor allem in den 1940er Jahren eine rasante Entwicklung neuer Antibiotika zu verzeichnen (AMYES, 2000). Darunter Streptomycin (1944), Chloramphenicol (1947), Chlortetracyclin (1948) und Erythromycin (1952). Heutzutage gibt es etwa sieben große Antibiotikaklassen, die an drei verschiedenen Angriffspunkten wirken (MUTSCHLER, 1996). Dies sind

• Hemmung der Zellwandsynthese, durch die Gruppen der Penicilline und Cephalosporine

• Blockade der Proteinbiosynthese, verursacht durch Aminoglykoside, Tetracycline und Makrolide

• Unterdrückung der Nukleinsäuresynthese, bewirkt durch Sulfonamide und (Flu-or)Chinolone

Zeitgleich mit der Entdeckung bzw. Weiterentwicklung von Wirkstoffen, entstanden Resistenzen gegen Antibiotika. Mutationen oder Gentransfer führten zu Bakterien, die nicht mehr mit den ursprünglich wirksamen Stoffen bekämpft werden konnten. Häufig weisen diese Erreger eine Multiresistenz gegenüber verschiedenster Antibiotika auf. Als besonders gefährlich

¹ „Es ist an der Zeit, das Kapitel Infektionskrankheiten abzuschließen“. (PATLAK, 1996)

² „Das Spektrum der Möglichkeiten, Infektionskranken zu helfen, verkleinert sich zunehmend.“ (HEYMANN, 2000)

1

gelten heute beispielsweise Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) und Vancomycinresistente Enterokokken (VRE). Abbildung 1 zeigt den Anstieg von MRSA in britischen Krankenhäusern in den Jahren 1987 bis 1997.

Generell hat die Häufigkeit von Resistenzen gegenüber Antibiotika bei fast allen wichtigen bakteriellen Infektionserregern weltweit zugenommen (BAQUERO, 1996). Auch in Deutschland ist ein Anstieg zu verzeichnen. So ist z.B. zwischen 1998 und 2001 eine Resistenzzunahme von E. coli gegenüber Ciprofloxacin (Fluorchinolon) von 7,7 auf 14,5 % ermittelt worden. Die Resistenzraten von E. coli gegenüber Ampicillin stiegen von 40 auf 50 % (PEG, 2001).

Eine der Hauptursachen für die Entstehung von Resistenzen ist der falsche Umgang mit Antibiotika. Darunter fallen unnötige oder falsche Verschreibun-

gen, falsche Anwendung und unkontrollierte Erwerbsmöglichkeiten. Auch der intensive Gebrauch von Antibiotika in Krankenhäusern fördert die Resistenzentwicklung (WHO, 2000). Die Möglichkeit innerhalb kürzester an jeden beliebigen Ort der Welt zu reisen führt zu einer unaufhaltsamen Verbreitung der resistenten Erreger (HEYMANN, 2000). Infektionen mit resistenten Bakterien erfordern meist zusätzliche Untersuchungen und Be-handlungen des Patienten. Das normalerweise angewandte sog. „first-line“-Antibiotikum ist bei solchen Infektionen erfolglos. Für eine Heilung müssen teurere Wirkstoffe eingesetzt werden, stationäre Aufenthalte verlängern sich (COAST et al., 1998). Die Folge sind deutlich höhere Kosten für die Gesundheitssysteme. In den USA wurden die zusätzlichen Kosten auf-grund multiresistenter Keime auf jährlich vier Milliarden Dollar geschätzt (AMERICAN SOCIETY OF MICROBIOLOGY, 1995).

Eine Eindämmung des Resistenzproblems ist kaum abzusehen. Seit 1970 wurden keine neuen Antibiotikaklassen mehr entwickelt (WHO, 2000). Erst die Zulassung von Linezolid, als erster Vertreter der Oxazolidinone, im Jahr 2001 erweckt die Hoffnung multiresistente, grampositive Erreger auch zukünftig effektiv bekämpfen zu können (HALLE et al., 2002). Bei Infektionen mit gramnegativen Bakterien werden nach wie vor hauptsächlich ß-Laktam-Antibiotika (Penicilline, Cephalosporine) angewandt.

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1.1. Die ß-Laktam-Antibiotika

Das erste ß-Laktam-Antibiotikum - Penicillin - wurde zwar schon 1928 von Fleming entdeckt, konnte aber erstmals 1940 in der klinischen Therapie eingesetzt werden. In der folgenden Zeit wurden eine Vielzahl weiterer Moleküle mit ähnlicher Struktur entwickelt (LIVERMORE UND WILLIAMS, 1996). Der wichtigste und namensgebende Strukturbestandteil, der ß-Laktam-Ring, ist der Grundbaustein aller Substanzen. Durch Derivatisierung des Penicillins wurden bis heute vier unterschiedliche Klassen von ß-Laktam-Antibiotika hergestellt (MUTSCHLER, 1996).

1.1.1. Penicilline (Pename)

Das Grundgerüst der Penicilline bildet die 6-Aminopenicil-

lansäure (6-APA), ein bicyclisches Dipeptid aus Cystein und Valin (siehe Abb. 2). Durch Amidierung der Aminogruppe mit verschiedenen Carbonsäuren entstanden zahlreiche Derivate (KLEIN UND FINLAND, 1963). Von den natürlichen Penicillinen hat nur das Benzylpenicillin (Penicillin

G) aus Penicillum notatum eine klinische Bedeutung (MUTSCHLER, 1996). Die Arbeiten von SHEEHAN UND HENERY-LOGAN und BATCHELOR et al. ermöglichten die großtechnische Herstellung von 6-APA (BATCHELOR et al., 1959; SHEEHAN UND HENERY-LOGAN, 1959). Ausgehend davon erfolgte die Synthese sog. Breitspektrum-Penicilline, die im Gegensatz zu Benzylpenicillin auch gegen gramnegative Erreger eingesetzt werden können (ROEMPP, 1995). Darunter fallen die Aminopenicilline (u.a. Ampicillin, Amoxicillin), die Acylaminopenicilline (u.a. Piperacillin) und die Carboxypenicilline (u.a. Carbenicillin, Ticarcillin).

1.1.2. Cephalosporine (Cepheme)

Ursprungssubstanz der Cephalosporine ist Cephalosporin C,

das aus dem Pilz Acremonium chrysogenum gewonnen werden konnte (ROEMPP, 1995). Grundgerüst dieses Moleküls ist die 7-Aminocephalosporansäure. Der Grund für die Entwicklung der Cephalosporine waren ß-Lactamase-produzierende Staphylokokken in den 1950er Jahren, die gegen die Penicilli-

ne resistent waren (LIVERMORE UND WILLIAMS, 1996). Die synthetisierten Derivate von Ce-

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phalosporin C sind deutlich wirksamer als ihr Vorgänger, da sie ein breiteres Spektrum abdecken und eine höhere Laktamasestabilität aufweisen (MUTSCHLER, 1996). Die Cephalosporine können nach unterschiedlichen Aspekten gruppiert werden, häufig wird eine Einteilung nach dem Entwicklungszeitraum vorgenommen. Cephazolin und Cefazedon gehören beispielsweise zu den Basiscephalosporinen. Ab 1971 wurde aufgrund von Resistenzen die zweite Generation (u.a. Cefotiam, Cefamandol, Cefuroxim) eingeführt. Die dritte Generation (ab 1980) umfasst u.a. die Substanzen Cefoxitin und Cefotetan. Cefotaxim, Ceftriaxon und Cefepim gehören zu der neusten Generation, den Breitspektrum-Cephalosporinen.

1.1.3. Carbapeneme

Die Struktur der Carbapeneme ähnelt der der Penicilline. Allerdings

ist der Schwefel des Fünfrings durch ein Kohlenstoffatom ersetzt und eine Doppelbindung vorhanden (siehe Abb. 4). Das Molekül basiert auf Thienamycin, einem Naturstoff aus Streptomyces cattleya, der allerdings sehr instabil ist (LIVERMORE UND WILLIAMS, 1996). Bisher konnten daher auch nur wenige Carbapeneme entwickelt werden, die sich für den klinischen Einsatz eignen. Dies sind z.B. Imipenem (KROPP et al., 1980) und Meropenem (EDWARDS et al., 1989). Die Carbapeneme besitzen allerdings das breiteste Wirkungsspektrum aller ß-Laktam-Antibiotika (MOELLERING et al., 1989).

1.1.4. Monobaktame

Monobaktame sind monocyclische ß-Laktam-Antibiotika (siehe

Abb. 5). Die einzige klinische relevante Substanz ist das Aztreonam, das 1985 zugelassen wurde (SYKES UND BONNER, 1985). Die Wirkung von Aztreonam beschränkt sich auf gram-

negative Infektionserreger und beruht insbesondere auf der Bindung an PBP3. (LIVERMORE UND WILLIAMS, 1996).

1.1.5. ß-Laktamase-Inhibitoren

Die Wirksamkeit von ß-Laktam-Antibiotika kann durch die simultane Gabe von ß-Laktamase-Inhibitoren erhöht werden. Bislang sind drei Substanzen klinisch relevant. Dies sind Sulbactam und Tazobactam (Penicillinsäure-Sulfone) und Clavulansäure (MUTSCHLER,

4

1996). Kommerziell vertrieben werden Kombinationen aus Clavulansäure und Amoxicillin bzw. Ticarcillin, desweiteren auch Sulbactam mit Ampicillin und Tazobactam mit Piperacillin (LIVERMORE UND WILLIAMS, 1996).

1.2. Wirkungsweise von ß-Laktam-Antibiotika

Die Zielstruktur der ß-Laktam-Antibiotika ist die bakterielle Zellwand. Das Fehlen einer solchen Struktur in eukaryotischen Organismen macht die ß-Laktame zu einem Antibiotikum mit sehr geringen Nebenwirkungen (MUTSCHLER, 1996).

1.2.1. Der Aufbau der bakteriellen Zellwand

Bakterien werden je nach Beschaffenheit ihrer Zellwand in zwei unterschiedliche Klassen eingeteilt. Dies sind einerseits die grampositiven Bakterien, deren Zellwand sich aus der Cytoplasma-Membran und einer dicken Schicht Peptidoglykan zusammensetzt, und andererseits die gramnegativen Bakterien. Bei diesen besteht die Zellwand aus einer dünnen Lage Peptidoglykan, die sich zwischen der äußeren und

der Cytoplasma-Membran befindet (siehe Abb. 6). Das Peptidoglykan (Murein) ist ein verzweigtes Heteropolymer, das die Cytoplasma-Membran sackförmig umgibt und der Zelle Stabilität verleiht. Die äußere Membran ist über Lipoproteine mit dem Mureinsacculus kovalent verankert (BRAUN ^UND REHN, 1969). Aufgebaut ist das Murein aus langen Ketten der Aminosaccharide N-Acetyl-Glucosamin (GlcNac) und N-Acetyl-Muraminsäure (MurNac),

die alternierend über eine ß-1,4-glykosidische Bindung miteinander verknüpft sind. Diese Polysac-

charidketten sind über die Carbonsäure der Muraminsäure durch kurze Peptidbrücken quervernetzt. Die Peptide variieren je nach Bakterienart. Bei gramnegativen Bakterien sind meist die Aminosäuren L-Alanin, D-Glutaminsäure, meso-Diaminopimelinsäure und D-Alanin Be-standteil der Peptidseitenketten. Die Diaminopimelinsäure ist die Voraussetzung für die Bildung der quervernetzenden Peptidbindung. Die freie Aminogruppe der Diaminopimelinsäure bindet dabei, unter Abspaltung des terminalen D-Alanins, an die freie Carboxylgruppe des D-

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Alanins im benachbarten Strang (siehe Abb. 7). Seltener sind auch zwei Diaminopimelinsäure-Moleküle miteinander verknüpft (GLAUNER et al., 1988). Durch Zellwachstum und -teilung unterliegt der Mureinsacculus einer ständigen Veränderung. Eine permanente Neusynthese, aber auch der Abbau von Murein trägt dem Rechnung. Pro Generation werden ca. 50 % des Peptidoglykan-Materials freigesetzt und größtenteils wiederverwertet (GOODELL, 1985). Nur ein geringer Teil (6 - 8 %) geht dabei in das Medium verloren (GOODELL UND SCHWARZ, 1985).

Abbildung 7: Synthese und Abbau des Peptidoglykans gramnegativer Bakterien, aus TEMPLIN UND HOLTJE, 2000. ^{Angriffsorte Murein-abbauender Enzyme sind durch Pfeile gekennzeichnet: 1) N-Acetylglucosaminidase, 2) Muramidase, 3) Muramyl-L-Alanyl Amidase, 4) Glutamyl-Diaminopimelinyl Endopeptidase, 5) L,D-Carboxypeptidase, 6) D,D-Endopeptidase, 7) D,D-Carboxypeptidase (A} 2 pm = Diaminopimelinsäure).

Den Ausgangspunkt für die Mureinsynthese bildet ein UDP-aktiviertes N-Acetyl-Muraminsäure-Pentapeptid. Dieses wird auf den Lipidcarrier Bactoprenol übertragen und ergibt damit das sogenannte Lipid I. An der Cytoplasma-Membran entsteht über eine 1,4-ßglykosidische Bindung mit einem UDP-GlcNac-Molekül das Lipid II (HIGASHI et al., 1967). Der entstandene Mureinbaustein wird durch die Membran transportiert und im Periplasma freigesetzt. Der genaue Ablauf dieses Vorgangs ist bislang unklar (VAN HEIJENOORT, 1998). Im Periplasma erfolgt, unter Abspaltung des Trägermoleküls, der Einbau in das bestehende Peptidoglykangerüst durch die Bildung von Peptid- und Glykosidbindungen (siehe Abb. 7).

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Der Auf- und Abbau des Mureins erfordert eine Vielzahl von Enzymen, die als Zielstrukturen von ß-Laktam-Antibiotika identifiziert wurden (SPRATT, 1977).

1.2.2. Die Angriffspunkte der ß-Laktam-Antibiotika

Transglykosylasen katalysieren die ß-1,4-glykosidische Bindung zur Verlängerung der Polysaccharid-Kette, Transpeptidasen erzeugen die quervernetzenden Peptidbrücken. Neben diesen beiden Einzeltypen existieren auch bifunktionale Enzyme, die sowohl Transpeptidase- als auch Transglykosylase-Aktivität aufweisen (ISHINO et al., 1980; NAKAGAWA et al., 1979; SCHIFFER UND HOLTJE, 1999). Sämtliche Mureinsynthasen, die eine Transpeptidase-Aktivität aufweisen, sind die Zielstrukturen der Penicilline. Daher werden sie auch als Penicillin-Binde-Proteine (PBP) bezeichnet. Tabelle 1 gibt die Mureinsynthasen von E. coli wieder. Alle Enzyme sind in der Cytoplasma-Membran lokalisiert, während das aktive Zentrum in das Periplasma ragt.

Gen Enzym MG (kDa) Referenz

Transglykosylase/Transpeptidase (PBP1a) 94,5 (ISHINO et al., 1980) ponA

Transglykosylase/Transpeptidase (PBP1b) 94,3 (NAKAGAWA et al., 1979) ponB

Transglykosylase/Transpeptidase (PBP1c) 85,1 (SCHIFFER UND HOLTJE, 1999) pbpC

Transpeptidase (PBP2) 70,8 (ASOH et al., 1986) pbpA

Transpeptidase (PBP3) 63,9 (NAKAMURA et al., 1983) ftsI

Monofunktionale Glykosyltransferase 27,3 (DI BERARDINO et al., 1996) mgt

Tabelle 1: Mureinsynthasen von E. coli (HOLTJE, 1998).

Die (hochmolekularen) Penicillin-Binde-Proteine (1a, 1b, 1c, 2 und 3) sind für die Zellwandsynthese von zentraler Bedeutung. Wird sowohl PBP1a als auch PBP1b deletiert, hat dies eine letale Wirkung auf die Zelle (SUZUKI et al., 1978). PBP1c ist trotz Sequenzhomologien zu PBP1a und 1b nicht in der Lage, den Verlust dieser zu kompensieren. Möglicherweise fungiert PBP1c in vivo nur als Transglykosylase (SCHIFFER UND HOLTJE, 1999). Der Verlust von PBP2 und PBP3 ist nicht letal, hat jedoch phänotypische Auswirkungen (Spheren- bzw. Filamentbildung).

Die Bildung der Peptidbrücken ist mehrheitlich (93 %) eine D,D-Transpeptidase-Reaktion (GLAUNER et al., 1988). Dabei wird zuerst die D-Ala-D-Ala-Bindung des Pentapeptids aufgebrochen und, unter Alanin-Abspaltung, ein intermediärer Enzym-Substrat-Komplex gebildet. Der ß-Laktam-Ring des Penicillins weist eine Strukturanalogie zu der D-Ala-D-Ala-Bindung

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auf. In Gegenwart von Penicillinen kommt es daher zur Bildung eines Penicilloyl-Enzym-Intermediats. In einem zweiten Schritt wird das gebundene Substrat auf eine Aminogruppe der Diaminopimelinsäure eines zweiten Mureinpeptids übertragen (siehe Abb. 8). Ist

jedoch ein Penicillin-Rest an das Enzym gebunden, kann dieser nicht übertragen werden und bleibt dauerhaft im aktiven Zentrum der Transpeptidase (WAXMAN ^UND STROMINGER, 1983). Weitere Transpeptidase-Reaktionen sind damit inhibiert. Eine kleinere Anzahl der Peptidbrücken wird durch eine L,D-Transpeptidase-Reaktion gebildet (GLAUNER et al., 1988). Diese Reaktion zwischen zwei Diaminopimelinsäure-Molekülen wird nicht durch Penicilline beeinflusst. Das katalysierende Enzym ist noch nicht bekannt. Die D-Ala-D-Ala-Bindung ist auch ein Substrat für D,D-Carboxypeptidasen, die das endständige Alanin abspalten. Diese Reaktion reguliert die Quervernetzung und wird ebenfalls durch Penicilline gehemmt (IZAKI et al., 1966).

ß-Laktam-Antibiotika hemmen nicht nur die Mureinsynthese, sondern auch dessen Abbau. Für Wachstum und Teilung ist allerdings ein Öffnen des Mureinsacculus unbedingt notwendig (HOLTJE UND TUOMANEN, 1991). Für jede, bei der Synthese gebildete, kovalente Bindung besitzt E. coli daher mindestens eine Mureinhydrolase (siehe Abb. 7). Teilweise dient diesen Enzymen das hochmolekulare Peptidoglykan als Substrat, teilweise werden aber auch nur dessen Metabolite von den Enzymen umgesetzt. Ein Teil der Mureinhydrolasen wird durch ß-Laktam-Antibiotika gehemmt. Eine Übersicht über die nicht-cytoplasmatischen Mureinhydrolasen von E. coli gibt Tabelle 2. Im Cytoplasma befinden sich die ß-N-Acetylglucosaminidase (NagZ) und AmpD, eine N-Acetylanhydromuramyl-L-Alanin Amidase (vgl. Kapitel 1.4.).

Die physiologische Rolle der niedermolekularen Penicillin-Binde-Proteine (PBP4, 5, 6, 7 und 8) ist nicht eindeutig geklärt. Obwohl sie die Reifung und Öffnung des Mureins katalysieren,

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D,D-Carboxypeptidasen

Lytische Transglykosylasen

Amidasen

Tabelle 2: Mureinhydrolasen von E. coli, nach HOLTJE, 1998. Slt = Soluble lytic transglycosylase, Mlt = Membrane-bound lytic transglycosylase, Emt = Endospecific membrane-bound lytic transglycosylase.

sind sie für die Bakterienzelle nicht essentiell (HENDERSON et al., 1997). Daher ist der lytische Effekt, den ß-Laktam-Antibiotika auf die Zellen ausüben, mit der Bindung an die hochmolekularen Penicillin-Binde-Proteine (1a-c, 2 und 3) in Beziehung zu setzen. Eine Hemmung dieser Proteine stoppt allerdings nur die Neusynthese des Peptidoglykans. Für die anschließende Lyse der Zellen sind insbesondere die lytischen Transglykosylasen verant-wortlich (TOMASZ, 1974).

Diese Lysozym-ähnlichen Proteine spalten die ß-1,4-glykosidische Bindung zwischen Muraminsäure und N-Acetyl-Glucosamin. Anders als bei Lysozym wird der Glykosylrest aber nicht auf Wasser, sondern auf die C6-Hydroxyl-Gruppe der Muraminsäure übertragen (THUNNISSEN et al., 1995). Dadurch entsteht eine 1,6-Anhydro-Bindung an der Muraminsäu-

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re. Da diese Mureinmetabolite (sog. Muropeptide) wieder in ins Cytoplasma aufgenommen und verwertet werden, ermöglicht dies eventuell die Unterscheidung zwischen Mureinabbauprodukten und -vorläufermolekülen. Die meisten Mureinhydrolasen sind potentielle Autolysine und müssen daher sehr wirksam kontrolliert werden. Interaktionsstudien ergaben eine direkte Wechselwirkung zwischen den Mureinsynthasen und -hydrolasen (VOLLMER et al., 1999). Man geht daher davon aus, dass der Mureinumsatz, ähnlich wie die DNA-Replikation, in einem Multienzymkomplex (Holoenzym) stattfindet (HOLTJE, 1996). Tatsächlich konnte ein Komplex aus einer Transglykosylase/Transpeptidase und einer lytischen Transglykosylase in Gegenwart eines spezifischen Strukturproteins in-vitro rekonstituiert werden (TEMPLIN ^UND HOLTJE, 2000).

1.3. ß-Laktamasen

Wie anfangs bereits beschrieben, stellt die Resistenz gegen ß-Laktam-Antibiotika ein großes Problem dar. Insbesondere in Krankenhäusern verlieren mehr und mehr Erreger die Empfindlicheit gegenüber diesen Wirkstoffen, was eine verlangsamte Genesung oder sogar den Tod zur Folge haben kann.

Prinzipiell existieren drei unterschiedliche Mechanismen, die eine Resistenz gegen ß-Laktame verursachen (NEU, 1992). Dies sind:

• Veränderungen in der Membran, die verhindern, dass das Antibiotikum die Penicillin-Binde-Proteine erreicht (JAFFE et al., 1982; LI et al., 1994).

• Veränderungen an den Penicillin-Binde-Proteinen selbst, die diese unempfindlich gegen ß-Laktame machen (SPRATT, 1994).

• Produktion von ß-Laktam-spaltenden Enzymen, den ß-Laktamasen (SEEBERG et al., 1983).

Die ersten beiden Mechanismen spielen klinisch nur eine untergeordnete Rolle. Relevanz erlangen sie allenfalls sofern sie in Verbindung mit der Produktion von ß-Laktamasen auftreten (PIDDOCK UND GRIGGS, 1991).

Die ß-Laktamasen sind die wichtigste und häufigste Ursache von Resistenzerscheinungen (LIVERMORE, 1995). Durch die Spaltung des ß-Laktam-Rings inaktivieren sie die Antibiotika bevor diese stabile Serinester mit den PBP ausbilden.

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Seit der Einführung des Penicillins 1940 und nahezu gleichzeitigem Auftreten der ersten Resistenzen (Staphylococcus aureus; KIRBY, 1944), wurden eine Vielzahl von ß-Laktamasen entdeckt und erforscht. 2001 waren mindestens 340 verschiedene ß-Laktamasen bekannt, die aus klinischen Isolaten stammten (BUSH, 2001). Da die Techniken zur Identifizierung solcher Proteine immer einfacher und schneller wird, ist davon auszugehen, dass diese Zahl noch um einiges steigen wird.

Ambler schlug deshalb 1980 eine Klassifizierung der Enzyme nach ihrer Aminosäuresequenz vor. Daraus entwickelten sich die sog. Ambler-Klassen A - D (AMBLER, 1980). Aufgrund der klinischen Relevanz der ß-Laktamasen ist es aber von großer Wichtigkeit, deren Substratprofil zu kennen, um ein geeignetes Antibiotikum auszuwählen. Heutzutage wird daher mehr auf die Klassifizierung von Bush, Jacoby und Medeiros zurückgegriffen (BUSH et al., 1995). Diese teilt die Enzyme nach ihrem Substratprofil und ihrer Empfindlichkeit gegenüber ß-Laktamase-Inhibitoren ein (siehe Tabelle 3). Allerdings ergeben sich teilweise große Ähnlichkeiten zwischen Amblers molekularen Klassen und den Hauptgruppen von Bush. In nahezu allen Gruppen stieg die Anzahl der beschriebenen ß-Laktamasen zwischen 1995 und 2000. Dennoch sind - zumindest noch - nicht alle Enzyme auch klinisch relevant. Im folgenden soll ein kurzer Überblick über die einzelnen Gruppen gegeben werden.

1.3.1. ß-Laktamasen der Gruppe 1

Die Laktamasen der Gruppe 1 entsprechen als einzige der Ambler-Klasse C. Hauptvertreter dieser Gruppe sind die AmpC-ß-Laktamasen. Sie hydrolysieren sämtliche ß-Laktam-Antibiotika außer den Cephalosporinen Cefepim und Cefpirom und den Carbapenemen. Allerdings müssen sie dazu in ausreichender Menge produziert werden (LIVERMORE, 1998). ß-Laktamase-Inhibitoren zeigen bei dieser Gruppe keine Wirkung. Durch ihre weite Verbreitung in gramnegativen Erregern besitzen diese Enzyme eine hohe klinische Relevanz. In Verbindung mit akquirierten Carbapenemasen oder einer Verminderung der Membranpermeabilität, führen die AmpC-Enzyme zu breiten Resistenzspektren und wenig Therapieoptionen (BORNET et al., 2000; PIDDOCK UND GRIGGS, 1991).

Die AmpC-ß-Laktamasen können entweder chromosomal oder auf einem Plasmid kodiert sein. Bei den chromosomalen Enzymen wird weiter in induzierbare und nicht-induzierbare unterschieden.

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1.3.1.1. Chromosomale, nicht induzierbare AmpC-ß-Laktamasen

Die gramnegativen Bakterien E. coli und Shigella spp. besitzen eine chromosomale, jedoch nicht-induzierbare AmpC-ß-Laktamase. Das Gen wird konstitutiv, aber so schwach exprimiert, dass keine klinischen Resistenz-Werte erreicht werden. Die Ursache der niedrigen Expressionsraten ist der schwache Promoter des ampC-Gens (JAURIN et al., 1981; OLSSON et al., 1983). Mutationen im Promoterbereich oder der Attenuatorsequenz des Gens, können zu einer vielfach stärkeren Laktamase-Expression führen. Um klinische Resistenz zu vermitteln müssen jedoch mehrere Basen gleichzeitig verändert sein (WIEGAND, 2003).

1.3.1.2. Chromosomale, induzierbare AmpC-ß-Laktamasen

Bei einer Vielzahl von gramnegativen Bakterien (u.a. E. cloacae, C. freundii, S. marcescens, M. morganii und Y. enterocolitica) wird die Expression der AmpC-Laktamase erst durch ein Induktionssignal aktiviert. Die Transkription unterliegt einem komplexen Regulationsmechanismus, in den eine Reihe weiterer Enzyme involviert sind. Bei einigen Spezies ist dieser Mechanismus annähernd vollständig aufgeklärt, bei anderen sind noch wesentliche Elemente unklar (JACOBS et al., 1997; POIREL et al., 1999; WESTPHAL, 2003). Auf die Regulation der ß-Laktamase-Expression bei C. freundii und E. cloacae wird später noch genauer eingegangen (siehe Kap. 1.4.). Auch bei diesen ß-Laktamasen können Mutationen zu einer stabilen Überproduktion führen. Die Mutationsfrequenz liegt mit 10 ^-4 bis 10 ^-7 allerdings deutlich höher als bei nicht-induzierbaren Enzymen (KORFMANN UND WIEDEMANN, 1988). Die Ursache liegt häufig in einer Mutation der N-Acetylanhydromuramyl-L-Alanin Amidase (AmpD). Dabei gibt es zahlreiche Möglichkeiten, die zum Funktionsverlust des Proteins und einer daraus resultierenden Laktamase-Überexpression führen können (PETROSINO et al., 2002).

1.3.1.3. Plasmid-kodierte AmpC-ß-Laktamasen

Seit 1989 die erste Plasmid-kodierte AmpC-ß-Laktamase beschrieben wurde, sind eine Vielzahl weiterer Isolate mit entsprechenden Plasmiden gefunden worden (PHILIPPON et al., 2002). Die Benennung erfolgte dabei nach Kriterien wie Substrat, Name des Patienten oder Name des Krankenhauses (WIEGAND, 2003). Das ampC-Gen, das phylogenetisch von dem chromosomalen Gen abstammt, ist nun auf übertragbaren Plasmiden lokalisiert. Diese Plasmide finden sich zunehmend in Organismen wie Klebsiella spp. und Salmonella spp. wieder, die ursprünglich keine AmpC-ß-Laktamase besitzen (HANSON, 2003). Häufig werden diese

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Laktamasen in großer Menge exprimiert und führen zu signifikanten Veränderungen in der Empfindlichkeit des Wirtsstammes (PHILIPPON et al., 2002). Die Ursache für die hohen Expressionsraten sind möglicherweise Promoter-Mutationen während der Rekombination (HANSON, 2003). Bisher ist der Anteil klinischer Isolate mit Plasmid-kodierter AmpC-ß-Laktamase noch sehr gering (COUDRON et al., 2000; DUNNE et al., 2000). Die schwierige Identifikation bzw. die hohe Verwechslungsgefahr mit ESBL-produzierenden Erregern, führt bereits heute zu einer klinischen Relevanz dieser Laktamase-Gruppe.

1.3.2. ß-Laktamasen der Gruppe 2

Die Gruppe 2 der Bush-Einteilung ist weitgefächert und enthält eine Vielzahl unterschiedlicher Enzyme, die in Untergruppen aufgeteilt sind. Die meisten dieser Gruppen sind oder werden zunehmend klinisch relevant. Lediglich die Untergruppen 2c, 2e, 2f sind bisher noch von geringer Bedeutung (WIEGAND, 2003).

In die Gruppe 2a fallen ß-Laktamasen, die Penicilline hydrolysieren und nicht durch Clavulansäure hemmbar sind. Bedeutung erlangt diese Gruppe vor allem wegen der BlaZ-Laktamasen von S. aureus, die das erstmalige Resistenzauftreten gegenüber Benzylpenicillin vermittelten. Damals waren bereits ca. 5 % der S. aureus-Isolate resistent (KIRBY, 1945). Da dieses Enzym Plasmid-kodiert ist, wurde es durch Konjugation weiterverteilt. Dies und die Selektion resistenter Stämme führten schon 1984 zu einer Resistenzrate von 80 - 90 % (LACEY, 1984).

Gruppe 2b beinhaltet die sog. Breitspektrum-ß-Laktamasen. Diese besitzen die Fähigkeit die meisten Penicilline und Cephalosporine der ersten und zweiten Generation zu hydolysieren. Diese Laktamasen werden durch ß-Laktamase-Inhibitoren gehemmt. Aufgrund ihrer weiten Verbreitung spielen vor allem TEM-1 und SHV-1-Enzyme eine klinische Rolle. So besitzen mittlerweile weltweit ungefähr 50 % der E. coli-Isolate eine TEM-1 Laktamase (LIVERMORE, 1995). Da es sich um ein Plasmid-kodiertes Enzym handelt, wurde es mittlerweile auf verschiedene andere gramnegative Spezies übertragen. Beispiele sind Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae und Vibrio cholerae (LIVERMORE, 1998). Auch die SHV-1 Laktamase, die ursprünglich nur chromosomal in Klebsiella spp. vorkam, ist mittlerweile auf Plasmiden kodiert und vielfach übertragen worden (CHAVES et al., 2001; HAEGGMAN et al., 1997). Durch Mutationen der Laktamasen in Gruppe 2b entstanden Enzyme mit neuen, zusätzlichen

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